抗CD20單抗在致敏受者異基因造血干細(xì)胞移植中的應(yīng)用

李 丹，王 易，楊金慧

（1.山西省太鋼總醫(yī)院，山西太原030003； 2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇蘇州215003）

抗CD20單抗在致敏受者異基因造血干細(xì)胞移植中的應(yīng)用

李 丹1，王 易2，楊金慧1

（1.山西省太鋼總醫(yī)院，山西太原030003； 2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇蘇州215003）

目的：探討抗CD20單抗（美羅華）在致敏受者造血干細(xì)胞移植預(yù)處理中應(yīng)用后的脫敏效果。方法：5例致敏患兒中3例在造血干細(xì)胞移植預(yù)處理前應(yīng)用美羅華。對比觀察臍血移植后造血重建、供受體DNA短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性分析嵌合度及有無移植物抗宿主?。℅VHD）發(fā)生。結(jié)果：5例患兒造血干細(xì)胞移植后造血完全重建，編號2（未用美羅華）造血重建時間（造血干細(xì)胞移植后65 d）明顯晚于預(yù)處理前使用美羅華患兒（編號3、4、5）；其中2例出現(xiàn)血小板植入延遲，編號1（未用美羅華）血小板植入時間較編號4（經(jīng)美羅華處理患兒）明顯延長；5例供受體穩(wěn)定嵌合；編號1（未用美羅華）出現(xiàn)極重度aGVHD，造血干細(xì)胞移植前應(yīng)用美羅華患兒未出現(xiàn)或僅出現(xiàn)輕至中度aGVHD，編號4出現(xiàn)輕度cGVHD，累及胃腸道，經(jīng)FK506調(diào)整后已明顯好轉(zhuǎn)。目前隨訪中位時間7.5個月，病情穩(wěn)定。結(jié)論：美羅華在致敏受者異基因造血干細(xì)胞移植前應(yīng)用對降低敏感性有一定療效。

異基因造血干細(xì)胞移植；致敏受者；抗CD20單抗

某些血液系統(tǒng)性疾病如再生障礙性貧血、地中海貧血等均依賴長期輸血，造血干細(xì)胞移植是根治此類疾病的有效方法［1-2］。部分患者由于多次輸血，致使體內(nèi)預(yù)存抗HLA抗體及MICA抗體，此類抗體的存在可導(dǎo)致造血干細(xì)胞移植術(shù)后造血系統(tǒng)重建失敗或各種難以逆轉(zhuǎn)的移植物抗宿主病，所以有學(xué)者認(rèn)為輸血致敏是引起移植失敗的重要因素之一［3］。隨著對抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)發(fā)生機制研究的進(jìn)展，近年來針對B細(xì)胞表面抗原的新型藥物不斷出現(xiàn)，使高致敏患者成功接受造血干細(xì)胞移植成為可能。美羅華是一種對B細(xì)胞上特有的CD20抗原具有高親合力的單克隆抗體，本文探討該抗體對致敏患兒脫敏的療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料

接受造血干細(xì)胞移植術(shù)者5例（按造血干細(xì)胞回輸時間先后編號為1～5）。男2例，女3例；中位年齡11歲。原發(fā)病急性白血?。∕2）1例（編號1），再生障礙性貧血4例。其中編號2患兒骨髓涂片診斷再生障礙性貧血，骨髓活組織檢查提示骨髓增生異常綜合征可能，環(huán)孢素正規(guī)治療后仍三系血細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板）減少；編號3系陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿-再生障礙性貧血綜合癥，經(jīng)保守治療效果不佳；編號4系重型再生障礙性貧血，經(jīng)丙種球蛋白、環(huán)孢霉素及兩次抗淋巴細(xì)胞免疫球蛋白治療均無效，移植前有鐵過載并行祛鐵治療；編號5系極重型再生障礙性貧血，經(jīng)環(huán)孢霉素及一次抗淋巴細(xì)胞免疫球蛋白治療效果不理想。供、受者在移植前均進(jìn)行HLA和MICA基因分型、HLA和MICA混合抗體及特異性抗體檢測。所有受者均在移植后接受隨訪。

