缺氧下膀胱癌細胞黏附能力和侵襲能力的變化*

樊長暉，許長寶， 郝 斌，吳國清，趙興華

鄭州大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450014

缺氧下膀胱癌細胞黏附能力和侵襲能力的變化*

樊長暉，許長寶， 郝 斌，吳國清，趙興華#

鄭州大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450014

膀胱癌；缺氧；黏附；遷移

目的：探討缺氧條件下不同分化膀胱癌細胞5637和T24生物學特性變化。方法將不同分化程度的膀胱癌細胞5637和T24分別置于正常氧濃度條件下(37 ℃, 體積分數(shù)5% CO2和體積分數(shù)21% O2)和缺氧(37 ℃、體積分數(shù)10%O2、體積分數(shù)5% CO2和體積分數(shù)85%N2)環(huán)境中培養(yǎng)，以MTT法和Boyden侵襲小室法檢測兩種膀胱癌細胞在不同環(huán)境下黏附能力和侵襲能力的差異。結果隨著培養(yǎng)時間的延長，缺氧組和對照組5637和T24細胞的黏附率逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；5637和T24細胞黏附率在缺氧24 h與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但缺氧48 h和72 h兩種細胞的黏附能力均高于對照組(P<0.05)；缺氧組5637和T24細胞的穿膜細胞數(shù)均高于對照組(P<0.001)。結論缺氧條件下膀胱癌細胞的黏附和遷移能力增強。

膀胱癌(bladder cell carcinoma，BCC)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。較高的發(fā)病率、復發(fā)率以及較差的自然病程預后是臨床診斷和治療中經(jīng)常遇到的難題。近期有研究[1]表明，缺氧在惡性腫瘤的侵襲轉移過程中起著重要的作用。作者在體外模擬缺氧環(huán)境，觀察膀胱癌細胞在缺氧條件下黏附和遷移能力的變化。

1 材料與方法

1.1主要材料人中分化移行細胞癌細胞系5637、低分化移行細胞癌細胞系T24(購自中國科學院上海細胞研究所)，人工基膜Matrigel膠(購自北京大學醫(yī)學部細胞生物學實驗室)，四甲基偶氮唑藍(MTT，購自美國Sigma公司)，Boyden Chamber小室(購自江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)，RPMI 1640細胞培養(yǎng)基(購自Gibco公司)，胎牛血清(FBS，購自美國Hyclone公司)。

1.2膀胱癌細胞5637和T24細胞黏附能力的MTT法檢測取兩組對數(shù)生長期的膀胱癌細胞5637和T24，調(diào)整細胞濃度為1×105mL-1的細胞懸液，取96孔培養(yǎng)板，每孔加用RPMI 1640稀釋Matrigel膠10 μL，凝固成膠后紫外線消毒滅菌，取0.2 mL單細胞懸液加入制成的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)，每種細胞均在正常氧濃度(37 ℃, 體積分數(shù)5% CO2和體積分數(shù)21% O2)和缺氧(37 ℃、體積分數(shù)10% O2、體積分數(shù)5% CO2和體積分數(shù)85%N2)環(huán)境中培養(yǎng)(培養(yǎng)24、48和72 h)，每組均設6個平行孔。吸出各組細胞培養(yǎng)液及懸浮細胞，加入無血清RPMI 1640 0.2 mL繼續(xù)培養(yǎng)120 min，加入20 μL MTT培養(yǎng)4 h，加DMSO 200 μL，用自動酶標讀數(shù)儀測定每孔吸光度(A)值。按MTT比色法測定各孔細胞的A值，以對照組基底膜組貼壁細胞A值為參照。按公式計算細胞黏附率。黏附率(%)=[實驗組細胞A值/對照組細胞A值-1] ×100%。

1.3膀胱癌細胞5637和T24侵襲能力的Boyden小室法檢測取缺氧條件下培養(yǎng)48 h的膀胱癌細胞5637和T24備用。Boyden小室的下室趨化因子為200 μL/室人成纖維細胞無血清條件培養(yǎng)基。上下室之間用直徑為13 mm、微孔為8 μm的聚碳酸酯膜(PVP Free)，膜上鋪Matrigel膠(用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋)。分別取以上2組細胞，用RPMI 1640調(diào)整濃度至1×106mL-1，上室內(nèi)滴入上述細胞懸液400 μL/室(即4×105個細胞/室)。37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)12～24 h。小心將聚碳酸酯膜取出，用濕棉簽輕輕擦去膜表面未侵襲的細胞，在室溫下用體積分數(shù)95%乙醇固定，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片。每種細胞均設正常氧濃度對照組和缺氧實驗組(培養(yǎng)48 h)，每組設5個平行樣本。高倍鏡下計數(shù)侵襲到濾膜背面的穿膜細胞數(shù)，每張聚碳酸酯膜選取6個視野，計數(shù)每個視野(200倍光鏡下)的穿膜細胞數(shù)，以穿膜細胞的相對數(shù)目表示細胞侵襲力的大小。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 23.0進行分析。應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較缺氧對膀胱癌細胞5637和T24細胞體外黏附的影響，采用兩獨立樣本的t檢驗比較缺氧條件下膀胱癌細胞5637和T24細胞侵襲能力的變化。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1缺氧對膀胱癌細胞5637和T24細胞體外黏附的影響見表1。實驗結果顯示，與正常氧濃度對照組相比，缺氧24 h后5637 和T24細胞的黏附能力無明顯變化(P>0.05)，缺氧48 h和72 h后2種細胞的黏附能力明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 不同缺氧時間對膀胱癌細胞黏附率的影響(n=6) %

