番茄葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因cab—1a的克隆與定位

朱彬彬　崔百明　向本春

摘要：在進行酵母雙雜交試驗時發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯Y病毒HC-Pro蛋白與番茄未知蛋白發(fā)生相互作用，經(jīng)測序、Blast比對，確認其為番茄葉綠素a/b結(jié)合蛋白Cab-1A，Genebank序列號為XM_010318610.1。為初步驗證這一發(fā)現(xiàn)，設(shè)計引物，然后以番茄cDNA文庫為模板，克隆出798 bp的cab-1a全長序列，并構(gòu)建了cab-1a基因的亞細胞定位載體pSPGFP-Cab-1A，并運用葉盤法將其轉(zhuǎn)化到煙草表皮細胞中，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察其定位情況。結(jié)果表明，cab-1a基因編碼的Cab-1A-like蛋白位于細胞核和細胞質(zhì)中，為與馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）蛋白HC-Pro（helper component proteinase）相互作用的后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番茄；葉綠素a/b；蛋白Cab-1A；亞細胞定位；GFP；煙草表皮細胞

中圖分類號： S641.201文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0020-04

光合作用是地球上生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)，高等植物光合作用光能的捕獲與傳遞主要是通過光捕獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白（chlorophyll a/b binding protein，Cab）來完成[1]，在高等植物中大部分葉綠素分子都結(jié)合在光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的天然色素蛋白復(fù)合物上[2]。這些蛋白復(fù)合物共同組成一個很重要而又很龐大的家族，但特點又不是很明顯。光捕獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白Cab是一類能捕獲光能，并把光能轉(zhuǎn)化成電能迅速傳至光反應(yīng)中心引起光化學(xué)反應(yīng)的色素蛋白，這些蛋白復(fù)合體由屬于同一家族的色素結(jié)合蛋白與色素結(jié)合而形成，然后通過色素結(jié)合蛋白的跨膜區(qū)將其錨定在類囊體膜上。高等植物中大部分的葉綠素分子都結(jié)合在PSⅠ、PSⅡ的捕光色素蛋白復(fù)合物上，其中PSⅡ捕光色素蛋白復(fù)合物結(jié)合的葉綠素約占類囊體膜上色素量的50%[3]，除與光能的傳遞相關(guān)之外，其在響應(yīng)外界生物脅迫方面也發(fā)揮著重要作用[4-5]，且隨著電子晶體學(xué)研究方法的發(fā)展，對Cab蛋白晶體結(jié)構(gòu)的分析也日趨深入[6]。

葉綠素a/b結(jié)合蛋白由定位于細胞核內(nèi)的cab基因編碼[7]，核基因cab轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA在細胞質(zhì)的80 S核糖體上翻譯合成前體多肽，這些前體多肽被運進葉綠體并被加工切割成成熟蛋白，其轉(zhuǎn)移過程借助于被稱為過渡肽（transit peptide）或引導(dǎo)肽（leader peptide）的N末端擴展序列。過渡肽和切割位點下游6—15氨基酸殘基區(qū)域是Cab蛋白前體的多變區(qū)[8]。

番茄中，目前為止已報道的Cab蛋白有21種[9]，其中Cab-1A為高等植物中的主要光捕獲蛋白之一，別稱 LHCb1-1。本研究對光捕獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白Cab-1A進行定位，結(jié)合對與PVY HC-Pro相互作用的研究，以期為探索葉綠素a/b結(jié)合蛋白的新功能奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

大腸桿菌（Escherchia coil）DH5α、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefacieas）GV3101以及各個載體骨架均由筆者所在實驗室保存提供。

限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、ClaⅠ、SalⅠ、KpnⅠ、SmaⅠ均購自于賽默飛世爾科技（中國）有限公司。EcoR Ⅰ、T4 DNA ligase、pGEM-T Esay Vector、Wizard DNA clean-up凝膠回收試劑盒等購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司。DNA MarkerⅢ、Marker DL15000+2000均購自于天根生化科技（北京）有限公司。

從加工番茄（Solanum lycopersicum）里格爾87-5中提取的cDNA、試驗所用本氏煙草種子均由筆者所在實驗室保存。

1.2方法

1.2.1加工番茄cab-1a基因克隆

以加工番茄里格爾 87-5 cDNA為模板，根據(jù)已報道的序列[10]，設(shè)計相應(yīng)的引物（表1），PCR克隆得到cab-1a基因片段。將PCR擴增獲得的目的基因片段進行凝膠電泳檢測，并對檢測到的目的基因片段運用試劑盒進行凝膠回收，進而連接到T載體 pGEM-Easy Vector上，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2Cab-1A-like蛋白的生物信息學(xué)分析