1.2 方 法

1.2.1 致敏預(yù)存抗體檢測 由江蘇省血研所（美國ASHI認(rèn)證實驗室）采用序列特異寡核苷酸探針（PCR—SSOP）法進(jìn)行HLA和MICA基因分型、免疫磁珠液相芯片技術(shù)檢測抗HLA抗體和MICA抗體。HLA－I類和HLA－Ⅱ類混合抗體陽性的標(biāo)準(zhǔn)是陽性與陰性抗原磁珠的比值＞1.5，MICA混合抗體陽性標(biāo)準(zhǔn)是陽性與陰性抗原磁珠的比值＞2.5。 HLA－I類特異性抗體檢測包括 HLA－A、HLA－B、HLA－Cw，HLA－Ⅱ特異性抗體檢測包括HIA－DRBl、HLA－DQBl，特異性抗體百分率≥10%為陽性。

1.2.2 造血干細(xì)胞移植情況 造血干細(xì)胞移植受者1例輸注同胞全相合外周造血干細(xì)胞，1例輸注同胞全相合骨髓，2例輸注雙份無血緣全相合臍血，1例輸注雙份無血緣4/6相合臍血。具體情況見表1。臍血均來自于上海臍帶血造血干細(xì)胞庫，且均經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、臍血本身及母親血傳染病檢測，凍存干細(xì)胞復(fù)溫后于當(dāng)天回輸。2例HLA抗體和MICA抗體陽性受者患兒（編號3、4）于造血干細(xì)胞移植預(yù)處理第1天單次應(yīng)用美羅華，編號5用美羅華后因HLA－A抗體滴度下降不理想加用1次，并行血漿置換。美羅華應(yīng)用方法：美羅華375 mg/m2，靜脈點滴 6～8 h，滴速為 50 mg/h，以每30 min增加25 mg/h的幅度逐步加量，直至最大滴速400 mg/h。輸注美羅華前給予異丙嗪及甲潑尼龍，甲潑尼龍與美羅華同步維持靜脈點滴，在移植預(yù)處理第一天使用。在靜脈滴注美羅華過程中密切觀察有無不良反應(yīng)，如發(fā)生不良反應(yīng)，暫時減慢或停止輸注。

1.2.3 移植后造血重建的監(jiān)測 定期評估造血重建及供受體嵌合DNA短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）。評估造血重建標(biāo)準(zhǔn)：中性粒細(xì)胞連續(xù)3 d≥0.5×109/L為粒細(xì)胞植入；血小板連續(xù)7 d≥20×109/L為血小板植入；血小板植入時間延長：血小板植入時間晚于移植后30 d；繼發(fā)性血小板植入失?。涸谘“逶l(fā)植入后，出現(xiàn)血小板水平再次下降至植入標(biāo)準(zhǔn)以下（低于20×109/L）并再次依賴血小板輸注。供受體嵌合度評估：根據(jù)供者來源的造血細(xì)胞植入狀態(tài)，一般將造血嵌合體分為3種類型：當(dāng)供者細(xì)胞占據(jù)受者的骨髓或外周血百分比＞95%時，即供者細(xì)胞完全植入時，稱為完全嵌合；若移植后受者細(xì)胞仍出現(xiàn)在骨髓或外周血中，可以同時檢測到供者和受者兩種細(xì)胞成分，供者細(xì)胞占5%～95%，稱為混合嵌合；微嵌合則是指供者細(xì)胞＜5%。

1.2.4 移植后并發(fā)癥評估 造血干細(xì)胞移植后并發(fā)癥主要包括移植物抗宿主病、植入綜合癥等。按照西雅圖Glucksberg分級系統(tǒng)與國際骨髓移植登記處（IBMTR）積分法判斷aGVHD嚴(yán)重程度。

