胃得安片對應激性胃損傷模型大鼠胃功能及胃組織中EGF、EGFR表達的影響

畢云生，徐建江，李允江，張淑瑜，于燕莉#

（1.濟南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，濟南250031；2.山東中醫(yī)藥大學藥學院，濟南 250355）

胃得安片對應激性胃損傷模型大鼠胃功能及胃組織中EGF、EGFR表達的影響

畢云生1＊，徐建江1，李允江2，張淑瑜1，于燕莉1#

（1.濟南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，濟南250031；2.山東中醫(yī)藥大學藥學院，濟南 250355）

目的：研究胃得安片對應激性胃損傷模型大鼠胃功能及胃組織中表皮生長因子（EGF）及其受體（EGFR）表達的影響，探討其治療胃潰瘍的作用機制。方法：將大鼠隨機分為正常組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽性組（鹽酸雷尼替丁，0.015 mg/kg）和胃得安片高、中、低劑量組（1.7、0.87、0.43 g/kg），每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均采用空腹冷水游泳法復制胃潰瘍模型。成模后，各組大鼠每天ig給藥1次，連續(xù)2周。記錄大鼠于給藥第0、7、14天時的體質(zhì)量；末次給藥12 h后，檢測大鼠的胃液分泌量、胃液pH值、胃潰瘍面積及胃黏膜損傷指數(shù)，并檢測胃組織中EGF、EGFR的表達。結果：與正常組比較，模型組大鼠給藥第7、14天時的體質(zhì)量及胃液pH值降低，胃液分泌量和胃潰瘍面積增加，胃黏膜損傷指數(shù)升高，胃組織中EGF、EGFR表達增強，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，除胃得安片中劑量組大鼠給藥第7天時的體質(zhì)量、胃液分泌量、胃液pH值、胃潰瘍面積以及胃得安片低劑量組大鼠給藥第7、14天時的體質(zhì)量、胃液分泌量、胃液pH值、胃潰瘍面積改善和胃組織中EGF表達增強不顯著外，其余各給藥組大鼠上述指標均顯著改善，且胃組織中EGF、EGFR表達持續(xù)增強（P＜0.05或P＜0.01）；胃得安片的作用呈現(xiàn)一定的量效關系。結論：胃得安片能夠顯著改善應激性胃損傷模型大鼠的胃功能；其機制可能與增強胃組織中EGF、EGFR表達，從而促進潰瘍愈合有關。

胃得安片；胃潰瘍；表皮生長因子；表皮生長因子受體；大鼠

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the effects Weide’an tablet on gastric function and the expressions of epidermal growth factor（EGF）and its receptor（EGFR）in gastric tissue of model rats with stress-induced gastric injury，and investigate its mechanism in the treatment of gastric ulcer.METHODS：Rats were randomly divided into normal group（normal saline），model group（normal saline），positive group（ranitidine hydrochloride，0.015 mg/kg）and Weide’an tablet high-dose，medium-dose，low-dose groups（1.7，0.87，0.43 g/kg），10 in each group.Except for normal group，rats in other groups were given fasting swimming in cold water to induce gastric ulcer model.After modeling，all rats were intragastrically administrated once a day，for 2 weeks.The body mass of rats in 0，7，14 d of administration was recorded.After 12 h of last administration，gastric juice secretion，gastric juice pH，gastric ulcer area and gastric mucosal damage index of rats were detected，and the expressions of EGF and EGFR in gastric tissue were detected.RESULTS：Compared with normal group，body mass and gastric juice pH in 7，14 d in model group were declined；gastric juice secretion and gastric ulcer area were increased，gastric mucosal damage index was increased；and the expressions of EGF and EGFR in gastric tissue were enhanced，with statistical significances（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group，except that the body mass，gastric juice secretion，gastric juice pH and gastric ulcer area in Weide’an medium-dose group in 7 d，and body mass，gastric juice secretion，gastric juice pH，gastric ulcer area and the expression of EGF in gastric tissue in Weide’an low-dose group in 7，14 d were not significantly improved，above indexes were significantly improved in other administration groups（P＜0.05 or P＜0.01）；and the effect of Weide’an tablet showed a certain dose-effect relationship.CONCLUSIONS：Weide’an tablet can significantly improve the gastric function of model rats with stress-induced gastric injury；and the mechanism may be related with enhancing the expressions of EGF and EGFR and promoting ulcer healing.

