不同促排卵與激素替代治療方案對(duì)人種植窗期子宮內(nèi)膜LIF、IL-1β與整合素αVβ3表達(dá)的影響*

譚 麗,劉昕媛,楚喜英,盧 娜,項(xiàng)云改,宋玉霞,李朋粉

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖中心 鄭州 450014

不同促排卵與激素替代治療方案對(duì)人種植窗期子宮內(nèi)膜LIF、IL-1β與整合素αVβ3表達(dá)的影響*

譚 麗△,劉昕媛,楚喜英,盧 娜,項(xiàng)云改,宋玉霞,李朋粉

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖中心 鄭州 450014

誘發(fā)排卵；控制性超促排卵；激素替代治療；子宮內(nèi)膜容受性

目的：探討誘發(fā)排卵、控制性超促排卵(COH)、激素替代治療(HRT)方案對(duì)人種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的影響。方法選取60例取消移植的患者作為研究對(duì)象。20例為自然周期排卵，10例為誘發(fā)排卵，20例為COH方案，10例采用HRT方案。每個(gè)方案分別于排卵后第5、6天(D5、D6)采集半數(shù)研究對(duì)象的內(nèi)膜，免疫組化SP法檢測(cè)LIF、IL-1β與整合素αVβ3蛋白的表達(dá)。結(jié)果相同方案的D5與D6內(nèi)膜間比較，3種蛋白的表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。誘發(fā)排卵組、COH組、HRT組3種蛋白在內(nèi)膜中的相對(duì)表達(dá)量均低于自然周期組，其中誘發(fā)排卵組最低，HRT組高于COH組(P<0.05)。結(jié)論HRT方案對(duì)人種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的影響最小。

輔助生育技術(shù)已經(jīng)問(wèn)世三十余年，但是臨床妊娠率仍然偏低(30%～60%)[1]。輔助生育技術(shù)中所用的誘發(fā)排卵、控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)、激素替代治療(hormone replacement therapy，HRT)等方案可能會(huì)使患者體內(nèi)的性激素超出生理水平，從而降低子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致妊娠失敗。因此，近年來(lái)子宮內(nèi)膜容受性成為生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。胚胎著床是通過(guò)多種免疫因子、細(xì)胞因子、黏附分子等的調(diào)控來(lái)完成的[2]，例如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、整合素αVβ3等。多項(xiàng)研究[3-5]表明，上述因子在子宮內(nèi)膜中的高表達(dá)時(shí)間與種植窗開(kāi)放時(shí)間同步，因此可以認(rèn)為其是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物。該研究以LIF、IL-1β及整合素αVβ3為觀察指標(biāo)，比較了誘發(fā)排卵方案、COH方案以及HRT方案對(duì)人種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的影響，為優(yōu)化臨床用藥方案提供更加可靠的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡22～30歲，基礎(chǔ)內(nèi)分泌在正常范圍，月經(jīng)周期規(guī)律(27～33 d)，不孕原因?yàn)檩斅压芤蛩睾?或)男方因素，近3個(gè)月內(nèi)無(wú)宮腔操作史，未服用激素類(lèi)藥物，術(shù)前簽署經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：陰超提示子宮內(nèi)膜不均或息肉，采樣日內(nèi)膜厚度<8 mm，宮腔積液、積血，子宮內(nèi)膜異位癥與子宮腺肌病，女方染色體異常等疾病，標(biāo)本送病檢結(jié)果異常，輸卵管造影或B超提示輸卵管積水。根據(jù)上述納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，選取2014年6月至2015年12月于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖中心經(jīng)誘發(fā)排卵后因卵泡發(fā)育多而改行體外受精(invitrofertilization，IVF)/卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)助孕，取卵后取消移植的患者；或經(jīng)COH長(zhǎng)方案促排卵后接受IVF/ICSI助孕，取卵后為預(yù)防卵巢過(guò)度刺激取消移植的患者；以及經(jīng)HRT方案調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜，但本周期取消凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)的患者(胚胎解凍后，因損傷無(wú)胚胎可移植或因患者社會(huì)原因而無(wú)法移植者)。以月經(jīng)周期規(guī)律、排卵正常、未用任何藥物者為對(duì)照。