2.2缺氧條件下膀胱癌細胞5637和T24細胞侵襲能力的變化高倍鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下5637細胞組穿膜細胞數(shù)(42±4)高于正常氧濃度對照組(19±2)(t=86.229，P<0.001)；缺氧條件下T24細胞組的穿膜細胞數(shù)(48±5)明顯高于正常氧濃度對照組(20±3)(t=42.882，P<0.001)。

3 討論

缺氧是實體腫瘤微環(huán)境的重要特點。腫瘤細胞具有增殖快、代謝高的特性，所以氧氣的消耗遠遠大于正常細胞，造成微環(huán)境中的氧含量下，降導致缺氧[2]。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，腫瘤周圍氧含量較正常組織中低。缺氧是重要的微環(huán)境因素，導致腫瘤惡性轉化、疾病的進展、腫瘤的異質(zhì)性、免疫逃逸和治療抵抗[4-5]。腫瘤組織內(nèi)部的缺氧，促進腫瘤眾多惡性表型的發(fā)生和細胞的去分化，也可誘導下游眾多基因的表達發(fā)生改變，從而誘導腫瘤新生血管的生成和抗凋亡能力的形成，并促進腫瘤侵襲和轉移的發(fā)生[6]。根據(jù)腫瘤分化越低、惡性度越高、預后較差的特點，一致的觀點是缺氧誘導的去分化引起腫瘤的異質(zhì)性使腫瘤細胞發(fā)生惡性轉化，增加了腫瘤細胞的侵襲性。因此作者體外制備缺氧的環(huán)境，觀察不同分化來源的膀胱癌細胞(中分化的膀胱移行細胞癌細胞系5637、低分化的移行細胞癌細胞系T24)在缺氧環(huán)境中的生物學特性，以此為臨床上阻止膀胱癌侵襲和轉移的治療提供充分的理論依據(jù)。

結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，缺氧24 h時兩種不同分化的膀胱癌細胞的黏附能力及侵襲力差異無統(tǒng)計學意義，而缺氧48 h后兩種細胞黏附力及侵襲力較對照組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義，提示膀胱癌細胞缺氧處理后黏附能力和移行能力均有明顯增強，表明缺氧可能促使膀胱癌細胞活力增加。

總之，作者的研究結果顯示，缺氧條件下膀胱癌細胞的黏附和遷移能力增強，隨著研究的進一步深入，抗缺氧有望成為一個新的抗腫瘤治療的靶點。

[1] REN Y,HAO P,LAW SK,et al.Hypoxia-induced changes to integrin α 3 glycosylation facilitate invasion in epidermoid carcinoma cell line A431[J].Mol Cell Proteomics,2014,13(11):3126

[2] HARRIS AL. Hypoxia:a key regulatory factor in tumour growth[J].Nat Rev Cancer,2002,2(1):38

[3] CASAZZA A,DI CONZA G,WENES M,et al.Tumor stroma: a complexity dictated by the hypoxic tumor microenvironment[J].Oncogene,2014,33(14):1743

[4] FERREIRA JA, PEIXOTO A, NEVES M, et al. Mechanisms of cisplatin resistance and targeting of cancer stem cells: adding glycosylation to the equation[J]. Drug Resist Updat,2016,24:34

[5] CHOUAIB S,NOMAN MZ,KOSMATOPOULOS K,et al.Hypoxic stress: obstacles and opportunities for innovative immunotherapy of cancer[J].Oncogene,2017,36(4):439

[6] CHAFFER CL, WEINBERG RA. A perspective on cancer cell metastasis[J].Science,2011,331(6024):1559

[7] JOU YC,TSAI YS,LIN CT,et al.Foxp3 enhances HIF-1α target gene expression in human bladder cancer through decreasing its ubiquitin-proteasomal degradation[J].Oncotarget,2016,7(40):65403

(2017-02-22收稿 責任編輯趙秋民)

Effects of hypoxia on adhesiveness and invasiveness of bladder carcinoma cells

FANChanghui,XUChangbao,HAOBin,WUGuoqing,ZHAOXinghua

DepartmentofUrology,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

bladder carcinoma；hypoxia；adhesiveness；migration

Aim: To study the effects of hypoxia on adhesion and migration of bladder carcinoma cell line 5637 and T24invitro. Methods: The bladder carcinoma cells 5637 and T24 were cultured in hypoxic condition(10%O2,5% CO2,85%N2mixed gas), while those put into 5% CO2,37 ℃ incubator were control group. The influence of hypoxia on the adhesiveness and invasiveness of the 2 kinds of cells were detected by MTT and Boyden method, respectively. Results: The result showed that the adhesiveness ability of 5637 cells and T24 cells was enhanced with culture time in hypoxic condition and the normal oxygen condition(P<0.001). Compared with those cultured in normal oxygen condition, the adhensiveness of the 2 cells cultured in hypoxic condition did not change significantly after 24 h culture(P>0.05)， but increased after 48 or 72 h culture(P<0.05).The migration ability of the 2 kinds of cells was enhanced after cultured in hypoxic condition than that of control group (P<0.001). Conclusion: The adhesiveness and migration ability of bladder carcinoma cells are enhanced in hypoxic condition.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.015

*河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新性人才工程中青年科技創(chuàng)新人才基金資助項目 4118

R737.14

#通信作者，男，1965年10月生，本科，教授，研究方向：泌尿系腫瘤，E-mail：495975452@qq.com