• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小麥誘導(dǎo)抗性基因TaWIR1b的克隆及表達(dá)分析

    2017-09-29 06:30:14王俊美宋玉立李亞紅劉露露韓自行
    植物保護(hù) 2017年5期
    關(guān)鍵詞:全蝕抗病新農(nóng)

    王俊美, 徐 飛, 宋玉立, 李亞紅, 劉露露, 韓自行

    (河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450002)

    小麥誘導(dǎo)抗性基因TaWIR1b的克隆及表達(dá)分析

    王俊美, 徐 飛, 宋玉立*, 李亞紅, 劉露露, 韓自行

    (河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450002)

    全蝕病是小麥上一種重要的土傳病害。選育和種植抗病品種是防治小麥全蝕病的根本途徑,抗病基因研究是抗病育種的基礎(chǔ)性工作。根據(jù)基因TaWIR1b(Accession no.M94959.1)的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增‘新農(nóng)19’的cDNA,獲得了完整ORF,編碼85個(gè)氨基酸殘基,比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與TaWIR1b序列同源性達(dá)100%。根據(jù)獲得的TaWIR1b基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)定量引物,分析TaWIR1b在全蝕菌脅迫條件下不同互作模式的表達(dá)特征。結(jié)果表明接種全蝕病菌后抗病小麥品種‘新農(nóng)19’中TaWIR1b基因被誘導(dǎo)表達(dá),接菌后3 d達(dá)到峰值143.97,感病品種‘新麥19’中峰值出現(xiàn)在接菌后8 d,表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的4.22倍,提示該基因可能參與小麥對(duì)全蝕病的抗病過程。

    小麥全蝕病;TaWIR1b; 基因克隆; 基因表達(dá)分析

    小麥全蝕病是由禾頂囊殼小麥變種Gaeumannomycesgraminisvar.tritici引起的小麥上一種重要根部病害,在世界各小麥種植區(qū)廣泛分布。其發(fā)生危害重、傳播速度快,一旦發(fā)生難以根除,一般引起小麥減產(chǎn)10%~20%,重病田減產(chǎn)近半甚至絕收。選育和種植抗病品種是解決小麥全蝕病危害的根本途徑,而抗病基因研究是抗病育種的基礎(chǔ)性工作。

    WIR1(wheat induced resistance 1)基因首次報(bào)道是在小麥與大麥白粉菌的非親和互作中被誘導(dǎo)表達(dá),引起抗性反應(yīng)[1]。目前小麥中已有3個(gè)WIR1基因被克隆鑒定,分別是TaWIR1a、TaWIR1b和TaWIR1c,其中TaWIR1a和TaWIR1b聚在同一分支,與TaWIR1c的同源性較低。對(duì)WIR1基因編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)分析表明WIR1蛋白N末端具有疏水殘基,這種結(jié)構(gòu)特征降低了剪接的可能性,增加了膜結(jié)合的可能性。TaWIR1a蛋白具有親水的C末端,其可能功能是在病原物攻擊的過程中增強(qiáng)細(xì)胞膜與細(xì)胞壁的黏附從而增強(qiáng)細(xì)胞的穩(wěn)定性[2]。而TaWIR1b和TaWIR1c蛋白包含有信號(hào)肽,與分泌有關(guān),可能涉及細(xì)胞壁加固和增強(qiáng)物理屏障從而限制病原菌定殖。

    實(shí)驗(yàn)室前期抗性鑒定結(jié)果中小麥品種‘新農(nóng)19’對(duì)小麥全蝕病菌GaNS-90菌株表現(xiàn)中抗[3],可用于研究小麥對(duì)全蝕菌的抗性機(jī)制。本研究根據(jù)已有TaWIR1b基因的序列合成引物擴(kuò)增‘新農(nóng)19’的cDNA獲得了基因的全長(zhǎng)序列。同時(shí)根據(jù)獲得基因的序列合成定量引物,分析了接種小麥全蝕病菌GaNS-90后TaWIR1b在‘新農(nóng)19’和感病品種‘新麥19’中的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究基因的功能奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    試驗(yàn)所用河南省區(qū)試小麥品種‘新農(nóng)19’(Xinnong19)、‘新麥19’(Xinmai19)及小麥全蝕病菌菌株GaNS-90均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護(hù)研究所小麥病害課題組收集、保存。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備與取樣