1.2試驗(yàn)分組①對(duì)照(自然周期)：月經(jīng)第10天開(kāi)始連續(xù)陰超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，排卵后第5、6天采集內(nèi)膜，分別為自然周期D5組、自然周期D6組，每組各10例。② HRT：10例采用HRT方案。月經(jīng)第2天開(kāi)始口服雌二醇(E2)片4 mg/d，第8天加量至6 mg/d，第10天開(kāi)始監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)(月經(jīng)第15～19天)加用黃體酮肌內(nèi)注射80 mg/d，連續(xù)6 d，于加用黃體酮后第5、6天取子宮內(nèi)膜，分別為HRT D5組、HRT D6組，每組各5例。③ COH：20例采用COH方案。黃體中期開(kāi)始垂體降調(diào)節(jié)，皮下注射短效曲普瑞林(達(dá)必佳，輝林制藥)0.1 mg/d，7 d后減為0.05 mg/d，降調(diào)14 d后加用促性腺激素(gonadotrophin,Gn)，肌內(nèi)注射FSH 150～225 IU/d，適時(shí)添加HMG，Gn總量不超過(guò)300 IU/d。當(dāng)3個(gè)以上卵泡直徑≥18 mm時(shí)停用達(dá)必佳和Gn，并于當(dāng)晚肌內(nèi)注射HCG 10 000 IU，36 h后取卵，取卵后肌內(nèi)注射黃體酮80 mg/d，直至樣本采集。于取卵后第5、6天取子宮內(nèi)膜組織，分別為COH D5組、COH D6組，每組各10例。④誘發(fā)排卵：10例采用誘發(fā)排卵方案。月經(jīng)第5 天開(kāi)始肌內(nèi)注射Gn(FSH或HMG)150 IU/d，靈活調(diào)整用量，一般不超過(guò)225 IU/d。當(dāng)2個(gè)以上卵泡直徑達(dá)18 mm且出現(xiàn)LH峰時(shí)停用Gn，當(dāng)晚肌內(nèi)注射HCG 5 000～10 000 IU，36 h后取卵，取卵后肌內(nèi)注射黃體酮60 mg/d，直至樣本采集。取卵后第5、6天取子宮內(nèi)膜分別為誘發(fā)排卵D5組、誘發(fā)排卵D6組，每組5例。

1.3標(biāo)本采集患者取截石位，常規(guī)外陰、陰道與宮頸消毒，探針探查宮腔，隨后用子宮內(nèi)膜取樣器在宮腔中上段抽吸少量?jī)?nèi)膜組織，經(jīng)無(wú)菌生理鹽水漂洗后，分成兩份，一份送病理檢查，一份用于LIF、IL-1β、整合素αVβ3 的檢測(cè)。

1.4子宮內(nèi)膜組織中LIF、IL-1β、整合素αVβ3的檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本取材后迅速固定于甲醛溶液中，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制成蠟塊，然后4 μm厚切片，進(jìn)行SP法免疫組化染色，按試劑盒(美國(guó)Santa Gruz公司、武漢博士德生物工程有限公司)說(shuō)明操作。依次二甲苯脫蠟，高至低濃度乙醇復(fù)水，抗原熱修復(fù)，滴加體積分?jǐn)?shù)3% H2O2以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，滴加正常山羊血清，封閉內(nèi)源性生物素，滴加一抗及生物素標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，抗體稀釋度為1100)，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。淺棕黃色、棕黃色、深棕黃色著色分別判定為弱陽(yáng)性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性。每張切片選擇5個(gè)高倍視野(×400)，采用Biosens Digital Imaging System v1.6測(cè)定細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性區(qū)積分光密度(integral optical density，IOD)值，計(jì)算5個(gè)視野的IOD平均值，用來(lái)表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。4個(gè)處理組間目的蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；同一處理D5組和D6組的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組間一般情況的比較8組內(nèi)膜經(jīng)病理檢查，均確定為分泌期內(nèi)膜，未見(jiàn)特殊病理情況。8組年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH以及取樣日內(nèi)膜厚度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 各組間一般情況的比較

