組蛋白八聚體的裝配及熒光標(biāo)記檢測(cè)體外組裝核小體的效率

劉媛　張鳳慧　趙宏宇

摘要：基于影響核小體定位的DNA序列TA 10-bp周期性和R5Y5序列模體，設(shè)計(jì)6條對(duì)組蛋白親和性不同的DNA序列，將其克隆到重組質(zhì)粒中，分別命名為CS1～CS6。通過PCR擴(kuò)增的方法，在引物上標(biāo)記Cy3熒光信號(hào)分子，獲得大量標(biāo)有Cy3的目的序列；同時(shí)，從大腸桿菌中表達(dá)純化了H2A、H2B、H3、H4共4種組蛋白，經(jīng)復(fù)性裝配成組蛋白八聚體，利用鹽透析法將目的DNA序列與組蛋白八聚體組裝成核小體結(jié)構(gòu)；經(jīng)熒光信號(hào)檢測(cè)，分析6條目的序列形成核小體的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CS2、CS3形成核小體的能力較強(qiáng)，該結(jié)果與Trifonov EN提出的核小體在該模體上的精確定位基本吻合，該試驗(yàn)方法的建立對(duì)核小體結(jié)構(gòu)及相關(guān)表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究具有一定的意義。

關(guān)鍵詞：核小體；組蛋白；熒光標(biāo)記；序列模體；體外組裝；定位

中圖分類號(hào)： Q71文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0012-05

表觀遺傳是后基因組時(shí)代的研究熱點(diǎn)，其中核小體定位是重要的研究領(lǐng)域之一。它在真核生物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA復(fù)制和修復(fù)等過程中扮演著至關(guān)重要的角色[1]?？茖W(xué)家們經(jīng)過大量的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在所有對(duì)核小體定位有影響的因素中，DNA序列扮演著關(guān)鍵的角色[2]。近年來，有大量關(guān)于核小體定位的理論分析和預(yù)測(cè)，但大多沒有進(jìn)行直接的試驗(yàn)驗(yàn)證。體內(nèi)試驗(yàn)易受到很多因素的干擾，因而體外重組核小體試驗(yàn)技術(shù)是研究核小體定位的有效手段之一。

影響核小體定位的DNA序列因素有TA 10-bp周期性、polyA、各種序列模體等[3]。其中以色列科學(xué)家Trifonov建立了多個(gè)理論模型，分析了線蟲、人類等模式生物核小體定位特征，提出RRRRRYYYYY模體可能是一種具有強(qiáng)核小體定位信號(hào)的序列，其中R是嘌呤，Y是嘧啶[4-5]。本試驗(yàn)主要考慮了TA 10-bp周期性和R5Y5序列模體，構(gòu)造了6條對(duì)蛋白質(zhì)親和力不同的DNA序列，標(biāo)記為CS1～CS6，構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到大量CS序列。同時(shí)，試驗(yàn)從含有組蛋白重組基因質(zhì)粒的大腸桿菌中表達(dá)純化出4種組蛋白，裝配形成組蛋白八聚體。在體外將DNA序列與組蛋白八聚體在一定條件下進(jìn)行組裝形成核小體結(jié)構(gòu)，建立了一種基于熒光標(biāo)記檢測(cè)核小體體外組裝的試驗(yàn)方法，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

之前試驗(yàn)采用Biotin標(biāo)記方法檢測(cè)核小體組裝效率較為繁瑣，6條序列組裝后還須經(jīng)過核小體電泳、轉(zhuǎn)膜條件、紫外交聯(lián)、封閉、加抗體、洗膜、加抗體、暗室曝片等步驟[6]。由于檢測(cè)的信號(hào)需要多步轉(zhuǎn)換，才能間接地反映核小體組裝效率，而且難以量化，以至于結(jié)果存在較大誤差。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)核小體檢測(cè)方法做了改進(jìn)，試驗(yàn)的DNA直接進(jìn)行熒光標(biāo)記，組裝后進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)，放入熒光化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)中成像，根據(jù)熒光的強(qiáng)弱即可直觀地判斷大概結(jié)果，后期用專業(yè)軟件讀取數(shù)據(jù)就可計(jì)算得出組裝率，從而使核小體定位的研究結(jié)果更加直觀、簡(jiǎn)便、并且更精確可測(cè)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種及質(zhì)粒