運用 ExPASy 程序（http：//www.expasy.org）進行氨基酸序列生物信息學(xué)分析[11]；假定蛋白質(zhì)的多重比對和進化樹分析在Vector NTI 11.5進行；跨膜區(qū)域和構(gòu)向預(yù)測在TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html）中進行；通過HNN二級結(jié)構(gòu)預(yù)測程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_hnn.html）推定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；三級結(jié)構(gòu)模型建立使用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org）程序。

1.2.3亞細胞定位載體的構(gòu)建

設(shè)計引物GFP-S/GFP-AS（表1），從pCBGFP：35S-GAi載體上克隆得到綠色熒光蛋白基因GFP序列，經(jīng)XmaⅠ/SacⅠ雙酶切后，凝膠電泳檢測并回收目的片段GFP，然后將酶切后的GFP片段連接到同樣酶切的雙元載體pSPYCE：35S上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，將構(gòu)建好的N端定位載體骨架pSPGFP：35S送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。然后將目的基因cab-1a從T載體上酶切下來，連接到N端定位載體上，構(gòu)建最終定位載體pSPGFP-Cab-1A（圖1），并以pSPGFP載體骨架作為對照，酶切鑒定并測序。endprint

1.2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片遺傳轉(zhuǎn)化

將測序正確的目標(biāo)載體運用電擊法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，克隆PCR，挑取陽性克隆，接種到10 mL的LB液體培養(yǎng)基中（含有相應(yīng)的抗生素），28 ℃孵育24 h以上，之后在28 ℃、190 r/min搖床振蕩至培養(yǎng)基D600 nm為0.6～1.0。將培養(yǎng)液以3 000 g、4 ℃ 離心15 min，收集農(nóng)桿菌GV3101沉淀。棄廢液，向沉淀顆粒中加入新鮮的滲透液[12]（MgCl2 10 mmol/L，MES/KOH 10 mmol/L，pH值5.7，乙酰丁香酮150 μmol/L），使最終懸浮液D600 nm為0.5左右。將含有農(nóng)桿菌細胞的滲透液在搖床中黑暗孵育2 h，然后用于滲透。

取3周大煙草（本氏煙）植株的頂3葉，采用葉盤法進行組織培養(yǎng)。從組織培養(yǎng)后的葉組織上切取1～2 cm2 的小塊置于滲透液中，并于100 r/min搖床上振蕩滲透10 min。用滅菌的濾紙吸干表面菌液，置于MS預(yù)培養(yǎng)基上，暗處室溫下培養(yǎng) 2 d。2 d后置于共培養(yǎng)MS培養(yǎng)基（含相應(yīng)抗生素）上進行篩選培養(yǎng)，2周更換1次培養(yǎng)基，直至長出2 cm小芽，然后轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基，室溫下進行生根，生根2周后進行熒光檢測。

取轉(zhuǎn)化后的植株葉片置于載玻片上，滴幾滴清水，蓋上蓋玻片，在共聚焦熒光掃描顯微鏡下進行觀察。

2.1序列比對

番茄cab-1a目的基因的假定蛋白Cab-1A-like序列分別與NCBI公布的cab1a、cab1b、cab1c、cab3a、cab3c、cab6a基因的蛋白序列進行比對分析，相似度達到95%以上（圖2），表明克隆的目的基因就是cab-1a，屬于Cab家族成員。Cab-1C進化樹分析結(jié)果（圖3）表明，番茄Cab-1A-like蛋白與Cab-1C的親緣關(guān)系更近，而與NCBI上預(yù)測的Cab-1A蛋白不屬于同一分支，這可能與此蛋白是由假定推測得到的相關(guān)，而且與Cab-3C的相似度最低。

2.2生物信息學(xué)預(yù)測分析

從加工番茄cDNA中擴增出約700 bp的目的條帶，測序分析結(jié)果表明，cab-1a基因ORF長798 bp，預(yù)測可以編碼1個含有265個氨基酸的多肽序列。用NCBI CDS對該多肽進行分析，結(jié)果表明，加工番茄Cab-1A-like蛋白具有葉綠素a/b結(jié)合蛋白家族結(jié)構(gòu)域，屬于該家族成員（圖4）。