KEYWORDSWeide’an tablet；Gastric ulcer；Epidermal growth factor；Epidermal growth factor receptor；Rats

胃得安片為我院（濟南軍區(qū)總醫(yī)院）研制的中藥制劑，由白術、蒼術、茯苓、黃連、陳皮、檳榔等25味中藥組成，具有健脾和胃、消食止痛等功效。在我院20多年的臨床應用結果證明，其對慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等疾病療效顯著。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，胃得安片能夠顯著升高應激性胃潰瘍模型大鼠胃組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性、減少胃組織中丙二醛（MDA）含量、維持血清中一氧化氮（NO）含量、抑制誘導型一氧化氮合酶（iNOS）活性、降低胃黏膜細胞過氧化損傷[1]；同時，其又能夠增加前列腺素E2（PGE2）含量、增加胃黏膜血液供應、促使上皮細胞再生、保護黏膜細胞、增強胃黏膜屏障防御能力[2]。本研究通過觀察胃得安片對應激性胃潰瘍模型大鼠體質(zhì)量、胃液分泌量、胃液pH值、胃黏膜潰瘍面積及胃黏膜組織中促進潰瘍愈合的重要調(diào)節(jié)因子——表皮生長因子（EGF）及其受體（EGFR）表達的影響，為進一步闡明胃得安片對胃潰瘍的治療作用機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BS124S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；UV-2550紫外分光光度計（日本島津公司）；TGL-16G-A冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；Bio-Rad680酶標儀（美國Bio-Rad Laboratories公司）；BX53熒光顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；PHS-3C pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司雷磁儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

胃得安片（我院藥劑科，批號：20141021，規(guī)格：0.46 g/片）；鹽酸雷尼替丁膠囊（江西匯仁藥業(yè)有限公司，批號：1411146，規(guī)格：0.15 g/粒）；氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，批號：1411143602，規(guī)格：250 mL∶2.25 g）；兔抗EGF、EGFR一抗（美國Bio-World Technology公司，批號：P00533、P01133）；生物素標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（北京中杉金橋生物工程有限公司，批號：ZB-2301）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢晶美生物工程有限公司，批號：AR1022）。

1.3 動物

健康Wistar大鼠70只，♂，體質(zhì)量180～220 g，購自山東大學實驗動物中心[實驗動物許可證號：SCXK（魯）2013-0009]。

2 方法

2.1 分組與給藥

健康Wistar大鼠購入后于溫度為24～27℃、濕度為50%～65%、自然光照條件下以標準普通飼料穩(wěn)定飼養(yǎng)1周，期間自由飲食。然后將70只大鼠隨機分為正常組（10只）和造模組（60只）。造模組大鼠禁食不禁水12 h，使呈空腹饑餓狀態(tài)，然后將大鼠浸于（20±1）℃水槽中20 h，模擬出饑餓、疲勞、寒邪、惱怒刺激狀態(tài)，以復制應激性胃潰瘍大鼠模型[3-4]。造模組大鼠造模過程中死亡5只，從剩余55只造模成功的大鼠中篩選50只隨機分為5組，分別為模型組、陽性組和胃得安片高、中、低劑量組，每組10只。正常組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水；胃得安片高、中、低劑量組大鼠ig胃得安片1.7、0.87、0.43 g/kg（分別相當于人體正常劑量的2、1、0.5倍，生理鹽水溶解）；陽性組大鼠ig鹽酸雷尼替丁0.015 mg/kg（相當于人體正常劑量的等效劑量，生理鹽水溶解），每天給藥1次，連續(xù)2周，每周稱大鼠體質(zhì)量。

2.2 指標檢測

2.2.1 一般狀態(tài)和體質(zhì)量 密切觀察各組大鼠日?；顒雍瓦M食、飲水情況，并記錄給藥第0、7、14天后大鼠的體質(zhì)量。

2.2.2 胃液分泌量和胃液pH值 末次給藥12 h后，大鼠ip 10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，剖取完整胃組織，稱胃組織質(zhì)量，收集胃液；然后沿胃大彎剪開，用生理鹽水沖洗胃黏膜表面液體，濾紙拭干胃組織表面液體，再次稱量胃組織質(zhì)量，兩次稱量的差值即為胃液分泌量。隨后采用pH計測定胃液pH值。

2.2.3 胃黏膜損傷病理狀況及胃潰瘍面積、胃黏膜損傷指數(shù) 肉眼觀察潰瘍病灶部位的黏膜損傷情況。用游標卡尺測量潰瘍的長徑（mm）和短徑（mm），計算胃潰瘍面積[胃潰瘍面積（mm2）＝π×長徑半徑×短徑半徑]和胃黏膜損傷指數(shù)（病灶長度＜1 mm，記為1分；1 mm≤病灶長度＜2 mm，記為2分；2 mm≤病灶長度＜3 mm，記為3分；3 mm≤病灶長度＜4 mm，記為4分；若病灶長度＞4 mm，則分段計分；最后以全胃潰瘍得分總和作為該大鼠胃黏膜損傷指數(shù)[5]）。