    挑取均勻飽滿的小麥種子,用75%乙醇表面消毒30 s,清水洗凈后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中浸種24 h,然后種植于營(yíng)養(yǎng)缽中溫室(20℃)培養(yǎng),每天光照16 h。至長(zhǎng)出4葉后將整株苗連根拔出沖洗干凈,置于放有濕潤(rùn)衛(wèi)生紙的托盤內(nèi),用打孔器打取全蝕菌菌餅并放置于根部,保鮮膜封住托盤。將托盤置于培養(yǎng)箱中,采集接菌后0、2、3和8 d以及同期不接菌對(duì)照的小麥根,用錫箔紙包好液氮速凍,存放于-80℃冰箱備用。

    1.2.2 總RNA提取及第一鏈cDNA合成

    采用 TRIzol法(參考TaKaRa說明書)提取小麥根的RNA,加入DNase純化RNA。用Eppendorf Biospectrometer分光光度計(jì)檢測(cè)樣品的濃度和純度。用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA第一鏈。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 目的基因獲得及序列分析

    根據(jù)目的基因TaWIR1b(Accession no. M94959.1)的ORF框兩端序列設(shè)計(jì)引物對(duì):WIR1F:CTCGAAACACACCAGCAT;WIR1R:GGTGCGTGACAGTAGATTAAC。以‘新農(nóng)19’的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增體系如下:10×Taqbuffer 2 μL,dNTPs(10 mmol/L)0.4 μL,上游引物(10 μmol/L)0.2 μL,下游引物(10 μmol/L)0.2 μL,cDNA 1 μL,TaqDNA聚合酶0.2 μL,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 3 min;94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,UVP凝膠成像系統(tǒng)照相。電泳后回收目標(biāo)片段,連接入pMD19-T simple載體,轉(zhuǎn)化TJ1感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒,送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

    利用NCBI(http:∥ncbi.nlm.nih.gov/)中的ORF Finder(http:∥www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.html)工具查找目的片段的開放閱讀框。通過BLAST對(duì)克隆的目的片段進(jìn)行同源性分析。

    1.2.4 內(nèi)參及目的基因定量引物設(shè)計(jì)及檢測(cè)

    以組成型表達(dá)基因,小麥的26S rRNA(Accession no.Z11889.1)作為內(nèi)參對(duì)照,引物序列[4]:26S-F: GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC;26S-R:TCTCC-CTTTAACACCAACGG。根據(jù)克隆得到的基因序列,利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)定量PCR引物,序列如下:WIR1M-F:TGCCGCACAGTTTATGGATG;WI-R1M-R:TAAGGTGGTGCGTGACAGTAGA。

    先通過普通 PCR 擴(kuò)增判斷引物的特異性,產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。選擇最佳退火溫度,確保沒有引物二聚體產(chǎn)生后按該退火溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。通過梯度稀釋模板的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率,根據(jù)熔解曲線判斷引物的特異性。

    1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)與分析

    應(yīng)用 ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀,以各個(gè)取樣點(diǎn)的cDNA 為模板,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:2×SYBR PremixExTaq10 μL,50×ROX Ⅱ0.4 μL,WIRIM-F(10 μmol/L)0.8 μL,WIRIM-R(10 μmol/L)0.8 μL,cDNA第一鏈2 μL(10×稀釋的 RNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物),ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 1 min;95℃ 10 s,60℃ 20 s,72℃ 40 s,40個(gè)循環(huán)。于 72℃收集熒光信號(hào),反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熒光值變化曲線和熔解曲線分析。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次,Ct值取平均值。以各取樣時(shí)間點(diǎn)小麥 26S rRNA 的量為內(nèi)參對(duì)照來確定目標(biāo)基因的相對(duì)量,利用2-△△Ct方法[5]來確定目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的基因獲得

    提取所有試驗(yàn)材料的總RNA。用Eppendorf Biospectrometer檢測(cè),所提取的總RNA OD260/OD280值為2.0左右,表明RNA質(zhì)量較好,OD260/OD230值大于2.0,表明RNA純度較高,無小分子鹽類污染。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總 RNA,沒有降解現(xiàn)象,可用于下一步試驗(yàn)。根據(jù)試劑盒說明,利用TaKaRa First Strand cDNA synthesis進(jìn)行cDNA第一鏈合成。

