戊乙奎醚光學異構體與毒蕈堿型受體亞型的分子對接研究

張麗娟，白蘭，師健友，何俊

（1.四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院藥學部，成都610072；2.四川大學華西醫(yī)院腫瘤中心生物治療實驗室，成都 610041）

戊乙奎醚光學異構體與毒蕈堿型受體亞型的分子對接研究

張麗娟1＊，白蘭1，師健友1，何俊2#

（1.四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院藥學部，成都610072；2.四川大學華西醫(yī)院腫瘤中心生物治療實驗室，成都 610041）

目的：研究戊乙奎醚光學異構體對毒蕈堿型（M）受體亞型的親和性，為揭示戊乙奎醚的作用靶點及藥效選擇性提供參考。方法：利用同源建模和分子對接等分子模擬技術，通過比較戊乙奎醚不同光學異構體R1（3R，2′R）、R2（3R，2′S）、S1（3S，2′R）和S2（3S，2′S）與M受體亞型M1～M5的結合能，判斷其與M受體亞型的親和性。結果：戊乙奎醚4個光學異構體均能夠對接到M受體各亞型的活性位點，不同異構體與不同M受體亞型的分子對接顯示出較大差異。4個光學異構體與M3受體具有較大的結合能，在5 736.519～5 907.143 kcal/mol之間；R1與M1的結合能為1 190.04 kcal/mol；而其他光學異構體與各受體亞型的結合能較低或為負數(shù)。結論：戊乙奎醚的異構體R1對M1受體具有親和性，4個光學異構體均對M3受體具有親和性。

戊乙奎醚；光學異構體；毒蕈堿型受體；亞型；分子對接；同源建模

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the affinity of penehyclidine optical isomers to muscarinic（M）receptor subtypes，and provide reference for revealing the action targets and efficacy selectivity of penehyclidine.METHODS：Homology modeling，molecular docking and other molecular simulation technologies were used to analyze and predict the binding energy of 4 optical isomers to M receptor subtypes and judge its affinity by comparing the binding energy of different optical isomers R1（3R，2′R），R2（3R，2′S），S1（3S，2′R），S2（3S，2′S）with M receptor subtypes M1-M5.RESULTS：All the 4 optical isomers can dock into the active sites of M receptor subtypes，and different optical isomers showed great differences in the molecular docking with different M receptor subtypes.Penehyclidine isomers showed larger binding energy to M3，the binding energy of 4 optical isomers ranged in 5 736.519-5 907.143 kcal/mol.The binding energy of R1 to M1was 1 190.041 kcal/mol；while those of other optical isomers to each receptor subtype were lower or negative.CONCLUSIONS：R1 shows the affinity to M1receptor.And all the 4 optical isomer show the affinity to M3.

KEYWORDSPenehyclidine；Optical isomer；Muscarinic receptor；Subtype；Molecular docking；Homology modeling

毒蕈堿型（M）受體是一個受體家族，可分為5種藥理學亞型[1]，即M1～M5。M1受體在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中均有分布，參與腦部高級認知活動，如記憶、學習等，但其并非形成記憶的必需因素[2-3]；同時M1受體還參與調(diào)控胃酸分泌以及與迷走神經(jīng)相關的支氣管收縮功能。M2受體可以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)乙酰膽堿的釋放[4]和心肌收縮力。M3受體則主要參與調(diào)控平滑肌收縮及腺體分泌，并可能參與食欲調(diào)控[2]。M4受體的主要作用是抑制紋狀體內(nèi)多巴胺的分泌，同時調(diào)節(jié)乙酰膽堿相關的運動功能以及抑制交感和副交感神經(jīng)的信號傳遞。M5受體的作用可能與多巴胺系統(tǒng)有關；在虹膜、食管、淋巴細胞中也發(fā)現(xiàn)M5受體少量分布，但具體作用尚不清楚[5]。由于M受體各亞型的同源性和廣泛分布，目前大多數(shù)抗膽堿藥對不同M受體亞型選擇性較差，導致了中樞和外周的各種副作用，限制了此類藥物的臨床應用[3]。

