姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3、A2780凋亡的影響及其機(jī)制

王翠娟，尚明，張志虎，孫亞昕，衛(wèi)海燕，邵華

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250355；2山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院；3山東省腫瘤醫(yī)院)

·論著·

姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3、A2780凋亡的影響及其機(jī)制

王翠娟1，2，尚明3，張志虎2，孫亞昕2，衛(wèi)海燕2，邵華2

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250355；2山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院；3山東省腫瘤醫(yī)院)

目的觀察姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其機(jī)制。方法將卵巢癌SKOV-3、A2780細(xì)胞分為對(duì)照組、姜黃素組、N-乙酰半胱氨酸(NAC)+姜黃素組、過(guò)氧化氫酶(CAT)+姜黃素組。姜黃素組加20 μmol/L姜黃素培養(yǎng)48 h；NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組分別加入5 nmol/mL的NAC和5 U/mL的CAT提前作用2 h，再加入20 μmol/L姜黃素培養(yǎng)48 h；對(duì)照組加入0.1% DMSO培養(yǎng)48 h。采用流式細(xì)胞術(shù)和AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，用流式細(xì)胞術(shù)和DCFH-DA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，用流式細(xì)胞術(shù)和JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體膜電位，用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中的自噬相關(guān)蛋白LC3、p62和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9的表達(dá)水平。結(jié)果SKOV-3、A2780細(xì)胞凋亡率、活性氧水平、自噬相關(guān)蛋白LC3和凋亡相關(guān)蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9相對(duì)表達(dá)量姜黃素組均高于對(duì)照組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組，P均<0.05；線粒體膜電位、p62相對(duì)表達(dá)量姜黃素組均低于對(duì)照組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組，P均<0.05。結(jié)論姜黃素可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3、A2780凋亡。其機(jī)制可能是姜黃素誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3、A2780細(xì)胞內(nèi)活性氧積聚，降低線粒體膜電位，啟動(dòng)線粒體自噬失代償而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

姜黃素；卵巢癌細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；活性氧；線粒體；自噬

Abstract:ObjectiveTo explore the effect and its mechanism of curcumin on the apoptosis of ovarian cancer cells.MethodsThe ovarian cancer cells SKOV-3 and A2780 were divided into the control group, curcumin group, N-acetylcysteine (NAC)+curcumin group, and catalase (CAT)+curcumin group. The curcumin group was treated with 20 μM curcumin for 48 h. NAC+curcumin group and CAT+curcumin group were first treated with 5 nmol/mL NAC and 5U/mL CAT for 2 h, then 20 μM curcumin was added to culture the cells for 48 h. The control group was incubated with 0.1% DMSO for 48 h. The apoptosis rate of each group was detected by flow cytometry and Annexin V-FITC/PI apoptotic kit. Flow cytometry combined with DCFH-DA kit and JC-1 kit were used to detect the intracellular reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential changes. The expression levels of autophagy-related proteins LC3, p62 and PARP, cleaved-caspase 3 and cleaved-caspase 9 were detected by Western blotting.ResultsThe levels of apoptotic rate, reactive oxygen species, autophagy-related protein LC3, and apoptosis-related proteins in the curcumin group were higher than those in the control group, NAC+curcumin group, and CAT+curcumin group (allP<0.05). However, mitochondrial membrane potential, p62 expression of the curcumin group were lower than those of the control group, NAC+curcumin group, and CAT+curcumin group (allP<0.05).ConclusionCurcumin can induce the apoptosis of ovarian cancer cells SKOV-3 and A2780 by inducing the accumulation of reactive oxygen species, decreasing the mitochondrial membrane potential, and initiating mitochondrial autophagic decompensation.

