結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗聯(lián)合腺苷脫氨酶檢測診斷結(jié)核性胸膜炎的價值

吳景秋 房宏霞 蔚鳴 許鑫鑫 岳治國 劉玉琴 侯艷杰

·論著·

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗聯(lián)合腺苷脫氨酶檢測診斷結(jié)核性胸膜炎的價值

吳景秋 房宏霞 蔚鳴 許鑫鑫 岳治國 劉玉琴 侯艷杰

目的分析結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(T-SPOT.TB)聯(lián)合腺苷脫氨酶(ADA)檢測診斷結(jié)核性胸膜炎的價值。方法對2015年1—12月黑龍江省傳染病防治院確診或臨床診斷為結(jié)核性胸膜炎的145例患者和非結(jié)核性胸膜炎的59例患者進(jìn)行回顧性分析。204例患者均于治療前進(jìn)行了胸腔積液T-SPOT.TB和ADA檢測及外周血T-SPOT.TB檢測；對患者胸腔積液T-SPOT.TB、胸腔積液ADA、外周血T-SPOT.TB單獨(dú)檢測，以及胸腔積液T-SPOT.TB與胸腔積液ADA聯(lián)合檢測的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果胸腔積液T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度(98.62%，143/145)高于外周血T-SPOT.TB(88.97%，129/145)和胸腔積液ADA(87.59%，127/145)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.61，P<0.001；χ2=13.75，P<0.001)；胸腔積液ADA檢測的特異度(91.53%，54/59)均高于胸腔積液T-SPOT.TB(64.41%，38/59)和外周血T-SPOT.TB(61.02%，36/59)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.63，P<0.001；χ2=15.17，P<0.001)；將胸腔積液T-SPOT.TB與ADA聯(lián)合檢測和胸腔積液T-SPOT.TB單獨(dú)檢測進(jìn)行比較，診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度由98.62%(143/145)降低至86.21%(125/145)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.94，P<0.001)，但特異度由64.41%(38/59)升高至100.00%(59/59)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.55，P<0.001)。結(jié)論胸腔積液T-SPOT.TB檢測結(jié)核性胸膜炎具有較高的敏感度和特異度，胸腔積液T-SPOT.TB和ADA聯(lián)合檢測可明顯提高診斷的特異度。

結(jié)核, 胸膜； 胸腔積液； 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測； 腺苷脫氨酶； 診斷改善

資料和方法

一、研究對象和試劑來源

1. 研究對象：2015年1—12月期間，我院依據(jù)結(jié)核性胸膜炎診斷指南確診或臨床診斷為結(jié)核性胸膜炎的患者145例(結(jié)核組)、非結(jié)核性胸膜炎患者59例(對照組)。其中，男128例，女76例；年齡7～91歲，平均年齡(46.88±19.24)歲。分別收集入院治療前第一次抽取的外周血和胸腔積液進(jìn)行T-SPOT.TB檢測，以及胸腔積液進(jìn)行ADA檢測的結(jié)果，進(jìn)行回顧性分析。

2. 結(jié)核性胸膜炎診斷分組及標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)核性胸膜炎：參照中華醫(yī)學(xué)會《臨床診療指南：結(jié)核病分冊》[8]中結(jié)核性胸膜炎的診斷指標(biāo)：①胸腔積液涂片、培養(yǎng)或組織中查到結(jié)核分枝桿菌；②病理學(xué)檢查提示干酪性肉芽腫；③影像學(xué)表現(xiàn)符合結(jié)核性胸膜炎；④臨床特點(diǎn)符合結(jié)核性胸膜炎，結(jié)核菌素試驗陽性；⑤抗結(jié)核藥物治療2個月后，臨床表現(xiàn)和影像學(xué)表現(xiàn)有所好轉(zhuǎn)。符合①、②任意一項或③、④、⑤至少兩項可診斷為結(jié)核性胸膜炎。(2)非結(jié)核性胸膜炎；排除結(jié)核性胸膜炎的其他患者。

3. 主要試劑和儀器：T-SPOT.TB試劑盒(英國Immunotec公司)、人淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋華科生物科技有限公司)、細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640(天津灝洋華科生物科技有限公司)、MD AIM-V細(xì)胞培養(yǎng)基(天津灝洋華科生物科技有限公司)、TL-5000CR臺式大容量冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、HF151UV CO2培養(yǎng)箱(上海力康醫(yī)療設(shè)備有限公司)、腺苷脫氨酶試劑盒(浙江伊利康生物技術(shù)有限公司)、西門子Dimension?RxL MAX?全自動生化分析儀。