2 結(jié)果

2.1 造血干細(xì)胞移植前輸血量及預(yù)存HLA抗體和MICA抗體情況

患兒造血干細(xì)胞移植前輸注成分血的情況見表2。移植前HLA抗體陰性1例（編號2）；HLA混合抗體陽性，但HLA特異性抗體未能分離1例（編號3）；HLA混合抗體及特異性抗體均陽性2例（編號1、5）；僅HLA－Ⅱ類特異性抗體陽性1例（編號 4）；MICA 抗體陽性 2例（編號 2、4），具體致敏抗體種類及見表3。

表1 5例患兒基本情況

表2 患兒造血干細(xì)胞移植前輸血情況

2.2 不良反應(yīng)

3例患兒應(yīng)用美羅華過程順利，輸注前后均無過敏反應(yīng)及低熱、低血壓、心動過速等不良反應(yīng)。

2.3 造血干細(xì)胞移植后造血重建時間

5例患兒造血功能均成功重建，2例患兒出現(xiàn)血小板植入延遲（編號1、4），編號1患兒血小板植入時間較編號4明顯延長，編號2造血重建時間（造血干細(xì)胞移植后65 d）明顯晚于預(yù)處理前使用美羅華患兒（編號3、4、5）。結(jié)果見表4。

2.4 移植后并發(fā)癥評估結(jié)果

編號4和編號5于造血干細(xì)胞移植后1 w左右出現(xiàn)植入綜合癥，經(jīng)糖皮質(zhì)激素處理后好轉(zhuǎn)。由表5可以看出，編號1出現(xiàn)極重度aGVHD，造血干細(xì)胞移植前應(yīng)用美羅華患兒（編號3、4、5）未出現(xiàn)或僅出現(xiàn)輕至中度aGVHD。截止2012年10月20日，隨訪中位時間為7.5個月，100 d內(nèi)均無aGVHD復(fù)發(fā)，病例4出現(xiàn)輕度cGVHD，累及胃腸道，經(jīng)FK506調(diào)整后已明顯好轉(zhuǎn)，余4例均未出現(xiàn)cGVHD。5例患兒均在免疫抑制劑減量階段。結(jié)果見表5。

3 討論

1958年Dausset等發(fā)現(xiàn)多次接受輸血的患者存在不同特異性的白細(xì)胞抗體，用這些抗體所鑒定出的不同特異性白細(xì)胞抗原，稱為人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）。HLA 分子的主要生理作用是將抗原遞呈給T細(xì)胞，對誘導(dǎo)體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)起重要作用。由于紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板表面存在HLA抗原，人可因妊娠或多次輸血等原因使受血者體內(nèi)產(chǎn)生HLA抗體。MICA基因?qū)儆诜墙?jīng)典HLA-I類樣分子，其組成、表達(dá)和產(chǎn)物與HLA-I類基因不同。由MICA介導(dǎo)的排斥反應(yīng)常表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的破壞和重塑，出現(xiàn)血管特征性的結(jié)構(gòu)改變，最終可能導(dǎo)致血管的完全閉塞［4］，這種表現(xiàn)多在慢性排斥中發(fā)現(xiàn)。HLA抗體與MICA抗體的存在不僅直接導(dǎo)致造血干細(xì)胞移植后出現(xiàn)移植物抗宿主病，也會引起造血重建不良，進(jìn)而影響患者的總體預(yù)后。