Keywords: curcumin; ovarian carcinoma cell; apoptosis; reactive oxygen species; mitochondria; autophagy

姜黃素最初是從姜黃屬植物根莖中提取的化合物。美國(guó)國(guó)立腫瘤研究中心已經(jīng)將其列為第三代癌化學(xué)預(yù)防藥[1]。在腫瘤治療方面，姜黃素能夠抑制乳腺癌[2]、黑色素瘤[3]、淋巴瘤[4]細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并降低腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。但是姜黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制目前尚未完全闡明?；钚匝跽T導(dǎo)的細(xì)胞線粒體途徑的凋亡是抗癌藥物發(fā)揮作用的的重要途徑之一。本研究觀察了姜黃素對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡率的影響，并探討活性氧誘導(dǎo)的線粒體途徑自噬在其中發(fā)揮的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及試劑 卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3、A2780來(lái)源于美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)和中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，由山東省腫瘤醫(yī)院基礎(chǔ)研究中心提供。用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中(5%CO2、37 ℃)及飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。姜黃素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(批號(hào)08511，規(guī)格10 mg/支)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)、過(guò)氧化氫酶(CAT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶消化液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、PBS緩沖液均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen Gibco公司，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)和活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京碧云天公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司，蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，BCATM Protein Kit蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司，SDS-PAGE凝膠制備相關(guān)試劑購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司，一抗、山羊抗兔/抗鼠熒光二抗購(gòu)于美國(guó) CST 公司和武漢 Proteintech 公司。

1.2 卵巢癌細(xì)胞分組及姜黃素、NAC、CAT應(yīng)用方法 將體外培養(yǎng)的卵巢癌SKOV-3、A2780細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、姜黃素組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組，每組8孔。姜黃素組加20 μmol/L姜黃素培養(yǎng)48 h；NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組分別加入5 nmol/mL的NAC和5 U/mL的CAT提前作用2 h，再加入20 μmol/L姜黃素培養(yǎng)48 h；對(duì)照組加入0.1% DMSO培養(yǎng)48 h。

1.3 各組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。按AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用流式細(xì)胞儀和Flowjo軟件測(cè)算各組培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞凋亡率。

1.4 各組細(xì)胞活性氧水平檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)和熒光探針DCFH-DA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA, 配成終濃度為10 μmol/L的工作液，各組細(xì)胞處理結(jié)束后加1 mL工作液，在37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min，在流式細(xì)胞儀上以488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度(FI)，以此表示各組細(xì)胞活性氧水平。

1.5 各組細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀和JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體膜電位。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，孵育結(jié)束后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)JC-1的熒光強(qiáng)度(FI)，以此表示各組細(xì)胞線粒體膜電位。

1.6 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3、p62和凋亡相關(guān)蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液在冰上裂解30 min。隨后在低溫高速離心機(jī)中12 000 g離心15 min，將上清蛋白樣品保存在-20 ℃?zhèn)溆?。用Western blotting法檢測(cè)各蛋白相對(duì)表達(dá)量，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。各蛋白相對(duì)表達(dá)量以各蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比表示。以對(duì)照組為1，計(jì)算其他組各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組、姜黃素組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組SKOV-3細(xì)胞凋亡率分別為3.50±0.62、13.43±0.80、8.75±0.66、6.63±0.60， A2780細(xì)胞凋亡率分別為3.53±0.84、14.82±3.80、7.15±1.44、7.13±2.48。SKOV-3、A2780細(xì)胞凋亡率姜黃素組高于對(duì)照組、NAC+姜黃素組和CAT+姜黃素組，P均<0.05。

2.2 各組細(xì)胞活性氧水平比較 對(duì)照組、姜黃素組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組SKOV-3細(xì)胞活性氧水平分別為5.42±0.78、14.3±0.53、17.17±0.32、21.9±0.75，A2780細(xì)胞活性氧水平分別為2.83±0.36、9.75±1.03、11.17±1.75、18.57±1.26。SKOV-3、A2780細(xì)胞活性氧水平姜黃素組高于對(duì)照組、NAC+姜黃素組和CAT+姜黃素組，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞線粒體膜電位比較 對(duì)照組、姜黃素組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組SKOV-3細(xì)胞線粒體膜電位分別為7.38±0.83、39.40±6.26、16.93±1.80、18.3±3.37，A2780細(xì)胞線粒體膜電位分別為8.43±0.57、52.97±11.68、27.67±4.58、25.10±4.50。SKOV-3、A2780細(xì)胞線粒體膜電位姜黃素組低于對(duì)照組、NAC+姜黃素組和CAT+姜黃素組，P均<0.05。