二、實驗方法

1. 外周血樣本處理：采用T-SPOT.TB試劑盒，檢測分泌γ-干擾素(IFN-γ)的T細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑說明書操作，常規(guī)分離外周血單個核細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)基MD AIM-V將細(xì)胞懸起，計數(shù)后細(xì)胞濃度調(diào)至2.5×106個/ml。

2. 胸腔積液樣本處理：(1)非血性胸腔積液40～50 ml，加0.2 ml(1250 U)肝素抗凝；(2)富集T淋巴細(xì)胞并用1640培養(yǎng)液調(diào)至7 ml，洗滌后將計數(shù)后的細(xì)胞濃度調(diào)至1.0×106個/ml。

4.利用信息技術(shù)，提高教師自身素質(zhì)。要熟練的的運(yùn)用多媒體技術(shù)，對教師本身也是一個挑戰(zhàn)，因為多媒體信息技術(shù)的運(yùn)用需要我們熟練地掌握電腦知識。我們應(yīng)該在平時的工作中不斷的學(xué)習(xí)、積累。并且將運(yùn)用現(xiàn)代信息技術(shù)的能力作為提升自身業(yè)務(wù)素質(zhì)的一項重要內(nèi)容。在掌握計算機(jī)基本操作技能的同時,還要掌握多媒體課件的制作,以便作出適合英語學(xué)科特點(diǎn)的課件。

3. 胸腔積液及外周血T-SPOT.TB樣本測定：在預(yù)先包被有抗IFN-γ單抗的孔中加入0.1 ml的細(xì)胞懸液，每份樣品設(shè)置4個檢測孔，分別為陰性對照(無血清培養(yǎng)基)、陽性對照(植物血凝素)、抗原A[主要成分為早期分泌抗原靶6(ESAT-6)]、抗原B[主要成分為培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)]，各50 μl，樣品加好后放入HF151UV CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h，洗板，加顯色液、終止液，判讀結(jié)果。

4. T-SPOT.TB陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：(1)空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個時，且(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))-(空白對照孔斑點(diǎn)數(shù))≥6；(2)空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個且(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))≥2×(空白對照孔斑點(diǎn)數(shù))。如果上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽性質(zhì)控對照孔正常時，結(jié)果為“陰性”。

5. ADA測定：應(yīng)用10 ml抗凝玻璃管收集胸腔積液10 ml，1000×g離心5 min取上清液[9]；采用連續(xù)監(jiān)測法測定ADA的活性，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，ADA值>40 U/L判定為陽性[3,10]。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用Excel表建立數(shù)據(jù)庫，由專人對數(shù)據(jù)進(jìn)行提取并轉(zhuǎn)入數(shù)據(jù)庫。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3種方法檢測情況的比較

胸腔積液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB、胸腔積液ADA的檢測結(jié)果具體見表1。145例確診或臨床診斷為結(jié)核性胸膜炎的患者中，胸腔積液T-SPOT.TB檢測陽性143例，外周血T-SPOT.TB檢測陽性129例，胸腔積液ADA檢測陽性127例；59例非結(jié)核性胸膜炎患者中，胸腔積液T-SPOT.TB檢測陰性38例，外周血T-SPOT.TB檢測陰性36例，胸腔積液ADA檢測陰性54例；3種診斷結(jié)果分別與臨床診斷進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、3種方法單獨(dú)檢測和胸腔積液T-SPOT.TB與ADA聯(lián)合檢測的比較

1. 單獨(dú)檢測的診斷效能分析：胸腔積液T-SPOT.TB檢測的敏感度(98.62%)明顯高于外周血T-SPOT.TB檢測的敏感度(88.97%)和胸腔積液ADA檢測的敏感度(87.59%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為11.61、13.75，P值均<0.001)；胸腔積液ADA檢測的特異度(91.53%)明顯高于胸腔積液T-SPOT.TB檢測的特異度(64.41%)和外周血T-SPOT.TB檢測的特異度(61.02%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為12.63、15.17，P值均<0.001)(表2)。

2. 聯(lián)合檢測的診斷效能分析：將胸腔積液T-SPOT.TB和ADA檢測均為陽性定義為陽性，將其中1項檢測為陰性或兩種檢測均為陰性定義為陰性。胸腔積液T-SPOT.TB與胸腔積液ADA聯(lián)合檢測診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度為86.21%，低于胸腔積液T-SPOT.TB單獨(dú)檢測的敏感度(98.62%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.94，P<0.001)，但特異度由T-SPOT.TB單獨(dú)檢測的64.41%提高至100.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.55，P<0.001)，陽性預(yù)測值達(dá)到100.00%，總符合率達(dá)到90.20%(表2)。