2.2子宮內(nèi)膜組織中LIF、IL-1β、整合素αVβ3的表達(dá)情況3種蛋白均主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜的腔上皮與腺上皮細(xì)胞的胞漿中。在誘發(fā)排卵組與COH組中染色為淺棕黃色，呈弱陽(yáng)性表達(dá)；在HRT組中染色為棕黃色，呈陽(yáng)性表達(dá)；在自然周期組中染色為

表2 子宮內(nèi)膜組織中LIF的相對(duì)表達(dá)量

*:與自然周期比較，P<0.01；#:與HRT比較，P<0.01；△:與COH比較，P<0.01。

深棕黃色，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。子宮內(nèi)膜組織中3種蛋白表達(dá)的比較見(jiàn)表2～4。各處理方案D5和D6間比較，3種蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3種蛋白的表達(dá)量為誘發(fā)排卵

表3 子宮內(nèi)膜組織中IL-1β的相對(duì)表達(dá)量

*:與自然周期比較，P<0.01；#:與HRT比較，P<0.01；△:與COH比較，P<0.01。

表4 子宮內(nèi)膜組織中整合素αVβ3的相對(duì)表達(dá)量

*:與自然周期比較，P<0.01；#:與HRT比較，P<0.01；△:與COH比較，P<0.01。

3 討論

3.1不同用藥方案對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響卵巢分泌的E2與孕酮(P)是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜發(fā)育的最基本因素。有學(xué)者[5]指出，排卵前適度的E2與排卵后P的黃體支持是內(nèi)膜容受性建立的基礎(chǔ)，合適的E2/P比例及P持續(xù)影響的時(shí)間是關(guān)鍵所在。

誘發(fā)排卵方案是在早卵泡期就給予Gn進(jìn)行促排卵。在大量激素作用下，體內(nèi)E2在早期就開(kāi)始遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)生理水平，這使得卵泡期LH過(guò)高、內(nèi)源性LH峰提前，相應(yīng)的P含量也會(huì)提前升高，導(dǎo)致E2/P比例不當(dāng)，因此會(huì)損傷子宮內(nèi)膜容受性。

COH中，標(biāo)準(zhǔn)的GnRH-α長(zhǎng)方案開(kāi)始于超排卵之前，在前一月經(jīng)周期的黃體中期即開(kāi)始應(yīng)用GnRH-α進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)，抑制了LH峰的出現(xiàn)，改善了卵子的質(zhì)量，因此對(duì)種植窗和子宮內(nèi)膜容受性有所改善。黃荷鳳等[6-7]的研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)GnRH-α預(yù)處理后行超排卵，黃金地鼠的子宮內(nèi)膜種植窗期與自然周期基本相似；而未經(jīng)其預(yù)處理的單一PMSG超排卵的黃金地鼠種植窗期與自然狀態(tài)差距明顯。這也說(shuō)明COH(GnRH-α長(zhǎng)方案)與單純超排卵相比，對(duì)于子宮內(nèi)膜容受性的傷害更小。

HRT是模擬人的自然生理周期，使用雌孕激素序貫療法來(lái)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)，以達(dá)到開(kāi)放種植窗的目的。此方案可使體內(nèi)E2/P比例達(dá)到較適宜的水平，與超排卵及COH方案相比，更接近生理水平，避免了超高量的激素所產(chǎn)生的嚴(yán)重不良影響。但HRT中的激素水平可能仍會(huì)比自然周期稍高，在一定程度上影響子宮內(nèi)膜容受性。