試驗(yàn)所用菌株為Escherichia coli DH5α；質(zhì)粒采用含有CS1～CS6的pUC 19重組質(zhì)粒。

1.1.2主要儀器與試劑

儀器：PCR儀（2720 Thermal Cycler）、電泳儀（Bio-Rad）、臺(tái)式多功能高速離心機(jī)（Eppendorf 5804R）、冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5810R）、凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius）、紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 1000）、層析柜（Thermo Revco）、熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Amersham Imager 600）。

試劑：酵母提取物、胰化蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，瓊脂糖購(gòu)自法國(guó)BIOWEST公司，NaCl、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，DNA分子maker、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶購(gòu)自日本Takara公司。

1.2方法

1.2.1目的序列信息

試驗(yàn)所用的6條目的序列中R表示腺嘌呤（A）或者鳥嘌呤（G），Y表示胸腺嘧啶（T）或者胞嘧啶（C）。在6條序列中，CS1只具有R5Y5序列模體特征；CS4～CS6只具有TA 10-bp周期性規(guī)律；而 CS2～CS3同時(shí)具備R5Y5模體和TA 10-bp周期規(guī)律。目的序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，直接連接到pUC19多克隆位點(diǎn)中的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ之間。

1.2.2目的序列擴(kuò)增純化

根據(jù)重組質(zhì)粒的堿基序列，在CS序列2端設(shè)計(jì)引物，對(duì)CS1～CS6進(jìn)行序列片段的擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：5.0 μL 10×buffer，4.0 μL dNTP，2.0 μL 熒光引物，2.0 μL CS-R，3.0 μL Mg2+，0.3 μL DNA，rTaq 0.3 μL，ddH2O 33.4 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃、5 min；94 ℃、20 s，64 ℃、20 s，72 ℃、30 s，32次循環(huán)；72 ℃、10 min，4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增引物為上游引物：5′-ACGGCCAGTGAATT CGAGG-3′；下游引物：5′-GCCAAGCTTCTGAGATCGGAT-3′，其中，上游引物5′端標(biāo)記Cy3熒光分子。

配制1.2%瓊脂糖凝膠分別對(duì)CS1～CS6擴(kuò)增的目的序列進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后進(jìn)行膠回收獲取序列片段，膠回收采用生工生物工程（上海）股份有限公司的膠回收試劑盒。

1.2.3組蛋白的表達(dá)純化

分別將含有組蛋白H2A、H2B、H3、H4基因重組質(zhì)粒的單菌落接種于含有氨芐的LB培養(yǎng)基上，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至D600 nm值為0.4～0.6時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)[7]。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，用wash buffer重懸，再超聲破碎細(xì)菌至菌體完全破裂，離心獲取沉淀。加入wash buffer+Triton-X100重懸沉淀，離心去上清后，利用unfolding buffer充分溶解，離心獲取沉淀，測(cè)定沉淀濃度。其中1×wash buffer的成分為50 mmol/L Tris-bash 6057 00 g，100 mmol/L NaCl 5.840 00 g，1 mmol/L EDTA-Na2 0.372 00 g，1 mmol/L 苯甲脒（benzamidine）0.156 61 g；unfolding buffer的成分為 7 mol/L 鹽酸胍（guanidine hydrochloride）668.780 00 g，20 mmol/L Tris-base 2.422 80 g，10 mmol/L DTT 1.542 40 g。endprint