戊乙奎醚（Penehyclidine）是我國自行設計合成的M受體抑制劑，常用于有機磷農(nóng)藥中毒的急救[6]，其存在4個光學異構體，即R1（3R，2′R）、R2（3R，2′S）、S1（3S，2′R）、S2（3S，2′S），以下簡稱R1、R2、S1、S2。藥理學研究表明，不同光學異構體與M受體亞型的作用存在差異。戊乙奎醚主要選擇性作用于M1和M3受體，4個光學異構體中以R1活性最強。戊乙奎醚的化學結構式見圖1。

目前針對戊乙奎醚光學異構體對M受體亞型作用的研究較少。筆者在本研究中利用分子對接等計算機模擬技術研究戊乙奎醚的4個光學異構體與M1～M5受體的結合狀況，為揭示戊乙奎醚的作用靶點及藥效選擇性提供參考。

圖1 戊乙奎醚的化學結構式Fig 1 Chemical structures of penehyclidine

1 材料

高性能計算工作站（28核心56線程處理器，64 GB內(nèi)存）；Accelrys Discovery Studio（v 3.1）軟件包；Chem Office 2014等分子模擬軟件。

2 方法

2.1 配體的準備

利用Chem Office 2014軟件包中的Chem Bio Draw 14.0.0.117軟件繪制戊乙奎醚的分子結構，另存為標準延時格式文件（.sdf）；然后利用Discovery Studio（v 3.1）軟件包，將戊乙奎醚分子結構進行加氫處理，并生成三維構象和立體異構體，并進行能量最小化處理，保留能量最小化的分子構象。采用能量參數(shù)的CHARMm進行能量最小化。

2.2 M1～M4受體蛋白的準備

M1、M2、M3已有三維結構的報道，可以從蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫（PDB，網(wǎng)址為http：//www.rcsb.org）中下載。M4雖然沒有完整序列的三維結構，但在PDB數(shù)據(jù)庫中收載有涵蓋M4序列479個氨基酸中的392個氨基酸序列的M4同源蛋白的三維結構，該結構序列涵蓋了M4受體活性位點，因此也可替代M4受體進行研究。

從PDB中下載M1～M4受體蛋白的晶體數(shù)據(jù)，PDB編號分別為5CXV、3UON、4DAJ、5DSG。將上述下載的晶體文件利用Discovery Studio軟件包的Prepare Protein模塊進行蛋白晶體的數(shù)據(jù)的預處理，刪除晶體中的水分子和非結合離子，保留蛋白鏈和小分子配體，修復缺失的氨基酸殘基，加氫和分配電荷，并對局部環(huán)區(qū)（Loop）進行CHARMm能量最小化處理，以滿足分子對接的要求。

2.3 同源建模構建M5受體蛋白

M5受體目前暫未有三維結構的報道，但具有眾多的同源蛋白片段的三維結構報道，因此，可采用同源建模的方法獲得M5受體的三維結構。

由于M5受體蛋白僅有一級結構的氨基酸序列已知，尚無三維結構的報道，故本文采用蛋白質(zhì)建模門戶網(wǎng)站（PMP，網(wǎng)址為 http：//www.proteinmodelportal.org）提供的在線建模服務進行M5受體蛋白的建模，將多個建模結果進行對比，并優(yōu)選出最佳的三維模型用于分子對接。

2.4 分子對接

分別利用Discovery Studio軟件打開“2.2”項下預處理后的M1～M4蛋白PDB文件，選擇PDB文件中的原抑制劑小分子配體，以該配體坐標為中心，半徑9 ?（1 ?＝10－10m）的球體范圍定義為對接位點，同時將對接位點球體內(nèi)的原配體分子刪除。對于M5受體，本研究采用3D Ligand Site的web服務（網(wǎng)址為http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/3dligandsite）來確定蛋白三維模型的配體結合位點[7]，然后利用Discovery Studio將其定義為對接位點，半徑同樣設定為9 ?。

分子對接采用Discovery Studio軟件包中的CDOCKER模塊進行。載入上述經(jīng)預處理并定義了對接位點的M1～M5受體蛋白分子，同時指定經(jīng)過預處理的包含戊乙奎醚4個光學異構體的配體文件，指定對接位點球體坐標。對接參數(shù)設置如下：Top Hits 10；Pose Cluster Radius 0.5；Random Conformations 100；Dynamics Steps 1 000；Dynamics Target Temperature 1 000；Orientations to Refine 10；Maximum Bad Orientations 800；Orientation vdW Energy Threshold 300；Heating Steps 2 000；Heating Target Temperature 700；Cooling Steps 5 000；Cooling Target Temperature 300；Forcefield CHA-RMm；Grid Extension 8.0；Ligand Partial Charge Method Momany-Rone，Random Number Seed 314 159；Final Minimization Full Potential；Final Minimization Gradient Tolerance 0；設置并行計算，56線程。