該研究結(jié)果顯示：誘發(fā)排卵組、COH組、HRT組子宮內(nèi)膜組織中LIF、IL-1β及整合素αVβ3的相對(duì)表達(dá)量均低于自然周期組，且誘發(fā)排卵組最低，而HRT組高于COH組，說(shuō)明這三種方案均會(huì)降低子宮內(nèi)膜容受性，但HRT方案優(yōu)于COH與誘發(fā)排卵，誘發(fā)排卵方案的不良影響最大。這一結(jié)果與其他學(xué)者們的研究[8-9]結(jié)果相同，更進(jìn)一步驗(yàn)證了此結(jié)論的可靠性。

3.2不同用藥方案對(duì)種植窗開(kāi)放時(shí)間的影響多數(shù)研究[4-5]表明，在促排卵周期中，大量激素會(huì)導(dǎo)致種植窗開(kāi)放時(shí)間較自然周期提前1～2 d。但HRT對(duì)其影響目前尚存在爭(zhēng)議，有些學(xué)者[10]認(rèn)為HRT會(huì)使種植窗延遲，另有學(xué)者[11]認(rèn)為它不會(huì)對(duì)種植窗開(kāi)放時(shí)間產(chǎn)生明顯影響。

該研究對(duì)各方案的D5與D6內(nèi)膜中3種蛋白的表達(dá)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，無(wú)論哪種方案，D5與D6內(nèi)膜3種蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與其他學(xué)者的結(jié)果有所不同，可能原因有以下幾點(diǎn)：①D5、D6時(shí)間較接近。延長(zhǎng)間隔時(shí)間并且多取幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，也許會(huì)發(fā)現(xiàn)明顯差異。②實(shí)驗(yàn)條件稍有欠缺，未能聯(lián)合電鏡掃描觀察胞飲突。③樣本量較小。④不同方案可能會(huì)使種植窗范圍擴(kuò)大，只觀察D5、D6可能不足以判斷出種植窗開(kāi)放是提前還是推遲。

綜上所述，在促排卵過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)內(nèi)膜情況、胚胎情況、激素水平及卵巢大小等充分評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性及患者安全性，當(dāng)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜容受性下降，應(yīng)采取全胚冷凍，之后再根據(jù)適應(yīng)證選擇自然周期方案或HRT方案進(jìn)行[12-15]FET，從而提高受孕幾率。

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(2016-12-25收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effects of different ovarian stimulation and hormone replacement therapy on expressions of LIF, IL-1β and integrin αVβ3 in human endometrium during the implantation window

TANLi,LIUXinyuan,CHUXiying,LUNa,XIANGYungai,SONGYuxia,LIPengfen

ReproductiveCenter,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

induced ovulation;controlled ovarian hyperstimulation;hormone replacement therapy;endometrial receptivity

Aim: To observe the outcome of different protocols，induced ovulation, controlled ovarian hyperstimulation(COH) and hormone replacement therapy(HRT), on human endometrial receptivity during the implantation window. Methods: A total of 60 patients were enrolled, among them, 10 cases underwent induced ovulation, 20 cases underwent COH, 10 cases received HRT, and 20 cases were natural ovulation cycle. Ovarian endometrium on the 5th or 6th day(D5 or D6) after ovulation of the half subjects were collected to detect LIF,IL-1β, and integrin αVβ3 by immunohistochemical SP method, respectively. Results: The expressions of these three proteins in endometrium were natural ovulation cycle group>HRT group>COH group>induced ovulation group (P<0.05). The expressions of these three proteins in endometrium on D5 and D6 had no statistical difference(P>0.05). Conclusion: HRT might have the minest injury on the endometrial receptivity.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.022

*河南省教育廳科技攻關(guān)項(xiàng)目 142300410240

R715

△女，1964年4月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：輔助生殖技術(shù)與生殖內(nèi)分泌，E-mail:litan668@126.com