脂肪干細胞對小鼠放射性唾液腺損傷的治療作用

王濤，強艷麗

(勝利油田中心醫(yī)院，山東東營 257034)

脂肪干細胞對小鼠放射性唾液腺損傷的治療作用

王濤，強艷麗

(勝利油田中心醫(yī)院，山東東營 257034)

目的探討脂肪干細胞對小鼠放射性唾液腺損傷的治療作用。方法選取10只健康雄性C3H小鼠作為脂肪干細胞供體，分離培養(yǎng)小鼠脂肪干細胞。選取30只雌性C3H小鼠并隨機分為空白組、單射組和治療組各10只；單射組、治療組予以15 Gy放射線照射小鼠頭頸部，制作放射性唾液腺損傷模型；空白組不照射。照射后1周，治療組小鼠給予脂肪干細胞注射，每周2次，連續(xù)2周；對照組和單放組經(jīng)尾靜脈注射等量的PBS。分別于照射后1、5、10周測定唾液分泌率。照射后10周收集小鼠下頜下腺，并測定腺體占體質(zhì)量的比例、腺泡細胞面積以及細胞增殖率。結(jié)果脂肪干細胞注射后，治療組小鼠唾液流量逐漸上升，在放射后10周，治療組高于單射組(P<0.05)?？瞻捉M小鼠腺泡細胞表面積占下頜下腺總表面積的百分比為72%±10%，治療組為65%±13%，單射組為34%±9%,空白組和治療組腺泡細胞表面積均高于單射組(P均<0.05)?？瞻捉M唾液腺細胞增值率為10.0%±0.12%，單射組為3.6%±0.14%,治療組為8.1%±0.18%,單射組唾液腺細胞的增殖率低于治療組、空白組(P均<0.05)。結(jié)論脂肪干細胞能夠明顯改善放射損傷的唾液腺功能，促進唾液分泌，提高腺體細胞的增殖率。

脂肪來源干細胞；唾液腺；放射性損傷；小鼠

唾液腺損傷是頭頸部腫瘤患者放射治療的常見并發(fā)癥[1]，可引起口干、口腔黏膜炎、猖獗性齲以及味覺和進食障礙，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2,3]。目前，臨床上還沒有十分有效的唾液腺損傷防治手段[4]。脂肪來源干細胞(ADS)作為一種重要的間充質(zhì)干細胞，具有成骨、成脂、成軟骨分化、自我復制以及免疫調(diào)節(jié)等生物學功能[5]。脂肪細胞因其提取方法簡單和干細胞密度高等優(yōu)勢被廣泛應用于醫(yī)學組織工程領(lǐng)域。2016年7～12月，我們從小鼠脂肪組織中提取干細胞并移植到放射性唾液腺損傷模型小鼠體內(nèi)，觀察其對放射性損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：10只健康雄性C3H小鼠作為脂肪干細胞供體。30只放射性唾液腺損傷雌性C3H小鼠隨機分為空白組、單射組、治療組各10只。所有小鼠均為8周齡，體質(zhì)量18～23 g。主要試劑及儀器：醫(yī)用直線加速器(Varian Clinic Trilogy)、PAS染色試劑盒(美國Sigma公司)、PCNA染色試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.2 小鼠脂肪干細胞體外分離培養(yǎng)及鑒定 8周齡雄性C3H小鼠脫頸處死后從腹股溝處取脂肪組織。脂肪組織用含有5%青、鏈霉素的PBS沖洗3遍后，切成小塊，以0.075%的I型膠原酶在37 ℃恒溫搖床消化1 h，加入相同體積的α-MEM+20%胎牛血清中和消化酶。吸管反復吹打以充分分離細胞，2 000 g離心10 min以分離脂肪組織和細胞沉淀物，棄上清。加入細胞培養(yǎng)液重懸細胞，接種在T-75培養(yǎng)瓶中，每3 d換液1次。取第3代培養(yǎng)小鼠脂肪干細胞分別用成脂和成骨誘導液進行誘導分化21 d，再分別用油紅O和茜素紅染色鑒定成脂和成骨誘導分化情況[6]。顯示脂肪干細胞鏡下呈成纖維細胞樣形態(tài)，經(jīng)誘導后可分化成脂肪細胞和成骨細胞。