    利用擴(kuò)增基因全長(zhǎng)的引物擴(kuò)增‘新農(nóng)19’的cDNA,獲得了370 bp左右的特異片段,將該片段回收、克隆轉(zhuǎn)化后送公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明片段長(zhǎng)度為373 bp,其序列與已報(bào)道的TaWIR1b基因序列完全相同。利用 NCBI 中 ORF finder工具在克隆片段中找到長(zhǎng)258 bp完整開放閱讀框,該ORF編碼86個(gè)氨基酸殘基(圖1)。與已知基因TaWIR1b編碼的氨基酸序列100%一致。獲得的ORF框N末端具有豐富的甘氨酸(glycine G)和脯氨酸(proline P)重復(fù),是TaWIR1b的功能區(qū)域。

    圖1 基因TaWIR1b 的序列Fig.1 The sequence of TaWIR1b

    2.2 定量表達(dá)分析

    以小麥核糖體26S rRNA基因作為內(nèi)參對(duì)照,采用相對(duì)定量的方法分析全蝕菌侵染脅迫條件下基因TaWIR1b在不同互作條件下的表達(dá)模式。結(jié)果表明:小麥品種‘新農(nóng)19’中基因TaWIR1b受到病原菌侵染后誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),且在接種后第3天達(dá)到高峰值,比對(duì)照高出143.97倍;而感病品種‘新麥19’中基因的表達(dá)高峰出現(xiàn)在接菌后第8天,且僅為對(duì)照的4.22倍,各時(shí)期基因的表達(dá)量均顯著低于‘新農(nóng)19’(圖2)。

    圖2 接種全蝕病菌后TaWIR1b基因的表達(dá)模式Fig.2 Expression pattern of the gene TaWIR1b after inoculation with Gaeumannomyces graminis var. tritici

    3 討論

    小麥WIR基因早在1989年被克隆,目前有TaWIR1a、TaWIR1b和TaWIR1c3個(gè)基因被克隆。已有結(jié)果表明,該類基因受到多種病原物的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。其中TaWIR1a同源基因在大麥與大麥葉銹菌和小麥葉銹菌互作及大麥對(duì)大麥白粉菌的基礎(chǔ)防御和小種?;涂剐灾芯梢员徽T導(dǎo)表達(dá)[6-7];WIR1在小麥中參與對(duì)小麥葉銹菌的非小種?;涂剐院突A(chǔ)防御過程[8]。Coram等的研究結(jié)果表明TaWIR1a基因參與小麥對(duì)條銹菌的小種專化型抗性過程[9]。Diethelm等比較了小麥抗、感品種中TaWIR1b基因的表達(dá)情況,認(rèn)為該基因在小麥對(duì)赤霉病的抗性中發(fā)揮作用,將該基因定位在小麥5DS染色體上,并將其列為抗病基因的候選基因[10]。

    本研究結(jié)果表明,該類基因受到全蝕病菌的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá),在抗病品種‘新農(nóng)19’中的表達(dá)量顯著高于感病品種‘新麥19’,峰值出現(xiàn)得也較早,提示該基因可能參與‘新農(nóng)19’對(duì)全蝕病菌的抗病過程。目前對(duì)于TaWIR1的功能沒有定論。利用大麥條紋花葉病毒(BSMV)介導(dǎo)的基因沉默(virus inducing gene silencing, VIGS)系統(tǒng)分析TaWIR1基因的功能時(shí)發(fā)現(xiàn),雖然在病菌誘導(dǎo)后該基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),但并未發(fā)現(xiàn)對(duì)小麥白粉菌的定殖有影響[1-2]。同時(shí)在小麥中過表達(dá)TaWIR1a對(duì)于白粉菌吸器的形成不產(chǎn)生影響[11]。沉默試驗(yàn)小麥材料‘Renan’中全部TaWIR1基因?qū)τ谛←湴追劬陌l(fā)育沒有顯著影響[12]。Diethelm等則認(rèn)為該基因?qū)铙w營(yíng)養(yǎng)型病原物和死體營(yíng)養(yǎng)型病原物的作用是截然相反的,其在植物與死體營(yíng)養(yǎng)型的病原菌互作時(shí)參與抗病過程[10]。小麥全蝕菌屬于死體營(yíng)養(yǎng)型病原物,其啟動(dòng)的小麥抗性和防御反應(yīng)很可能與同是死體營(yíng)養(yǎng)型的小麥赤霉菌模式相同,下一步需要深入開展TaWIR1b基因在‘新農(nóng)19’與全蝕菌互作中的功能研究,為闡明基因的作用機(jī)理及進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。

    [1] Schweizer P,Hunziker W,M?singer E.cDNA cloning,invitrotranscription and partial sequence analysis of messenger RNA from winter wheat(TriticumaestivumL.)with induced resistance toErysiphegraminisf.sp.tritici[J].Plant Molecular Biology,1989,12(6):643-654.