1.2.4組蛋白復(fù)性及八聚體裝配

取5 mg H2A、H2B、H3、H4加入透析袋中，置于refolding buffer中透析，4 ℃攪拌12 h后，再換1次透析液，4 ℃透析24 h，將透析液取出，4 ℃、1 300 r/min 離心5 min，收集上清，再將樣品濃縮至500 μL，過分子柱，收集片段。其中refolding buffer成分為2 mol/L NaCl 233.760 0 g、10 mmol/L Tris-base 2.422 8 g、1 mmol/L EDTA-Na2 0.744 5 g、5 mmol/L β-疏基乙醇 0.685 0 mL。

1.2.5核小體組裝及其檢測(cè)

將純化的組蛋白八聚體與目的序列以一定的比例加入到含有2 mol/L氯化鈉的TE緩沖液中混勻，總體系30 μL，加入透析管中，放入含2 mol/L氯化鈉的TE透析液中透16 h，在此過程中用恒流泵將TE緩沖液勻速滴入透析液中，使其中氯化鈉的濃度降到 0.6 mol/L；之后將透析管轉(zhuǎn)入到不含有氯化鈉的TE緩沖液中透析 3～6 h。

組裝核小體的試驗(yàn)體系見表1，分別在組蛋白與DNA比例為0.6、0.8、1.0這3種條件下進(jìn)行組裝。組裝后將樣品的體積調(diào)整一致，分別用EB染色、考馬斯亮藍(lán)染色、Cy3熒光信號(hào)檢測(cè)的方法分析組裝效率及檢測(cè)手段的靈敏度。

2結(jié)果與分析

2.1DNA序列擴(kuò)增及純化

目的序列克隆到載體上后，為大量獲得組裝核小體的DNA序列，采用PCR的方法對(duì)目的序列進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色結(jié)果見圖1。圖1中M為DL1000 DNA Ladder marker，CS1～CS6序列條帶位置為 100～200 bp之間，即得到電泳條帶大小約為150 bp，這與目的序列的長(zhǎng)度152 bp基本一致，說明條帶位置正確（圖1）。

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，回收后的樣品采用非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)。由于PCR引物上標(biāo)記有Cy3熒光分子，目的序列經(jīng)擴(kuò)增后在尾部同樣帶有熒光標(biāo)記分子。用熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)拍像，結(jié)果如圖2所示。圖中CS1～CS6為純化后的序列，電泳條帶與理論值基本一致，且沒有任何的污染，純度較高。

2.2組蛋白的表達(dá)純化

從大腸桿菌中表達(dá)4種重組組蛋白，經(jīng)SDS聚丙烯凝膠酰胺電泳檢測(cè)的結(jié)果見圖3。H2A、H2B的分子量約為15 ku，H3的分子量約為17 ku，H4的分子量約為14 ku。純化的組蛋白H2A、H2B、H3、H4條帶位置正確，基本沒有其他蛋白的條帶存在，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3組蛋白復(fù)性及八聚體裝配

將4種組蛋白以等摩爾比例進(jìn)行復(fù)性透析，裝配成八聚體分子結(jié)構(gòu)。在復(fù)性過程中，分子間可能會(huì)發(fā)生團(tuán)聚，也可能形成四聚體結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步純化試驗(yàn)需要的組蛋白八聚體分子，采用凝膠層析的方法對(duì)樣品進(jìn)行純化，洗脫曲線如圖4所示。出現(xiàn)4個(gè)洗脫峰，其中第1個(gè)洗脫峰為大的團(tuán)聚物，中間峰為組蛋白八聚體，最后1個(gè)峰為四聚體。將中間洗脫峰對(duì)應(yīng)的樣品用SDS聚丙烯凝膠酰胺電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖5。從圖5中可以看出，每個(gè)泳道中均呈現(xiàn)出3條條帶，其中最上的條帶為H3分子，中間為H2A和H2B的混合物，最下的條帶為H4分子，條帶的亮度與位置均符合理論預(yù)期結(jié)果。每個(gè)樣品中都沒有檢測(cè)到雜蛋白的污染，純度較高，可用于后續(xù)核小體體外組裝試驗(yàn)。

2.4核小體組裝及檢測(cè)