2.5 對接的準確性判斷

利用已知的蛋白-配體復合物結構，將配體小分子利用程序對接到受體蛋白，然后比較配體的實驗構象與對接構象之間的差別[8-9]，以均方根差（RMSD）表示。如果兩種構象之間的RMSD≤2 ?，通常認為所使用的對接方法是準確可靠的，能夠準確地將該受體與其配體分子進行準確對接[10]。

2.6 結合能計算

結合能（Binding energy）是表示配體與受體結合時釋放出的能量，或者說將配體與受體從結合狀態(tài)分離成游離狀態(tài)需要提供的能量，是用來表示配體對受體親和力的參數(shù)，一般以kcal/mol（1 kcal＝4.186 8 kJ）為單位。本研究利用Discovery Studio的Calculate Binding Energies模塊計算戊乙奎醚與各受體分子對接的復合物的結合能。主要參數(shù)為：Maximum Alignment RMSD 2 ?；Maximum Conformations 2 000；Electrostatics Spherical Cutoff；Nonbond List Radius 14.0；Nonbond Higher Cutoff Distance 12.0；Nonbond Lower Cutoff Distance 10.0；Partial Charge Estimation Momany-Rone。結合能越高表示受體與配體的親和性越好，如果藥物對某個亞型受體的親和性明顯高于對其他亞型受體，則說明該藥物對該受體具有良好選擇性。

3 結果與分析

3.1 M5受體的同源建模結果

經(jīng)過PMP網(wǎng)站的蛋白建模服務，在所得的M5受體的三維模型中，經(jīng)過對比分析，選擇最佳的模型為Phyre2的模型。其三維結構見圖2。

圖2 同源建模所得M5受體三維結構Fig 2 3D structure of M5receptor by homology modeling

該模型采用了PDB編號為 2rh1、4rnb、3pds、3eml、3rze、4zwj、4djh、3odu、3pbl、3v2y、4grv、3vw7、3oe6、3sn6、4u16、4iar、4eiy、4ib4等 18個蛋白為同源模板，87%的殘基置信區(qū)間超過95%。

69個氨基酸殘基通過從頭計算方式建模，配體結合位點通過Sitemap程序搜索，最終確定結合位點為ASP110、Ser114、TYR111、ASN459等殘基所在的活性口袋結構。

3.2 分子對接結果

所有分子對接結果均在可接受的范圍內(nèi)（RMSD＜2 ?），戊乙奎醚的4個光學異構體均能對接到M1受體的配體結合部位，但各異構體與M1受體蛋白活性口袋中氨基酸殘基的作用模式是有差異的。配體在受體活性口袋中采取的構象不同，構象的能量就有差異，與周圍氨基酸殘基的作用方式不同也導致配體與蛋白的非鍵作用有差異，從而形成配體與受體親和力的差異。以M1受體的分子對接為典型，結果見圖3。

圖3 戊乙奎醚光學異構體與M1受體的分子對接示意圖Fig 3 Molecular docking diagram of penehyclidine optical isomers with M1receptor

3.2.1 戊乙奎醚光學異構體與M1受體的對接結果 光學異構體R1分子中的N原子上的孤對電子與M1受體的TYR106、TRP378、TYR404 等殘基構成 P-π共軛，與ASP105殘基形成鹽橋作用；3位苯環(huán)與TRP378殘基形成了π-π共軛的疏水作用；3位羥基則與ASN382殘基形成氫鍵作用。R2分子中的N原子與M1受體的TYR106、SER109、TRP378、TYR404 殘 基 構 成 P-π 共 軛 ，與ASP105形成鹽橋作用；3位苯環(huán)與TYR381殘基形成π-π共軛的疏水作用；3位羥基與ASN382殘基形成氫鍵作用。S1分子中的N原子與TYR381、TYR404殘基構成P-π共軛，與ASP105殘基形成鹽橋作用；3位苯環(huán)與TRP378殘基構成π-π共軛；3位羥基與ASN382殘基形成氫鍵作用。S2采取的是另一種構象，其分子中的N原子與TYR381、TYR404殘基構成P-π共軛，與ASP105殘基形成鹽橋作用；3位羥基與ASN382殘基形成氫鍵；3位苯環(huán)與TRP157殘基構成π-π共軛。