三、受試者工作特征曲線分析

采用受試者工作特征曲線(簡稱“ROC曲線”)分析診斷結(jié)核性胸膜炎的最佳界值[11]，胸腔積液T-SPOT.TB檢測的ROC曲線下面積為0.93，外周血T-SPOT.TB檢測的ROC曲線下面積為0.86，前者診斷效能優(yōu)于后者；胸腔積液ADA檢測的ROC曲線下面積為0.95，具體見圖1。目前，T-SPOT.TB關(guān)于胸腔積液的檢測還沒有明確的界值，臨床研究多參考外周血界值≥6斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFCs)/2.5×105外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷；本研究通過繪制ROC曲線得出：胸腔積液T-SPOT.TB在面積最大時ROC曲線拐點(diǎn)值為72 SFCs/2.5×105PBMCs，以此為界值，診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度為94.48%(137/145)，與既往采用的界值[(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))-(空白對照孔斑點(diǎn)數(shù))≥6(即6 SFCs/2.5×105PBMCs)；敏感度為98.62%(143/145)]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.73，P=0.054)，但特異度分別為88.14%(52/59)和64.41%(38/59)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.18，P<0.001)，總符合率為92.65%(189/204)。此外，當(dāng)胸腔積液ADA以36 U/L為界值時，診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度和特異度分別為92.41%(134/145)和89.83%(53/59)。

表1 3種方法對兩組患者進(jìn)行檢測的結(jié)果比較

注a：3種診斷結(jié)果分別與臨床診斷進(jìn)行比較的χ2值和P值

表2 3種方法單獨(dú)檢測和胸腔積液T-SPOT.TB與ADA聯(lián)合檢測的比較

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；符合率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)+真陰性例數(shù))×100%

圖1 胸腔積液T-SPOT.TB、外周血T-SPOT.TB和胸腔積液 ADA檢測的ROC曲線

討 論

一、胸腔積液T-SPOT.TB輔助診斷結(jié)核性胸膜炎的價值

T-SPOT.TB采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)，測定在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激下受試者外周血樣本中釋放IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)量，該方法在結(jié)核感染診斷中的價值已被越來越多的臨床研究證實，敏感度可高達(dá)90%左右[12-14]。但由于外周血T-SPOT.TB檢測不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和活動性結(jié)核病，致使該檢測方法診斷活動性結(jié)核病的特異度受到限制[15-17]。結(jié)核性胸膜炎患者常常伴有胸腔積液，發(fā)病期間結(jié)核分枝桿菌感染局部的隔室化效應(yīng)致使血液中大量效應(yīng)T淋巴細(xì)胞進(jìn)入胸腔積液發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)，因此檢測胸腔積液中結(jié)核抗原特異性T淋巴細(xì)胞數(shù)量可能受到結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的影響較小，更適用于結(jié)核性胸膜炎的輔助診斷[18-19]。劉曉清[20]比較了胸腔積液T-SPOT.TB和外周血T-SPOT.TB兩種檢測方法對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值，提示胸腔積液結(jié)核特異性T淋巴細(xì)胞計數(shù)是外周血的4.6倍，支持了結(jié)核性胸膜炎發(fā)生時結(jié)核特異性T淋巴細(xì)胞從外周血向胸膜腔遷移的理論[21]。本研究中，胸腔積液T-SPOT.TB檢測較外周血T-SPOT.TB的敏感度(98.62%與88.97%)、特異度(64.41%與61.02%)均高，可見胸腔積液T-SPOT.TB檢測是結(jié)核性胸膜炎較好的實驗室診斷手段。

二、胸腔積液ADA輔助診斷結(jié)核性胸膜炎的價值

ADA主要由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是一種廣泛分布在人體組織和體液中的酶，其活性與淋巴細(xì)胞的激活和分化有關(guān)[22-23]，機(jī)體受到結(jié)核分枝桿菌感染后，主要以細(xì)胞免疫為主，而ADA活性是反映細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，結(jié)核性胸膜炎患者因細(xì)胞受到刺激，胸腔積液中淋巴細(xì)胞明顯增多。因此，ADA水平升高在除外淋巴瘤后可基本確認(rèn)為結(jié)核感染[4,22]。本研究中，胸腔積液ADA檢測的敏感度為87.59%，而特異度高達(dá)91.53%，胸腔積液ADA用于結(jié)核性胸膜炎的診斷具有重要價值，能夠明顯提高診斷的特異度。但該方法對于炎癥早期或者機(jī)體免疫功能減退的患者，如HIV感染并發(fā)結(jié)核病患者可能存在假陰性；在肺炎旁積液和類風(fēng)濕病中可能存在假陽性[24]。