為摸索組蛋白與目的DNA在不同比例條件下形成核小體的能力，分別采用0.6、0.8、1.0這3個(gè)不同的組蛋白與DNA序列的質(zhì)量比進(jìn)行組裝核小體。

組裝核小體后，首先采用EB染色和Cy3熒光標(biāo)記檢測(cè)手段分析樣品。圖6-A是檢測(cè)熒光信號(hào)的結(jié)果，3個(gè)不同比例下，電泳中均呈現(xiàn)2條條帶，其中下面的條帶是沒有形成核小體的游離DNA，上面的條帶是形成核小體的DNA。將同一個(gè)凝膠電泳用EB染色檢測(cè)的結(jié)果見圖6-B，與熒光檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的位置都檢測(cè)到了條帶，但是EB染色的條帶沒有熒光信號(hào)檢測(cè)的條帶亮度高，說明EB染色的方法沒有Cy3熒光標(biāo)記檢測(cè)手段靈敏。同時(shí)，從EB染色結(jié)果可以看出條帶的大致位置，游離DNA的條帶在100～200 bp之間，而核小體DNA由于組蛋白的存在，位于400 bp左右。3個(gè)不同比例下形成核小體的效率有所差異，隨著組蛋白比例越大，形成的核小體條帶越深。游離的DNA條帶越淺，說明組裝的核小體越多。用熒光標(biāo)記檢測(cè)出來的結(jié)果條帶清晰、靈敏，用EB染色后圖片中顯示出來的并不靈敏，組蛋白的結(jié)合在一定程度上影響了EB的染色效果，所以一般采用熒光標(biāo)記來檢測(cè)。

為進(jìn)一步從組蛋白的角度檢測(cè)組裝的核小體，分別采用熒光標(biāo)記檢測(cè)和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)體外組裝核小體的結(jié)果，圖7-A所示是Cy3熒光標(biāo)記檢測(cè)的結(jié)果。對(duì)凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色后，在核小體對(duì)應(yīng)條帶位置也呈現(xiàn)出蛋白條帶（圖7-B），說明組蛋白與DNA有效地裝配成了核小體。

試驗(yàn)以CS3序列為組裝核小體的試驗(yàn)DNA模板，進(jìn)行3個(gè)不同比例的組裝條件摸索，均有效地形成了核小體結(jié)構(gòu)。在后續(xù)對(duì)多條序列同時(shí)進(jìn)行組裝核小體時(shí)，考慮到多條DNA序列對(duì)組蛋白親和性的差異，選擇在組蛋白與DNA比例為0.8的條件下進(jìn)行組裝試驗(yàn)，使得形成的核小體既不過分飽和，同時(shí)又能體現(xiàn)出各條序列組裝核小體的差異。

2.56條CS序列組裝核小體效率的對(duì)比

為進(jìn)一步對(duì)比6條CS序列組裝核小體效率的差異，在同樣的試驗(yàn)條件下，同時(shí)組裝核小體結(jié)構(gòu)，Cy3熒光信號(hào)檢測(cè)結(jié)果見圖8。從圖8中可以看出，6條序列的泳道中均出現(xiàn)2條條帶，分別是核小體DNA和游離DNA，表明均能有效地形成核小體。但是每一條序列的核小體DNA和游離DNA相對(duì)亮度不同，例如，CS2、CS3泳道中核小體DNA條帶相對(duì)較亮，而CS1、CS6泳道中核小體DNA條帶相對(duì)較弱，說明它們形成核小體的能力存在差異。endprint

利用凝膠成像定量分析軟件Image Quant TL，將泳道中的條帶分別定量化處理，讀取相對(duì)數(shù)值，計(jì)算6條序列組裝核小體過程中吉布斯自由能的變化， 進(jìn)而評(píng)價(jià)各條序列對(duì)組蛋白的親和性。定義未形成核小體的自由DNA為VD，形成核小體的DNA為VN，則反應(yīng)過程的表觀平衡常數(shù)Keq=VN/VD，吉布斯自由能變化ΔG0=-RT ln（Keq），以CS1為對(duì)照序列，相對(duì)吉布斯自由能變化ΔΔG0=ΔG0樣本-ΔG0對(duì)照[3]。