3.2.2 戊乙奎醚光學異構體與M2受體的對接結果 4個光學異構體對接到M2受體活性口袋中，基本上為以下作用模式：均以N原子與ASP103殘基形成鹽橋作用，與TRP403、ASN404殘基形成氫鍵作用；3位羥基與ASH404殘基形成氫鍵作用。異構體間作用模式差異表現(xiàn)在N原子與不同氨基酸殘基的共軛作用不同，主要表現(xiàn)為R1與TRP400、TYR104殘基構成P-π共軛；R2除了TRP400和TYR104殘基之外，可與TYR403殘基構成P-π共軛；而S1的N原子則僅與TYR403殘基構成P-π共軛，同時3位苯環(huán)未與殘基有π-π共軛；S2的N原子共軛作用情況與S1類似，但3位苯環(huán)與TYR104殘基構成π-π共軛。

3.2.3 戊乙奎醚光學異構體與M3受體的對接結果 光學異構體R1與R2主要通過N原子與ASP147殘基形成鹽橋作用，與TYR529和TYR148殘基構成P-π共軛；3位羥基與ASN507殘基形成氫鍵，與M3活性口袋中的殘基發(fā)生作用。除此之外，R1的3位苯環(huán)與TYR503殘基構成了π-π共軛，而R2則無此作用。S1、S2與R1、R2的結合模式不同在于N原子與TYR529和TYR506殘基有P-π共軛，且3位苯環(huán)未顯示π-π共軛。

3.2.4 戊乙奎醚光學異構體與M4受體的對接結果 4個異構體在M4活性空腔內(nèi)均以3位羥基與ASN417殘基形成氫鍵作用；不同的是，3位苯環(huán)和N原子與空腔內(nèi)殘基的作用有所區(qū)別。其中R1的3位苯環(huán)與TRP413殘基構成π-π共軛，N原子與TRP413、TYR113及TYR439殘基構成P-π共軛。R2除了和R1存在同樣的作用外，N原子還與SER116殘基形成氫鍵作用。S1的不同之處在于N原子與TYR439和TYR416殘基構成P-π共軛，同時還與ASP112殘基形成鹽橋作用。S2則是N原子與TYR439、TRP413、TYR416殘基構成P-π共軛，3位苯環(huán)未見與周圍殘基的共軛作用。

3.2.5 戊乙奎醚光學異構體與M5受體的對接結果 光學異構體R1在M5受體蛋白活性空腔內(nèi)3位羥基與ASN459殘基形成氫鍵作用；N原子與SER114殘基形成氫鍵作用，與TYR111殘基構成P-π共軛，與ASP110殘基形成鹽橋作用。R2作用模式為N原子與TYR111和TRP455殘基構成P-π共軛，與ASP110殘基形成氫鍵作用。S1的3位羥基與ASN459殘基形成氫鍵作用，N原子與TYR458、TYR111殘基構成P-π共軛，與ASP110殘基形成鹽橋作用；3位苯環(huán)取代基與TRP162殘基形成π-π共軛的疏水作用。S2則是通過N原子與TYR458、TRP455TYR111殘基構成P-π共軛，同時與ASP110殘基形成氫鍵作用；3位苯環(huán)取代基與TYR459殘基形成π-π共軛的疏水作用。

3.2.6 結合能計算結果 戊乙奎醚各光學異構體與M受體各亞型蛋白的分子對接的結合能計算結果見表1。

表1 戊乙奎醚光學異構體與M受體亞型的結合能計算結果Tab 1 Calculation results of binding energy of penehyclidine optical isomers to M receptor subtypes