2.2.4 胃組織中EGF和EGFR表達測定 切取潰瘍邊緣約3 mm的組織塊，大小約為1.0 cm×1.2 cm（正常組大鼠取胃前壁近幽門處組織），然后用10%中性甲醛固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，備用。采用免疫熒光染色法檢測胃組織中EGF、EGFR表達。一抗分別滴加兔抗EGF、EGFR抗體（1∶100），37℃孵育1.5 h；二抗分別滴加生物素標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000），37℃孵育1 h。以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替一抗為陰性對照，置熒光顯微鏡下觀察胃組織中EGF、EGFR表達情況，采集熒光圖片，導入Image Pro Plus 6.0軟件分析圖片熒光斑點表達情況，若核膜、胞漿著棕黃色則為陽性細胞。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗進行組間比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 一般狀態(tài)觀察和體質(zhì)量測定結果

給藥過程中各組大鼠的進食、飲水情況均較好，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。造模組大鼠呈現(xiàn)出精神萎靡、皮毛無光澤、活動遲緩等狀態(tài)。隨著給藥次數(shù)的增加，給藥組大鼠的癥狀逐漸改善。與正常組比較，模型組大鼠給藥第7、14天的體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠體質(zhì)量均有不同程度的升高，其中陽性組、胃得安片高劑量組大鼠給藥第7、14天的體質(zhì)量和胃得安片中劑量組大鼠給藥第14天的體質(zhì)量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且胃得安片的作用呈現(xiàn)一定的量效關系，結果見表1。

表1 各組大鼠給藥第0、7、14天時的體質(zhì)量測定結果（x±s，n＝10，g）Tab 1 Determination results of body mass of rats in 0，7，14 d of administration in each group（x±s，n＝10，g）

3.2 胃液分泌量和pH值測定結果

與正常組比較，模型組大鼠胃液分泌量顯著增加、pH值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組和胃得安片高劑量組大鼠胃液分泌量顯著減少、pH值顯著升高（P＜0.01），結果見表2。

表2 各組大鼠胃液分泌量及胃液pH值測定結果（x±s，n＝10）Tab 2 Determination results of gastric juice secretion amount and pH of rats in each group（x±s，n＝10）

3.3 胃黏膜損傷病理觀察及胃潰瘍面積、胃黏膜損傷指數(shù)測定結果

正常組大鼠胃黏膜光滑細膩，呈現(xiàn)淡紅色，黏膜皺襞明顯，無充血，無出血點；造模組大鼠胃內(nèi)出現(xiàn)暗紅色血性物質(zhì)，胃黏膜表面出現(xiàn)大面積彌漫性水腫，部分胃黏膜脫落，可見點狀或條索狀潰瘍面及出血點，其中以模型組大鼠最為顯著、出血點分布最廣泛。給予藥物治療后，大鼠胃內(nèi)暗紅色物質(zhì)減少，黏膜水腫、充血明顯減輕，出血點及潰瘍面分布減少。與正常組比較，模型組大鼠胃潰瘍面積顯著增加（P＜0.01）、胃黏膜損傷指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組和胃得安片高劑量組大鼠胃潰瘍面積顯著減?。≒＜0.01），各給藥組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)均顯著降低（P＜0.01），且胃得安片的作用呈現(xiàn)一定的量效關系，結果見表3。

表3 各組大鼠胃潰瘍面積和胃黏膜損傷指數(shù)測定結果（x±s，n＝10）Tab 3 Determination results of gastric ulcer area and ulcer index of rats in each group（x±s，n＝10）

3.4 胃組織中EGF、EGFR表達測定結果

正常組大鼠胃組織中EGF、EGFR表達顯示為弱陽性，主要集中在壁細胞、頸部細胞的細胞質(zhì)部位。與正常組比較，模型組大鼠胃組織中EGF、EGFR表達均顯著增強（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組與胃得安片高、中劑量組大鼠胃組織中EGF、EGFR表達及胃得安片低劑量組大鼠胃組織中EGFR表達均顯著增強，呈強陽性表達（P＜0.05或P＜0.01），結果見圖1、表4。

圖1 各組大鼠胃組織病理切片圖（免疫熒光染色，×200）Fig 1 Pathological map of gastric tissue of rats in each group（Immunofluorescent staining，×200）