1.3 放射線照射及干細胞注射 雌性C3H小鼠腹腔注射苯巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉。小鼠頭部充分暴露于放射野內(nèi)，其余部位用鉛板遮擋。單射組、治療組予以15 Gy放射線照射；空白組操作步驟同單射組、治療組，但直線加速器不運行。放射損傷后1周，治療組小鼠接收干細胞治療。取80%融合的第3代小鼠脂肪干細胞，0.25%胰蛋白酶消化離心后重懸于PBS中，細胞密度為1×106/100 μL。經(jīng)尾靜脈注射100 μL細胞懸液至干小鼠體內(nèi)，每周2次，連續(xù)2周?？瞻捉M、單射組小鼠不接受干細胞懸液注射。

1.4 唾液分泌率及唾液腺質(zhì)量測定 于照射前及照射后1、5、10周測定小鼠唾液分泌量。苯巴比妥鈉麻醉小鼠，皮下注射毛果蕓香堿(2 mg/kg)后將小鼠傾斜固定。將分血器一端置于小鼠口角，另一端置于預稱量0.5 mL離心管中，收集唾液10 min，之后將離心管稱重，計算唾液分泌率。10周后小鼠脫頸處死，取下頜下腺稱量，計算下頜下腺占體質(zhì)量的百分比；然后組織浸入4%多聚甲醛溶液中固定，脫水石蠟包埋。

1.5 唾液腺細胞表面積及細胞增殖率檢測 將石蠟包埋的標本切片，常規(guī)脫臘水化。按照試劑盒說明方法進行PAS染色，200倍光學顯微鏡下觀察拍照。用ImageJ軟件計算腺泡細胞表面積占整個標本面積的百分比。5 μm厚石蠟切片常規(guī)脫臘水化，熱抗原修復后，按常規(guī)免疫組化步驟染色，400倍光學顯微鏡下觀察拍照。用ImageJ軟件計算唾液腺細胞增殖率。

2 結(jié)果

2.1 三組唾液分泌率 單射組、治療組小鼠在照射后1周唾液分泌率下降至空白組的50%，與空白組比較有統(tǒng)計學差異(P均<0.05)。治療組接受干細胞移植后，唾液分泌率逐漸上升，至照射后10周接近空白組；而單純照射組持續(xù)下降。照射后10周，治療組唾液分泌率高于單射組(P<0.05)。如圖1。

圖1 脂肪干細胞治療對小鼠唾液分泌率的影響

2.2 三組唾液腺質(zhì)量占體質(zhì)量的百分比 照射后10周，空白組小鼠下頜下腺占體質(zhì)量的百分比為0.40%±0.09%，治療組為0.37%±0.07%，單射組為0.3%±0.06%。三組唾液腺質(zhì)量占體質(zhì)量的百分比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.3 三組唾液腺組織學及腺泡細胞表面積變化 PAS染色組織學形態(tài)顯示，單射組在照射后10周出現(xiàn)大量纖維化組織，腺泡細胞嚴重萎縮，組織間質(zhì)內(nèi)可見炎性細胞浸潤。而空白組和治療組小鼠唾液腺組織結(jié)構(gòu)保存完整清晰，導管及腺泡細胞排列致密?？瞻捉M小鼠腺泡細胞表面積占下頜下腺總表面積的百分比為72%±10%，治療組為65%±13%，單射組為34%±9%；空白組和治療組腺泡細胞表面積均高于單射組(P均<0.05)，治療組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 三組唾液腺細胞增殖率 空白組唾液腺細胞增值率為10.0%±0.12%，單射組為3.6%±0.14%。治療組為8.1%±0.18%；單射組唾液腺細胞的增殖率低于治療組、空白組(P均<0.05)，治療組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

