氣相色譜法測(cè)定替格瑞洛原料藥中6種殘留溶劑*

杜 娟，魏雙艷，徐曉陽(yáng)，陰兆靜，張瑋杰，李惠舉，徐 霞

鄭州大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室 鄭州 450001

氣相色譜法測(cè)定替格瑞洛原料藥中6種殘留溶劑*

杜 娟，魏雙艷，徐曉陽(yáng)，陰兆靜，張瑋杰，李惠舉，徐 霞#

鄭州大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室 鄭州 450001

替格瑞洛原料藥；毛細(xì)管氣相色譜法；殘留溶劑

目的：建立替格瑞洛原料藥中6種殘留溶劑的測(cè)定方法。方法采用氣相色譜法檢測(cè)替格瑞洛原料藥中甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異辛烷、乙酸。色譜條件為DB-624(30 m×0.320 mm×1.8 mm)毛細(xì)管柱；載氣采用高純氮?dú)猓魉贋? mL/min；檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為250 ℃(空氣流速)，進(jìn)樣口溫度為200 ℃；程序升溫，分流比201。結(jié)果6種有機(jī)溶劑在各自的檢測(cè)質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.998 31～0.999 99)，平均回收率為91.49%～100.48%(RSD=2.85%～7.17%，n=9)；甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異辛烷、乙酸的定量限分別為7.92、7.89、6.29、0.90、0.23、4.20 mg/L，檢測(cè)限分別為1.98、0.99、0.79、0.22、0.08、1.05 mg/L。用該方法測(cè)定3批次替格瑞洛原料藥，只有乙酸乙酯和異辛烷被檢出但均符合標(biāo)準(zhǔn)，其他殘留溶劑未檢測(cè)到。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于替格瑞洛原料藥中上述6種殘留溶劑的測(cè)定。

替格瑞洛(ticagrelor)是一種新型環(huán)戊基三唑嘧啶類口服抗血小板藥物，作用于血小板細(xì)胞膜上的嘌呤2受體(purinoceptors 2，P2)亞型P2Y12，對(duì)二磷酸腺苷(ADP)引起的血小板聚集有明顯的抑制作用。替格瑞洛為非前體藥，是一種可逆的P2Y12受體抑制劑[1-5]。氣相色譜技術(shù)是藥品中殘留溶劑測(cè)定的首選技術(shù)，相關(guān)的應(yīng)用不斷地深入和更新[6-13]。據(jù)研究[14-16]替格瑞洛原料藥在合成過程中使用了甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異辛烷、乙酸等有機(jī)溶劑，而這些溶劑大部分屬于二類、三類受控毒性溶劑。因此，為保證藥品質(zhì)量和用藥安全，在制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)必須考慮該原料藥中有機(jī)溶劑殘留問題。按照2015年版《中國(guó)藥典》(二部)要求及人用藥品注冊(cè)技術(shù)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)有機(jī)溶劑殘留量指導(dǎo)原則，作者建立了基于毛細(xì)管色譜法、測(cè)定和驗(yàn)證替格瑞洛原料藥中上述6種有機(jī)溶劑的檢測(cè)方法，為替格瑞洛制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1原料、儀器與試劑配備氫火焰離子化檢測(cè)器的Agilent 7890B型氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，NewClassic MF型電子分析天平。替格瑞洛原料藥(由鄭州大學(xué)藥物合成實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)150901、160301、160501)，甲醇和乙腈(質(zhì)譜級(jí)，J.T.Baker)，乙醇和乙酸乙酯(優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，異辛烷(優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF，色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.2檢測(cè)方法的建立色譜柱為DB-624 (30 m×0.320 mm×1.80 mm)毛細(xì)管柱。采用程序升溫法：初始溫度40 ℃維持10 min，以50 ℃/min的速率升溫至160 ℃維持4 min。以氮?dú)鉃檩d氣，流速1 mL/min，尾吹10 mL/min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；氫火焰離子化檢測(cè)器溫度250 ℃(空氣流速)；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL，分流比201。