2.4 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3、p62和凋亡相關(guān)蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3、p62和凋亡相關(guān)蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，姜黃素組自噬相關(guān)蛋白LC3及凋亡相關(guān)蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase的表達(dá)量高于對(duì)照組、NAC+姜黃素組和CAT+姜黃素組，P均<0.05；而姜黃素組LC3的底物p62表達(dá)量低于對(duì)照組、NAC+姜黃素組和CAT+姜黃素組，P均<0.05。

表1 各組SKOV-3、A2780細(xì)胞LC3、p62、PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

近年來(lái)，研究者陸續(xù)研究了許多天然化合物在防癌、抗癌方面的作用及其機(jī)制，評(píng)估作為抗癌新藥的應(yīng)用潛力，這其中就包括姜黃素[5～9]。姜黃素類(lèi)藥物最初是從姜黃屬植物根莖中提取的化合物，分子式為C21H20O6，其結(jié)構(gòu)主鏈由不飽和脂族及芳香族構(gòu)成，易溶于二甲基亞砜、乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，難溶于水。姜黃素可以用于多種癌癥的化學(xué)預(yù)防，發(fā)揮抗增殖、抗氧化和致癌阻斷作用，調(diào)節(jié)參與慢性致癌過(guò)程的多種分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)突變細(xì)胞凋亡，阻礙炎性癌癥微環(huán)境的形成[10，11]，但是姜黃素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制一直不明確。本研究結(jié)果顯示，SKOV-3、A2780細(xì)胞凋亡率姜黃素組高于對(duì)照組，說(shuō)明姜黃素可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，且姜黃素濃度越高效果越明顯。

活性氧是細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)重要的調(diào)控因子，它參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與分化、細(xì)胞黏附與細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)行為，但是過(guò)多活性氧聚集對(duì)細(xì)胞危害十足，它能夠氧化修飾DNA、脂質(zhì)與蛋白質(zhì)并使其失活，造成細(xì)胞的氧化損傷，因此，通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)活性氧聚集水平可以促進(jìn)藥物抗腫瘤作用的發(fā)揮。目前，活性氧發(fā)揮其抗腫瘤作用主要是通過(guò)損傷細(xì)胞DNA或者誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡兩個(gè)方面實(shí)現(xiàn)的，主要包括：①直接損傷細(xì)胞線粒體DNA；②引起線粒體膜過(guò)氧化破壞，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降，啟動(dòng)線粒體途徑的凋亡過(guò)程；③間接破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)并激活多種信號(hào)通路，激活下游信號(hào)通路誘導(dǎo)凋亡。本研究結(jié)果顯示，姜黃素組的SKOV-3、A2780細(xì)胞活性氧水平高于對(duì)照組。說(shuō)明姜黃素可以提高卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，這可能是姜黃素促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡的主要原因。選用兩種細(xì)胞，避免了細(xì)胞株差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在本研究中還應(yīng)用JC-1探針試劑盒檢測(cè)了線粒體膜電位，其原理是在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1主要聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，此時(shí)產(chǎn)生紅色熒光；而在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，單體的JC-1產(chǎn)生綠色熒光，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以通過(guò)上述熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)判斷線粒體膜電位的變化。本研究結(jié)果顯示姜黃素處理細(xì)胞后線粒體膜電位降低，而應(yīng)用ROS清除劑NAC和CAT則可以減弱姜黃素對(duì)線粒體電位的影響，說(shuō)明了姜黃素在引起卵巢癌細(xì)胞ROS的大量積聚后，ROS引起了線粒體膜的過(guò)氧化破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降，啟動(dòng)了細(xì)胞線粒體途徑的早期凋亡過(guò)程，從而發(fā)揮其抗癌作用。

自噬是細(xì)胞在生理病理?xiàng)l件下都普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象，是對(duì)刺激的代償反應(yīng)。如果自噬能夠代償，則促進(jìn)細(xì)胞的生存，若失代償則誘發(fā)細(xì)胞死亡。Lemasters在2005年首次提出線粒體自噬的概念[14]，研究表明線粒體自噬的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中需要特異性線粒體受體的參與，線粒體受體蛋白含有一段LC3相互作用區(qū)域(LIR)，能和LC3蛋白上保守疏水結(jié)構(gòu)域結(jié)合[15, 16]，使得線粒體逐漸被自噬體囊泡包裹從而被降解掉。本研究結(jié)果顯示，姜黃素組兩種細(xì)胞自噬相關(guān)通路的LC3蛋白表達(dá)也增高，而應(yīng)用ROS清除劑后，LC3蛋白表達(dá)增高的趨勢(shì)減弱。p62作為L(zhǎng)C3的底物，其變化趨勢(shì)和LC3是相反的，說(shuō)明姜黃素通過(guò)ROS增高誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。