    [2] Bull J,Mauch F,Hertig C,et al. Sequence of a wheat gene encoding a novel protein associated with pathogen defense[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,1992,5(6):516-519.

    [3] 徐飛,楊共強(qiáng),何文蘭,等.不同小麥品種(系)對(duì)全蝕病的抗性鑒定與評(píng)價(jià)[J].植物保護(hù),2013,39(2):143-146.

    [4] Spencer D F,Schnare M N,Coulthart M B,et al. Sequence and organization of a 7.2 kb region of wheat mitochondrial DNA containing the large subunit (26S) rRNA gene [J].Plant Molecular Biology,1992,20(2):347-352.

    [5] Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod[J].Methods,2001,25(4):402-408.

    [6] Neu C,Keller B,Feuillet C.Cytological and molecular analysis of theHordeumvulgare-Pucciniatriticinanonhost interaction[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2003,16(7):626-633.

    [7] Jansen C,Korell M,Eckey C,et al.Identification and transcriptional analysis of powdery mildew-induced barley genes[J].Plant Sciences,2005,168:373-380.

    [8] Hulbert S H,Bai J,Fellers J P,et al.Gene expression patterns in near isogenic lines for wheat rust resistance geneLr34/Yr18[J].Phytopathology,2007,97(9):1083-1093.

    [9] Coram T E,Huang X L,Zhan G M,et al.Meta-analysis of transcripts associated with race-specific resistance to stripe rust in wheat demonstrates common induction of blue copper-binding protein,heat-stress transcription factor,pathogen-induced WIR1A protein,and ent-kaurene synthase transcripts[J].Functional & Integrative Genomics,2010,10(3):383-392.

    [10] Diethelm M,Rhiel M,Wagner C,et al. Gene expression analysis of four WIR1-like genes in floret tissues of European winter wheat after challenge withG.zeae[J].Euphytica,2012,186(1):103-114.

    [11] Schweizer P,Pokorny J,Abderhalden O,et al. A transient assay system for the functional assessment of defense-related genes in wheat[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,1999,12(8):647-654.

    [12] Tufan H A,Mcgrann G R D,Maccormack R,et al. TaWIR1 contributes to post-penetration resistance toMagnaportheoryzae,but notBlumeriagraminisf.sp.tritici,in wheat [J]. Molecular Plant Pathology,2012,13(7):653-665.

    (責(zé)任編輯: 楊明麗)

    CloningofthewheatinducedresistancegeneTaWIR1bandexpressionanalysis

    Wang Junmei, Xu Fei, Song Yuli, Li Yahong, Liu Lulu, Han Zihang

    (InstituteofPlantProtection,HenanAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonCropsinSouthernPartofNorthChina,MinistryofAgriculture,Zhengzhou450002,China)

    Take-all disease,caused byGaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt), is one of the important soil-borne diseases of wheat. It is the fundamental way to breed and plant resistant varieties for preventing the disease,and research on resistance genes is the foundation for resistance breeding. In this study,a complete ORF (open reading frame),with 100% homology withTaWIR1bfrom GenBank,was obtained by amplifying cDNA of ‘Xinnong19’ using primers designed based onTaWIR1bsequence (Accession no.M94959.1). Primers were synthesized for analyzing the transcription patterns of the gene by quantitative PCR in different wheat-pathogen interaction patterns induced byGgt. The results indicated thatTaWIR1bwas induced byGgtup-regulation expression in resistant cultivar ‘Xinnong19’,with a peak value of 143.97 three days post inoculation, but the peak value was 4.22 at 8 d post inoculation in susceptible cultivar ‘Xinmai19’. It indicates that the geneTaWIR1bmight be involved in the course of resistant response to take-all disease.

    wheat take-all disease;TaWIR1bgene; gene cloning; gene expression analysis

    S 512.1

    : ADOI: 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.025

    2016-10-31

    : 2016-12-19

    河南省小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(S2010-01-05);河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(142300413221);河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金