由表1可以看出，戊乙奎醚與M3受體具有較大的結合能，4個光學異構體與M3的結合能在5 736.519～5 907.143 kcal/mol之間，遠高于其他M受體亞型，預示各光學異構體均對M3受體具有較強的親和性，各異構體均可能是有效的M3受體抑制劑。而對M1受體，各異構體表現(xiàn)了較大的差異，其中R1與M1的結合能最大，為1 190.04 kcal/mol；而S2與M1的結合能最小，為－46.765 kcal/mol，意味著S2與M1的結合是耗能過程，需要外界提供能量；R2、S1與M1的結合能較小，且有一定的差異，分別為503.610、149.997 kcal/mol。以上結果說明R1可能是有效的M1受體抑制劑，R2和S1可能僅有較弱抑制作用，而S2可能對M1受體無抑制作用。對于M4受體，R1、R2和S1結合能均為負值，僅S2為正值，但較小，僅為93.666 kcal/mol，說明戊乙奎醚對M4受體可能沒有抑制作用或僅有極微弱的抑制作用。對M5受體，R1和R2結合能為負值，S1和S2結合能僅為249.351、196.463 kcal/mol，說明R1和R2可能對M5受體沒有抑制作用，S1和S2可能僅有較微弱的抑制作用。對M2受體，各異構體均表現(xiàn)出較弱的親和力，其結合能在387.549～663.312 kcal/mol之間。

從戊乙奎醚光學異構體對各M受體亞型的結合能對比來看，R1與M3結合能最大，M1其次，M2較弱，M4和M5結合能為負值，即R1對M受體的各亞型表現(xiàn)出明顯選擇性，對M3受體親和性最強，其次是M1受體，對M2受體親和力較弱，而對M4和M5受體無親和性。R2和S1則僅對M3受體顯示較強親和性，對M1和M2受體僅有微弱親和性，對M4和M5受體無親和性。S2則對M3受體親和性較強，對M4和M5受體親和性較微弱，而對M1受體無親和性。

4 討論

小分子藥物發(fā)揮作用的結構生物學基礎是藥物分子結合到特定受體蛋白的活性位點，促使受體蛋白的功能激活或喪失，從而產(chǎn)生特定的生物學效應。戊乙奎醚有2個手性碳原子，即2個手性中心，因此共有4種光學異構體。這些異構體分子量一樣，因此均能進入M受體各亞型的活性空腔中，但在活性空腔中需要采取不同的構象才能與周圍殘基作用。一方面，對于同一個受體亞型，不同異構體由于存在手性中心的原因，其分子基團的朝向不同，需要采取不同構象與殘基結合，因此分子體系的能量就有差異。通過分子對接與結合能的計算來描述這些差異，可揭示光學異構體活性差異發(fā)生的原因。另一方面，通過比較同一異構體分子對M受體不同亞型的結合能，就可以揭示或預測該化合物對M受體亞型的選擇性。分子對接與結合能計算結果表明，戊乙奎醚光學異構體R1對M1和M3受體具有較好的親和性，這與文獻[11]報道的“戊乙奎醚主要對M1和M3受體有作用，對M2受體作用較弱”的結論基本一致。戊乙奎醚對M1受體的結合能計算結果顯示R1與其親和性最強，S2最弱，這一結果也與文獻[12]報道一致。結合能計算結果顯示戊乙奎醚對M4和M5受體亞型無親和性或僅具有微弱親和性，盡管未見相關藥理學報道。

綜上，本文利用同源建模和分子對接的手段對戊乙奎醚光學異構體與M受體各亞型進行了分子模擬研究，部分結果與已知實驗結果一致。本方法可為后續(xù)研究提供一定的參考依據(jù)。

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Study on the Molecular Docking of Penehyclidine Optical Isomers and Muscarinic Receptor Subtypes

ZHANG Lijuan1，BAI Lan1，SHI Jianyou1，HE Jun2
（1.Dept.of Pharmacy，Sichuan Academy of Medical Sciences/Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China；2.Laboratory of Biotherapy，Cancer Center，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu，610041，China）

R914.2

A

1001-0408（2017）25-3506-05

2016-12-13

2017-06-09）

（編輯：劉明偉）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.14

四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院青年科研基金（No.30305030606）；四川大學-瀘州市人民政府戰(zhàn)略合作資金項目（No.2015CDLZ-S10）；電子科技大學中央高?；究蒲袠I(yè)務（No.ZYGX2015J14）。

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥物分析。E-mail：3998911@qq.com

#通信作者：助理研究員，博士。研究方向：小分子藥物。E-mail：Jun_He@scu.edu.cn