綜上所述，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3和A2780細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是姜黃素通過(guò)增高腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平、降低細(xì)胞的線粒體膜電位、啟動(dòng)自噬性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞失代償性調(diào)亡，是一種有應(yīng)用潛力的抗癌藥物。

[1] Chen W, Zheng R, Baade P, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[2] 劉宇飛，王飛，羅代珍，等. 姜黃素對(duì)MDA-MB-361乳腺癌細(xì)胞DLC1基因表達(dá)影響及其機(jī)制探討[J]. 中華腫瘤防治雜志，2016，23(7)：426-430.

[3] Wu J, Lu WY, Cui LL. Inhibitory effect of curcumin on invasion of skin squamous cell carcinoma A431 cells [J].Asian Pac J Cancer Prev, 2015,16 (7):2813-2818 .

[4] Zhang JR , Lu F, Lu T, et al. Inactivation of FoxM1 transcription factor contributesto curcumin-induced inhibition of survival, angiogenesis,and chemosensitivity in acute myeloid leukemia cells[J]. J Mol Med, 2014,92(9):1319-1330.

[5] 汪叢叢，莊靜，馮福彬，等. 姜黃素抑制肺癌細(xì)胞血管擬態(tài)形成機(jī)制探討[J]. 中華腫瘤防治雜志，2015，22(4)：243-246.

[6] 陳茜，陳麗娟，黨媛媛，等.姜黃素通過(guò)阻滯MAPK/ERK通路抑制人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46(8)：762-768.

[7] 林妙，姚慶華，王玉琪，等.氧化應(yīng)激在姜黃素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡中的作用[J]. 中國(guó)腫瘤，2015，24(3)：229-233.

[8] 趙瑩，李英姿.姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌A459細(xì)胞增殖及CDH13甲基化狀態(tài)的的影響[J]. 山東醫(yī)藥，2017，57(6)：9-12.

[9] 楊海霞.姜黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響[J]. 山東醫(yī)藥，2012，52(46)：37-39.

[10] 羅麗萍，彭詩(shī)維，朱四紅，等.姜黃素協(xié)同順鉑對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞株COC1/DDP抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 江西醫(yī)藥，2016，51(11)：1165-1167.

[11] 盛順良，莫湘瓊，歐陽(yáng)新平.姜黃素對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡的的影響及機(jī)制探討[J]. 山東醫(yī)藥，2012，52(34)：27-29.

[12] Lemasters JJ. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction and aging[J]. Rejuvenation Res, 2005,8(1):3-5.

[13] Birgisdottir AB, Lamark T, Johansen T. The LIR motif - crucial for selective autophagy[J]. J Cell Sci,2013,126(15): 3237-3247.

[14] Lemasters JJ. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging[J]. Rejuvenation Res, 2005,8(1):3-5.

[15] Muhlinen N, Akutsu M, Ravenhill BJ, et al. LC3, bound selectively by a noncanonical LIR motif in NDP52, is required for antibacterial autophagy[J]. Mol Cell, 2012,48(3):329-342.

[16] Birgisdottir AB, Lamark T, Johansen T. The LIR motif-crucial for selective autophagy[J]. J Cell Sci, 2013,126(15):3237-3247.

Effects of curcumin on apoptosis of ovarian cancer cell lines SKOV-3 and A2780

WANGCuijuan1,SHANGMing,ZHANGzhihu,SUNYaxin,WEIHaiyan,SHAOHua

(1InstituteofTraditionalChineseMedicine,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250062,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.001

R737.9

A

1002-266X(2017)35-0001-04

2017-06-23)

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015WS0167)。

王翠娟(1979-)，女，醫(yī)學(xué)博士在讀，主要研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療腫瘤。E-mail：iamcuijuan@163.com

邵華(1963-)，男，醫(yī)學(xué)博士，研究員，主要研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究。E-mail：Chinashaohua5888@163.com