19世紀(jì)七十年代，國外有學(xué)者對再生障礙性貧血進(jìn)行骨髓移植中發(fā)現(xiàn)，移植前受者體內(nèi)存有致敏抗體組比無致敏抗體組易于發(fā)生骨髓移植后排斥反應(yīng)，并認(rèn)為此致敏抗體可作為預(yù)測造血干細(xì)胞移植排斥的一項指標(biāo)［5］。同時也有研究表明，致敏與急、慢性排斥反應(yīng)、供者干細(xì)胞植入及長期存活率均有密切關(guān)系［6］。本研究中編號1臍血移植后血小板植入顯著延遲，發(fā)生Ⅳ級GVHD可能與移植前預(yù)存混合性及特異性HLA-I、Ⅱ抗體且未予干預(yù)治療和行雙份4/6相合臍血移植均有關(guān)系；編號4、5患兒在臍血移植前篩查示致敏抗體陽性，盡管輸注雙份全相合臍血，但仍出現(xiàn)血小板植入延遲及輕～中度移植物抗宿主病，這可能與多方面因素有關(guān)，如臍血移植本身較骨髓移植造血重建晚；輸注雙份臍血可能出現(xiàn)雙份臍血干細(xì)胞植入競爭；患兒體內(nèi)的HLA-Ⅱ類抗體和MICA抗體滴度偏高。但該2例患兒出現(xiàn)急性移植物抗宿主病，藥物可以控制，而且造血系統(tǒng)成功重建，均可能與移植前預(yù)處理中應(yīng)用的美羅華脫敏等干預(yù)治療有關(guān)，移植后期是否會出現(xiàn)慢性移植物抗宿主病，需繼續(xù)密切觀察隨訪。

表3 患兒預(yù)存致敏抗體情況

表4 造血系統(tǒng)重建時間（d）

表5 異基因造血干細(xì)胞移植后aGVHD

美羅華是一種對B細(xì)胞特有CD20抗原具有高親合力的單克隆抗體，最早于1997年應(yīng)用于治療復(fù)發(fā)及難治性非霍奇金淋巴瘤，近年來在高致敏移植受者的脫敏治療、抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)、移植后淋巴細(xì)胞增生性疾?。≒TLD）、及ABO血型不符患者的移植中起著重要的作用。在聯(lián)合血漿置換、免疫球蛋白治療的同時，對高致敏患者應(yīng)用美羅華已成為一種脫敏治療的重要方法。它清除B細(xì)胞可能以三種方式起作用：補體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)（CDC）；藥物誘導(dǎo)B細(xì)胞凋亡；抗體依賴的細(xì)胞毒反應(yīng)（ADCC）。有國外學(xué)者應(yīng)用CD20單抗美羅華及血漿置換等方法干預(yù)處理4例致敏受者，發(fā)現(xiàn)有2例患者血清抗體滴度明顯下降，異基因骨髓細(xì)胞在致敏受者體內(nèi)植入獲得成功，而另外2例血清滴度仍保持高滴度水平的患者，移植后均出現(xiàn)造血干細(xì)胞移植排斥［7］。Genberg H等［8］對49例患者術(shù)前使用單次劑量美羅華（375 mg／m2）后，發(fā)現(xiàn)患者外周血 CDl9、CD20 B淋巴細(xì)胞計數(shù)從術(shù)后24 h開始減少，3～6 w時外周血CDl9、CD20 B淋巴細(xì)胞耗竭，并可維持14～16個月，說明該方法不僅起效快，且維持時間長。同時有臨床報道聯(lián)合應(yīng)用美羅華與血小板輸注，可成功促進(jìn)造血干細(xì)胞在致敏受者的植入［9］，提示應(yīng)用美羅華有望成為解決血小板植入延遲的新策略。本研究前期由于監(jiān)測水平限制，雖除編號5患兒外，其余4例患兒HLA-Ⅱ類抗體及MICA抗體滴度于造血干細(xì)胞移植前后均未予評估，但患兒造血干細(xì)胞移植后的造血植入時間和排異程度也間接地反應(yīng)美羅華具有一定的療效。

近年來已有美羅華造成遲發(fā)性中性粒細(xì)胞減少的報道，但并無感染增加的情況出現(xiàn)［10］，本研究中5例患兒在移植后出現(xiàn)巨細(xì)胞病毒波動性感染是否與美羅華或其他免疫抑制藥物有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。

總之，本研究中使用了美羅華聯(lián)合丙種球蛋白及血漿置換，使高致敏患者成功接受異基因造血干細(xì)胞移植3例，避免了移植相關(guān)死亡的發(fā)生，移植術(shù)后近期結(jié)果顯示是有效、安全的，但致敏患者接受此種聯(lián)合治療的遠(yuǎn)期預(yù)后仍需進(jìn)一步觀察?？笴D20單抗在體液免疫中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，而如何在致敏受者合理應(yīng)用抗CD20單抗以促進(jìn)異基因造血干細(xì)胞的植入還有待進(jìn)一步研究。本研究的病例數(shù)僅5例，研究的結(jié)論還需擴大病例數(shù)并監(jiān)測致敏抗體水平得以證實。

［1］Walters M C，Sullivan K M.Stem-cell transplantation for sickle cell disease［J］.N Engl J Med，2010，362（10）：955-956.