4 討論

應激性胃潰瘍多是應激刺激誘發(fā)的以炎性糜爛、淺表性潰瘍甚至出血為特征的急性胃黏膜病變。中醫(yī)認為機體出現(xiàn)過度勞累、耗氣傷津、氣血虧虛的狀態(tài)時，藥物、酒精、辛辣、生冷等外邪極易入侵胃黏膜，產(chǎn)生刺激而導致發(fā)生應激性病變。另外，肝脾失和、情志不暢也會導致胃潰瘍病變[6]。保護胃黏膜、減少胃液分泌量、降低胃液酸度、修復受損胃黏膜、維持胃黏膜屏障作用，是防治胃潰瘍的有效措施[7]。雷尼替丁是H2受體拮抗藥，能夠競爭性阻斷組胺與H2受體結合、抑制胃酸分泌，同時能夠降低胃蛋白酶活性、促進胃黏膜修復[8]，故本研究以其為陽性對照。

表4 各組大鼠胃組織中EGF、EGFR的表達測定結果（x±s，n＝10）Tab 4 Determination results of expressions of EGF and EGFR in gastric tissue of rats in each group（x±s，n＝10）

通過對大鼠胃黏膜的觀察和胃液分泌量、胃液pH值的測定，發(fā)現(xiàn)高劑量胃得安片能有效地減少胃液分泌、升高胃液pH值，從而降低損害因素水平，促進胃潰瘍的修復、愈合。這一結論在統(tǒng)計潰瘍面積和胃黏膜損傷指數(shù)的結果中也得到了證實，即給予胃得安片后，胃潰瘍模型大鼠胃黏膜水腫、充血現(xiàn)象明顯減輕，出血點及潰瘍面分布顯著減少，胃黏膜損傷指數(shù)顯著降低。

現(xiàn)代研究認為，消化性潰瘍是胃黏膜損害因素與防御因素之間的平衡被破壞而導致的，其中損害因素主要包括胃酸、胃蛋白酶、幽門螺桿菌、非甾體類消炎藥、酒精、膽汁反流及炎癥介質(zhì)等；防御因素包括胃黏膜-黏液屏障、重碳酸鹽、磷脂、黏膜血流、細胞更新、EGF等[9]。EGF是一種由53個氨基酸組成的具有生物活性的多肽，廣泛存在于消化道內(nèi)，起到保護胃黏膜免受損傷因子破壞、調(diào)節(jié)黏膜上皮細胞更新和保護胃、腸黏膜完整等重要作用。然而EGF要發(fā)揮生物效應必須與其受體EGFR結合，才可以刺激上皮細胞的增殖和遷移，參與黏膜的修復和潰瘍的愈合[10-11]。因此，檢測胃組織中EGF、EGFR表達也可以作為評價消化性潰瘍愈合質(zhì)量的重要指標之一。

通過免疫熒光染色圖片可知，陽性組和胃得安片高劑量組大鼠胃組織中EGF、EGFR表達均呈較強陽性，空白組大鼠胃組織中EGF、EGFR表達均呈弱陽性，其中EGF、EGFR的表達均具有同步性，提示胃得安片能增加潰瘍模型大鼠胃黏膜組織中EGF、EGFR表達，促進胃黏膜上皮細胞更新、提高防御因素水平、促進胃黏膜的修復，從而保護胃黏膜的完整性。

綜上所述，胃得安片可通過減少胃液分泌量、升高胃液pH值，上調(diào)胃黏膜組織中EGF、EGFR表達，從而調(diào)控胃潰瘍上皮細胞的再生修復、促進損傷后胃黏膜的愈合，這可能是其治療大鼠胃潰瘍的作用機制之一。

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（編輯：林 靜）

Effect of Weide’an Tablet on Gastric Function and the Expressions of EGF and EGFR in Gastric Tissue of Model Rats with Stress-induced Gastric Injury

BI Yunsheng1，XU Jianjiang1，LI Yunjiang2，ZHANG Shuyu1，YU Yanli1
（1.Dept.of Pharmacy，General Hospital of Jinan Military Region，Jinan 250031，China；2.School of Pharmacy，Shandong University of TCM，Jinan 250355，China）

R285；R97

A

1001-0408（2017）25-3528-04

2017-02-20

2017-05-24）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.20

＊副主任藥師，碩士。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎。電話：0531-51665173。E-mail：jnbys@163.com

#通信作者：主任藥師，碩士生導師，碩士。研究方向：中藥制劑、中藥藥效物質(zhì)基礎。電話：0531-51666293。E-mail：yuyanli323@sohu.com