用iPSORT（http：//ipsort.hgc.jp/）序列分析表明，番茄的Cab-1A-like蛋白N端有1個潛在的葉綠體轉(zhuǎn)運肽（MAAATMALSSPSFAGQAVKLSPSASEISGN）。

此外，ExPASy（http：//web.expasy.org/peptide_mass/）對其預(yù)測結(jié)果表明，Cab-1A-like蛋白分子量約是 28.07 ku，等電點（PI）為5.51，保守序列約占92.1%。對Cab-1A二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果表明，其有3個跨膜螺旋，且有35.09% α-螺旋、8.68% β-折疊、56.2%的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。

三級結(jié)構(gòu)模型用Swiss Model（http：//swissmodel.expasy.org/templates/1rwt.1）進行預(yù)測，其空間結(jié)構(gòu)與菠菜（SMTL id：1rwt.1）的Cab蛋白有95.65%相似度。

2.3亞細胞定位載體的鑒定

取菌落PCR陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA，并根據(jù)所設(shè)計引物進行XbaⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定，獲得1條約800 bp的條帶，該條帶為目的基因cab-1a（圖5），與預(yù)期相符，對酶切正確的質(zhì)粒進行測序，結(jié)果表明，構(gòu)建的亞細胞定位載體是正確的。

2.4熒光檢測

將雙元表達載體pSPGFP-Cab-1A運用電擊法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，用克隆PCR鑒定正確的菌株侵染本氏煙表皮細胞48 h，激光共聚焦顯微鏡下觀察到綠色熒光分布在煙草表皮細胞的細胞核膜和細胞質(zhì)上，并且細胞核上的熒光比細胞質(zhì)的熒光要強（圖6）。

3結(jié)論與討論

cab基因家族在長期進化過程中，cDNA序列是相當(dāng)保守的[13]。同樣的，番茄cab-1a基因作為LhcbI類基因成員[10]，其對應(yīng)的蛋白序列與其他幾個Cab基因蛋白序列的一致性在85%以上，進一步證明此基因在進化過程中是相對保守的。但是，由cab-1基因與cab-3基因編碼的多肽相比，轉(zhuǎn)運肽和N末端的結(jié)構(gòu)域有明顯差別，而其余部分的序列基本是相同的。因為cab基因編碼的葉綠素a/b結(jié)合蛋白最終定位在葉綠體類囊體膜上，所以這段引導(dǎo)肽對其至關(guān)重要，由于這類蛋白的引導(dǎo)肽多位于蛋白序列的N端，所以，本研究只是將GFP蛋白序列添加到了其C端，不影響其正確的定位。

此外，本研究對Cab-1A-like蛋白的亞細胞定位結(jié)果表明，其位于細胞的細胞質(zhì)和細胞核中，細胞質(zhì)中的蛋白屬于葉綠體內(nèi)定位的蛋白或者是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上正在加工的不成熟蛋白；對于細胞核上的定位，大多位于細胞核核膜上，本研究猜測這可能是由于該蛋白引導(dǎo)肽與某個蛋白的核定位信號序列結(jié)構(gòu)相似所致。

植物在長期進化過程中，不斷抵御外部傷害，包括有害生物的入侵，其體內(nèi)逐漸形成了一套完整的保護機制[14-15]，無論是針對細菌還是病毒，植物能抵抗絕大多數(shù)微生物的侵染，主要是因為植物細胞具有識別微生物保守分子模式的受體，這些受體能把胞外信號傳遞到胞內(nèi)，觸發(fā)植物的先天免疫反應(yīng)。病原物在與植物的長期互作過程中進化出效應(yīng)蛋白，這些效應(yīng)蛋白能夠抑制植物的先天免疫反應(yīng)，從而使病原物可以成功地侵染特定的植物[16]。本研究在前期進行的酵母雙雜交試驗過程中發(fā)現(xiàn)，Cab-1A-like蛋白與馬鈴薯Y病毒HC-Pro蛋白相互作用，由于酵母雙雜交系統(tǒng)的篩選存在假陽性結(jié)果[17-18]，使得本研究有必要對該蛋白作出進一步深層次的分子鑒定，為后續(xù)驗證該蛋白質(zhì)與馬鈴薯Y病毒蛋白相互作用機理奠定基礎(chǔ)。endprint

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