［2］Isgrò A，Gaziev J，Sodani P，et a1.Progress in hematopoietic stem cell transplantation as allogeneic cellular gene therapy in thalassemia［J］.Ann N Y Acad Sci，2010，1202：149-154.

［3］Kobayashi T，Maruya E，Niwa M，et al.Significant association between chronic antibody-mediated rejection and donor-specific antibodies against HLA-DRB rather than DQB in renal transplantation［J］.Hum Immunol，2011，72（1）：11-17.

［4］姚站馨，解金輝.MICA：一種重要的移植免疫抗原［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18（16）：1 952-1 954.

［5］Glckman E.Pretransplant lymphocytotoxins and bone-marrow graft rejection［J］.Lancet，1978，1（8 061）：443.

［6］Locatellli F.Reduced-intensity regimens in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for hemoglobinopathies［J］.Hematology Am Soc Hematol Educ Program，2006，260（103）：398-401.

［7］Ciurea S O，de Lima M，Cano P，et al.High risk of graft failure in patients with anti-HLA antibodies undergoing haploidentical stem-cell transplantation［J］.Transplantation，2009，88（8）：1 019-1 024.

［8］Genberg H，Hansson A，Wernerson A，et al.Pharmacodynamics of rituximab in kidney allotransplantation［J］.Am J Transplant，2006，6（10）：2 418-2 428. ［9］Narimatsu H，Wake A，Miura Y，et al.Successful engraftment in crossmatch-positive HLA-mismatched peripheral blood stem cell transplantation after depletion of antidonor cytotoxic HLA antibodies with rituximab and donor platelet infusion［J］.Bone Marrow Transplant，2005，36（6）：555-556.

［10］Mitsuhata N，F(xiàn)ujita R，Ito S，et al.Delayed-onset neutropenia in a patient receiving rituximab as treatment for refractory kidney transplantation［J］.Transplantation，2005，80（9）：1 355.

（編輯：張世霞）

Application of anti-CD20 monoclonal antibody in sensitized receptor who will be treated with umbilical cord blood transplantation

Li Dan1，Wang Yi2，Yang Jinhui1
（1.General Hospital of TISCO，Taiyuan Shanxi 030003；2.Children′s Hospital of Soochow University，Suzhou Jiangsu 215003）

Objective：To evaluate the effect of anti-CD20 monoclonal（RTX）antibody in sensitized recipients of hematopoietic stem cells transplantation.Methods：Three of five children

RTX before allo-geneic hematopoietic stem cells transplantation （HSCT）.Hematopoietic reconstitution，chimerism level of genetic polymorphisms of short tandem repeats between donator and recipients，graft-versus-host disease were observed after implantation.Results：5 cases had hematological recovered after transplantation successfully.Two of them had delayed platelet engraftment.Number 1 case developed severe acute graft-versus-host disease（aGVHD），but other 3 cases who received RTX before transplantation did not appear or only appeared light to moderate aGVHD.Number 4 case who appeared mild cGVHD，involving the gastrointestinal，has improved significantly after the FK506 adjustment.Now they are all in stable condition.Conclusion：RTX has certain curative effect on allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in sensitized receptor.

allogeneic hematopoietic stem cell transplantation；sensitized receptor；anti-CD20 monoclonal antibody

R733

：A

：1671-0258（2017）03-0035-05

李丹，碩士，E-mail：lidanxu912113r@163.com

楊金慧，主任醫(yī)師