組裝核小體過程的吉布斯自由能計(jì)算結(jié)果見表2。CS2和CS3的相對(duì)吉布斯自由能最小，說明這2條序列對(duì)組蛋白的親和性最大，在同等條件下，越易形成核小體[8-9]。

3結(jié)論與討論

體外組裝核小體是研究核小體定位及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)領(lǐng)域常用的一種技術(shù)手段。目前主要通過2種策略有效地組裝核小體，一種是利用如NAP或ACF等染色質(zhì)重塑因子的作用，使DNA序列纏繞到組蛋白上，該過程需要消耗能量[10]。另一種是本試驗(yàn)中使用的，由于組裝過程中不需要其他蛋白因子的參與，僅依賴鹽濃度的變化驅(qū)動(dòng)核小體的裝配，所以組裝核小體的效率只與DNA序列的特征有關(guān)，在研究DNA序列影響核小體定位時(shí)，該方法具有較大的優(yōu)勢(shì)[11]。

體外組裝核小體結(jié)構(gòu)后，如何靈敏地檢測(cè)核小體形成效率是一個(gè)關(guān)鍵問題。其中最為便利的檢測(cè)手段是EB染色方法，但是EB染色的靈敏度較低，對(duì)于核小體組裝能力差的DNA序列，會(huì)導(dǎo)致較大的誤差。同位素標(biāo)記是靈敏度非常高的一種檢測(cè)手段，但是在組裝核小體的試驗(yàn)中，由于需要大量的摸索條件，需要一次性制備大量的DNA序列，從摸索組裝核小體的比例等條件到多條序列組裝核小體能力的相互對(duì)比，往往試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，而同位素的半衰期又較短，這就限制了試驗(yàn)的進(jìn)度，且同位素標(biāo)記試驗(yàn)需要在專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室才能完成[12]。另一種檢測(cè)手段是筆者所在課題組前期使用的生物素標(biāo)記方法，將組裝核小體的DNA序列標(biāo)記生物素分子后，檢測(cè)時(shí)需要轉(zhuǎn)膜、抗體識(shí)別、底物反應(yīng)、曝光膠片等步驟，較為繁瑣的試驗(yàn)步驟容易放大誤差[6]。本試驗(yàn)采用熒光分子Cy3標(biāo)記在PCR引物的5′端，在序列準(zhǔn)備時(shí)，非常方便地獲得大量標(biāo)記Cy3的目的DNA序列，組裝核小體的樣品經(jīng)電泳后，直接在熒光凝膠成像儀中激發(fā)熒光信號(hào)成像，既靈敏又簡(jiǎn)潔方便，同時(shí)克服了上面幾種方法的缺點(diǎn)。

試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的6條序列，CS2、CS3同時(shí)具有TA 10-bp周期和R5Y5模體規(guī)律，而CS1沒有TA 10 bp規(guī)律，CS4～CS6沒有R5Y5模體規(guī)律，理論上講，CS2、CS3對(duì)組蛋白的親和性最高，同樣條件下組裝核小體的效率最大。經(jīng)過組裝核小體的試驗(yàn)結(jié)果分析，電泳的結(jié)果顯示CS2、CS3形成核小體相對(duì)較多。吉布斯自由能的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CS2和CS3序列形成核小體過程中吉布斯自由能最小，說明這2條序列更加傾向于核小體的形成，驗(yàn)證了筆者設(shè)計(jì)序列的理論基本是正確的。

總之，本研究利用鹽透析方法，建立了1套體外組裝核小體的試驗(yàn)體系，發(fā)展了一種熒光標(biāo)記檢測(cè)核小體組裝效率的手段。該方法可靈敏、便利且定量化地分析不同DNA序列核小體的效率。該方法的建立對(duì)核小體定位及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)領(lǐng)域的研究具有重要的意義。

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