1.3溶液的制備①空白溶液：精密量取DMF 1 mL，置于進(jìn)樣瓶中，作為空白溶液。②對(duì)照品儲(chǔ)備液：分別精密稱取甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異辛烷、乙酸適量于含有適量DMF的25 mL容量瓶中，充分振搖溶解，加DMF稀釋至刻度，搖勻，配置成1 mL含有甲醇0.792 mg、乙醇0.789 mg、乙腈0.786 mg、乙酸乙酯0.897 mg、異辛烷0.692 mg和乙酸1.05 mg的混合溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。③對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25 mL置25 mL容量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。④供試品溶液：取替格瑞洛原料藥0.16 g,精密稱定，置于2.0 mL容量瓶中，加DMF 2 mL振搖使之溶解，搖勻，作為供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)取對(duì)照品和供試品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果顯示，溶劑DMF不干擾測(cè)定，理論塔板數(shù)均不低于5 000，各相鄰物質(zhì)色譜峰的分離度均大于1.5。

1：甲醇;2.乙腈;3.乙醇;4.乙酸乙酯;5.異辛烷;6.乙酸。 圖1 對(duì)照品(上)和供試品(下)溶液的毛細(xì)管氣相色譜圖

2.2線性關(guān)系、檢出限和定量限分別取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mL于2 mL容量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述溶液各1 mL置于進(jìn)樣瓶中，按照1.2項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣。分別以甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異辛烷、乙酸的質(zhì)量濃度(c)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖及結(jié)果，直至信噪比為101和31，即得定量限和檢測(cè)限。結(jié)果見表1。由表1可知，6種有機(jī)溶劑c在檢測(cè)范圍內(nèi)與A均呈良好的線性關(guān)系，表明該方法可靠。

2.3加樣回收率精密稱取9份樣品(批號(hào)160501)，每份0.16 g，至2 mL容量瓶，分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液0.016、0.020、0.024 mL,再分別用DMF稀釋至刻度，按1.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖及結(jié)果，計(jì)算各有機(jī)溶劑的加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.4重復(fù)性取同一批樣品(批號(hào)160501)5份，每份0.16 g，精密稱定，按1.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果甲醇、乙醇、乙腈、異辛烷、乙酸均未檢測(cè)出,乙酸乙酯平均含量為0.000 2%，RSD=1.27%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5樣品含量的測(cè)定取3個(gè)批號(hào)的替格瑞洛原料藥各0.16 g，按1.2和1.3進(jìn)行溶液配制和上樣檢測(cè)，結(jié)果甲醇、乙醇、乙腈、乙酸均未檢測(cè)到，乙酸乙酯和異辛烷檢測(cè)結(jié)果見表3。

表1 6種有機(jī)溶劑線性關(guān)系、檢出限和定量限

表2 6種有機(jī)溶劑的加樣回收率

續(xù)表2

表3 樣品有機(jī)溶劑含量

3 討論

3.1藥物殘留有機(jī)溶劑測(cè)定的必要性藥物殘留有機(jī)溶劑測(cè)定對(duì)于控制藥品質(zhì)量、保證用藥安全、指導(dǎo)生產(chǎn)工藝改進(jìn)都具有重要意義。根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版(二部)要求及ICH的有關(guān)規(guī)定：藥物中甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、乙酸的限度分別為0.3%、0.5%、0.041%、0.5%、0.5%；異辛烷屬于第四類溶劑尚無足夠的毒理學(xué)資料，如需在生產(chǎn)中使用這些溶劑，一般按未知單雜的限度控制，即大部分是0.1%。該研究中，用所建立的氣相色譜法檢測(cè)3個(gè)批號(hào)的替格瑞洛原料藥中殘留的有機(jī)溶劑，甲醇、乙醇、乙腈、乙酸均未檢測(cè)到，乙酸乙酯和異辛烷的濃度在方法的線性方法內(nèi)且含量也在限度范圍內(nèi)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3.2色譜柱及色譜條件的選擇由于這6種有機(jī)溶劑極性存在差異，因此不能在同一色譜條件下使用同一根色譜柱進(jìn)行分離。在實(shí)驗(yàn)過程中，作者比較了不同極性色譜柱的分離效果，如強(qiáng)極性的DB-624、中等極性的DB-WAX和弱極性的HP-5-MS等毛細(xì)管柱。結(jié)果顯示，在HP-5-MS上色譜峰拖尾嚴(yán)重，并且乙酸與DMF溶劑并未分離；在DB-WAX色譜柱上雖然各個(gè)色譜峰實(shí)現(xiàn)了分離，但色譜峰拖尾嚴(yán)重，并且所確定的檢測(cè)限很高，若采用此色譜柱，所配置的樣品的濃度很高，不能滿足分析的要求。

甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯的沸點(diǎn)范圍較窄(66.7～78.4 ℃)。由于色譜柱的溫度對(duì)待測(cè)組分的分離影響較大，因此實(shí)驗(yàn)中評(píng)定色譜柱的起始溫度分別為30、35、40、50、60、70 ℃，升溫速率分別為10、20、30、40、50 ℃/min,最高溫度150、160、180、200、220 ℃，觀察色譜峰形、分離度等。結(jié)果顯示，以40 ℃為初溫、升溫速率為50 ℃/min、最高溫度為160 ℃時(shí)的色譜峰形尖銳美觀，分離效果好。最終選擇能實(shí)現(xiàn)這6種有機(jī)溶劑分離測(cè)定的DB-624毛細(xì)管柱，各待測(cè)成分互不干擾，整個(gè)分析過程在16.4 min內(nèi)完成，快速簡(jiǎn)便。

3.3溶劑的選擇及溶液的制備由于替格瑞洛在合成中使用了各種有機(jī)溶劑，待測(cè)溶劑種類繁多，極性差異較大，而且大多數(shù)的合成藥物在DMF中均有較好的溶解，故選用溶解性好、沸點(diǎn)高且較為常用的DMF作為溶劑。在該實(shí)驗(yàn)色譜條件下，DMF在待測(cè)組分之后出峰，不干擾其他組分測(cè)定。對(duì)照品儲(chǔ)備液應(yīng)使各待測(cè)成分包含于該溶劑的線性范圍內(nèi)，故建議樣品的濃度為80.0 g/L。由于多數(shù)有機(jī)溶劑的揮發(fā)性強(qiáng)，尤其是沸點(diǎn)低的溶劑，每次測(cè)定樣品所用的對(duì)照品溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配以確保定量的準(zhǔn)確。

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(2016-12-09收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Determination of six residual solvents in ticagrelor raw material by capillary gas chromatography

DUJuan，WEIShuangyan,XUXiaoyang,YINZhaojing,ZHANGWeijie,LIHuiju,XUXia

DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

ticagrelor raw material;capillary gas chromatography;residual solvent

Aim: To develop a method for the content determination of residual solvents in ticagrelor raw material including methanol,ethanol,acetonitrile,ethyl acetate,isooctane,and acetic acid.Methods: Capillary gas chromatography was adopted.The determination was performed on DB-624(30 m×0.320 mm×1.8 mm) capillary column, a flame ionization detector(FID) and the external standard method were used for the separation and quantitative analysis．The condition was that the injector temperature was 200 ℃, the FID temperature was 250 ℃ and the residual organic solvents were determined by the split injection mode. Results: The good linear range of the 6 kinds of residual solvents had been obtained(r=0.998 31-0.999 99) with average recoveries of 91.49%-100.48%(RSD=2.85%-7.17%,n=9).The limits of quantification of the 6 kinds of residual solvents were 7.92,7.89,6.29,0.90,0.23 and 4.20 mg/L; the detection limits were 1.98,0.99,0.79,0.22,0.08 and 1.05 mg/L .The proposed method was successfully applied to analyze the residual organic solvent in the real sample of ticagrelor raw material, and the results showed that only ethyl acetate and isooctane were detected in the samples. Conclusion: The method is rapid, stable and repeatable for the content determination of the 6 kinds of residual solvents in ticagrelor raw material.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.026

*河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目 142300410085；鄭州市國(guó)際科技合作與交流項(xiàng)目 153PGJHZ204

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#通信作者，女，1995年4月生，博士，教授，研究方向：藥物分析，E-mail:xuxia@zzu.edu.cn