三、胸腔積液T-SPOT.TB與ADA聯(lián)合診斷結(jié)核性胸膜炎的價值

胸腔積液T-SPOT.TB單獨(dú)檢測用于鑒別診斷結(jié)核性胸膜炎具有非常好的敏感度(98.62%)，特異度為64.41%；胸腔積液ADA單獨(dú)檢測用于鑒別診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度為87.59%，特異度為91.53%，而兩者聯(lián)合檢測可以明顯提高結(jié)核性胸膜炎診斷的特異度。本研究顯示，胸腔積液T-SPOT.TB聯(lián)合ADA檢測的敏感度為86.21%，特異度達(dá)到100.00%，陽性預(yù)測值高達(dá)100.00%。當(dāng)胸腔積液T-SPOT.TB取72 SFCs/2.5×105PBMC為界值時，總體符合率最高，達(dá)到92.65%。

但是本研究仍存在以下不足：首先，大多數(shù)結(jié)核性胸膜炎患者難以獲得結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)陽性結(jié)果，診斷多依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)及常規(guī)生化指標(biāo)，盡管符合臨床實際，但可能對T-SPOT.TB及ADA檢測診斷性能的評估出現(xiàn)偏差；其次，與結(jié)核性胸膜炎入組患者例數(shù)(145例)相比，非結(jié)核性胸膜炎入組例數(shù)(59例)相對較少，有關(guān)特異度的數(shù)據(jù)還需進(jìn)一步驗證。再次，應(yīng)用T-SPOT.TB試劑盒進(jìn)行胸腔積液樣本檢測還沒有明確的界值，本研究取72 SFCs/2.5×105PBMCs為界值能否作為臨床診斷結(jié)核性胸膜炎的參考依據(jù)，還需要大樣本多中心的研究。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測快速方便，有非常高的敏感度，胸腔積液ADA檢測有較高的特異度，兩種方法聯(lián)合檢測可明顯提高診斷的特異度和總體符合率，對于結(jié)核性胸膜炎的診斷具有較高的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。

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(本文編輯：郭萌)

ThediagnosticvalueofMycobacteriumtuberculosisTcellenzyme-linkedimmunospottuberculoustest(T-SPOT.TB)combinedwithadenosinedeaminase(ADA)inpatientswithpleuraltuberculosis

WUJing-qiu*,FANGHong-xia,WEIMing,XUXin-xin,YUEZhi-guo,LIUYu-qin,HOUYan-jie.

*InfectiousDiseaseHospitalofHeilongjiangProvince,Harbin150500,China

Correspondingauthor:HOUYan-jie,Email:houyanjie2776@163.com

ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of theMycobacteriumtuberculosisT cell enzyme-linked immunospot test for tuberculosis (T-SPOT.TB) and adenosine deaminase (ADA) testing in patients with pleural tuberculosis.MethodsOne hundred and forty-five patients with confirmed or clinically diagnosed pleural tuberculosis and 59 patients with non-pleural tuberculosis were enrolled in this study from January 2015 to December 2015; all diagnoses were retrospectively analyzed. Pleural effusions and peripheral blood samples were collected from all 204 patients in the study before the onset of treatment and subsequently tested using T-SPOT.TB. ADA levels in pleural effusions were also measured. Pleural effusion T-SPOT.TB results, pleural effusion ADA levels and peri-pheral blood T-SPOT.TB results were compared separately, and against a combination of pleural effusion T-SPOT.TB and ADA levels.ResultsThe sensitivity of pleural effusion T-SPOT.TB (98.62%, 143/145) was significantly higher than that for peripheral blood T-SPOT.TB (88.97%, 129/145) and pleural effusion ADA (87.59%, 127/145) (χ2=11.61，P<0.001；χ2=13.75，P<0.001). The specificity of pleural effusion ADA (91.53%, 54/59) was significantly higher than that of pleural effusion T-SPOT.TB (64.41%, 38/59) and peripheral blood T-SPOT.TB (61.02%, 36/59), (χ2=12.63，P<0.001；χ2=15.17，P<0.001). Combining detection of pleural effusion T-SPOT.TB and ADA levels reduced the sensitivity from 98.62% (143/145) to 86.21% (125/145), compared with pleural effusion T-SPOT.TB (χ2=15.94，P<0.001), but increased specificity from 64.41% (38/59) to 100.00% (59/59) (χ2=25.55，P<0.001).ConclusionPleural effusion T-SPOT.TB is a highly sensitive and specific method for the detection of pleural tuberculosis. Combining pleural effusion T-SPOT.TB results with ADA testing can significantly improve diagnostic specificity.

Tuberculosis, pleural; Pleural effusion; Enzyme-linked immunospot assay; Adenosine dea-minase; Quality improvement

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.10.012

150500 哈爾濱，黑龍江省傳染病防治院(吳景秋、蔚鳴、許鑫鑫、岳治國、劉玉琴、侯艷杰)；深圳市龍華區(qū)慢性病防治中心(房宏霞)

侯艷杰，Email：houyanjie2776@163.com

2017-06-13)