唾液腺功能損傷是頭頸部腫瘤放射治療的常見并發(fā)癥之一。Nagler[7]研究表明，放射線能夠造成腺泡細胞DNA損傷，從而失去增殖能力，成為放射性損傷后期惡化的主要原因。Savage等[8]也提出低劑量的放射線能夠?qū)е录毎蛲?，高劑量的放射線則直接導致組織壞死。另外放射治療引起的炎癥反應也能夠破壞唾液腺實質(zhì)細胞。另外有研究提出放射線能夠誘導脂肪過氧化反應，從而損傷腺泡細胞內(nèi)的分泌顆粒，產(chǎn)生自由基，最終導致細胞溶解[9]。但是此研究結(jié)果不能解釋患者在反射性損傷早期腺泡細胞大量凋亡前就出現(xiàn)唾液腺功能減低的癥狀。于是又有研究提出放射線能夠破壞細胞膜上M受體介導的唾液分泌，從而導致?lián)p傷初期唾液流量急劇下降[10]。

目前臨床上唾液腺功能損傷多以保守治療為主，M受體激動劑(如毛果蕓香堿)常用于刺激患者唾液分泌。然而放射性損傷后期，大部分腺泡細胞損失，此類藥物效果有限。另外，藥物治療常伴隨多種不良反應，如惡心、腹瀉及盜汗等，也限制了藥物的長期應用[11]。盡管新的放療方法能夠降低對唾液腺的損傷，如調(diào)強放療, 但仍有40%患者有放射后唾液腺功能損傷[12]。因此徹底修復唾液腺功能的治療方法一直是實驗室研究的熱點。目前，多種來源的干細胞被用來修復放射性唾液腺損傷，包括骨髓基質(zhì)干細胞和唾液腺來源的間充質(zhì)干細胞。近期研究表明干細胞能夠分泌多種細胞因子、生長因子以及其他活性成分，參與到組織損傷的修復過程中[13]。有研究者分別報道了全骨髓細胞和骨髓來源的間充質(zhì)干細胞用于治療放射性唾液腺損傷[14,15]。但是，骨髓干細胞分離技術(shù)復雜，對供體創(chuàng)傷大，且有可能引起嚴重并發(fā)癥。脂肪干細胞提取分離步驟簡單，患者依從性高。而且脂肪組織的干細胞密度較骨髓組織高。因此脂肪組織作為干細胞的另一重要來源被廣泛應用于再生修復醫(yī)學中。

唾液分泌率是反映唾液腺功能的重要指標，唾液分泌減低是口干綜合癥患者主要臨床癥狀。本研究顯示，照射后1周內(nèi)單純照射組唾液分泌率約為空白組的50%，說明放射性唾液腺損傷小鼠模型建立成功。干細胞治療組與對照組唾液分泌率無差異，說明脂肪干細胞能夠修復小鼠唾液腺功能，顯著提高唾液分泌率。腺泡細胞是唾液腺內(nèi)唯一分泌唾液水成分的部位，它也分泌了85%的唾液蛋白成分[16]，腺泡細胞的數(shù)量決定了放射損傷后期唾液分泌的量。本研究顯示脂肪干細胞治療能夠降低放射線對腺泡細胞的損傷。增殖細胞核抗原對細胞增殖啟動有重要作用，是增殖細胞的常用標記物之一。本研究觀察放射線照射后10周的小鼠唾液腺細胞增值率，顯示單射組低于空白組，說明放射線能夠破壞唾液腺內(nèi)組織干細胞，減少其增殖能力，從而進一步導致了腺泡細胞的表面積減少。脂肪干細胞移植可以保護腺體細胞，促進干細胞的分化增殖，從而修復放射對腺體造成的損傷。

綜上所述，脂肪干細胞能夠明顯改善放射損傷的唾液腺功能，促進唾液分泌，提高腺體細胞的增殖率，有望將來用于臨床治療放療引起的唾液腺功能損傷。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.010

R739.87

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強艷麗(E-mail：kqqiangyanli@163.com)

2017-05-19)