    * 通信作者 E-mail:songyuli2000@126.com

    猜你喜歡
    全蝕抗病新農(nóng)
    小麥全蝕病的危害與防治
    我國(guó)小麥基因組編輯抗病育種取得突破
    小麥全蝕病的危害和防治
    新農(nóng)人時(shí)語
    小麥全蝕病的發(fā)生與防治措施
    bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物激素介導(dǎo)的抗病抗逆途徑中的作用
    新農(nóng)人時(shí)語
    葡萄新品種 優(yōu)質(zhì)又抗病
    新農(nóng)人時(shí)語
    新農(nóng)人時(shí)語
    亚洲久久久国产精品| 国产免费一级a男人的天堂| 美女内射精品一级片tv| 一本色道久久久久久精品综合| 国产精品无大码| 亚洲av福利一区| 午夜老司机福利剧场| 国产精品蜜桃在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 成人免费观看视频高清| 日韩制服骚丝袜av| 久久6这里有精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产成人一区二区在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 伦理电影免费视频| h视频一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| 日韩伦理黄色片| 亚洲国产精品专区欧美| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 天堂8中文在线网| 美女内射精品一级片tv| 国产精品99久久99久久久不卡 | 青青草视频在线视频观看| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲四区av| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲人成网站在线播| 国产日韩欧美在线精品| 一个人看视频在线观看www免费| 99视频精品全部免费 在线| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲av男天堂| 精品一区在线观看国产| 九色成人免费人妻av| 久久久久久久久久久丰满| 99热6这里只有精品| 欧美丝袜亚洲另类| 97在线人人人人妻| kizo精华| 中文字幕人妻丝袜制服| 日本av免费视频播放| 亚洲国产精品专区欧美| 国产亚洲最大av| 99久久综合免费| 午夜激情福利司机影院| 久久精品国产亚洲av天美| 国产成人精品一,二区| 十八禁网站网址无遮挡 | 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美一级a爱片免费观看看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲av中文av极速乱| 激情五月婷婷亚洲| 人妻系列 视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲欧美精品专区久久| 91精品伊人久久大香线蕉| 九九爱精品视频在线观看| av有码第一页| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品99久久99久久久不卡 | 一级,二级,三级黄色视频| 多毛熟女@视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 免费看不卡的av| freevideosex欧美| 久久97久久精品| 欧美3d第一页| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 插逼视频在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 97在线视频观看| 亚洲人与动物交配视频| 久久久久久久久久成人| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产免费视频播放在线视频| 精品久久久噜噜| 亚洲国产精品一区二区三区在线| av一本久久久久| 国产日韩欧美视频二区| 岛国毛片在线播放| 99久久中文字幕三级久久日本| 插阴视频在线观看视频| 免费人成在线观看视频色| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 欧美国产精品一级二级三级 | 少妇人妻 视频| 亚洲成人手机| 精品久久久噜噜| 日韩人妻高清精品专区| 国产综合精华液| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美三级亚洲精品| 亚洲欧洲日产国产| 秋霞在线观看毛片| 国产在线视频一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 最近的中文字幕免费完整| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 久久久久久久大尺度免费视频| 国产精品.久久久| 精品一区二区免费观看| 我要看黄色一级片免费的| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 99九九线精品视频在线观看视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久久国产一区二区| 水蜜桃什么品种好| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲欧洲国产日韩| 一本一本综合久久| 熟女av电影| 婷婷色综合大香蕉| 国内精品宾馆在线| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日本与韩国留学比较| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲不卡免费看| 久久久国产精品麻豆| 国产一区二区三区av在线| 美女国产视频在线观看| 国产av国产精品国产| 成年人午夜在线观看视频| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 三级国产精品欧美在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 黄色怎么调成土黄色| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 成年人免费黄色播放视频 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲精品一区蜜桃| 久久久久久久久久成人| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产视频内射| 老司机影院毛片| 五月玫瑰六月丁香| 18禁动态无遮挡网站| 人体艺术视频欧美日本| 中文字幕av电影在线播放| 欧美丝袜亚洲另类| 天堂中文最新版在线下载| 精品一区在线观看国产| 91精品国产国语对白视频| av在线老鸭窝| 国产精品无大码| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲精品,欧美精品| 美女内射精品一级片tv| 尾随美女入室| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产男女内射视频| 亚洲不卡免费看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 丝瓜视频免费看黄片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 我要看日韩黄色一级片| 国产日韩欧美亚洲二区| 一区二区三区精品91| 老女人水多毛片| 欧美xxⅹ黑人| 国产av国产精品国产| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 人妻人人澡人人爽人人| h视频一区二区三区| 亚洲天堂av无毛| 国产精品久久久久成人av| 亚洲精品一二三| 国内揄拍国产精品人妻在线| 女性被躁到高潮视频| 亚洲,欧美,日韩| 99热网站在线观看| 亚洲成人一二三区av| 日本免费在线观看一区| 精品少妇久久久久久888优播| 91成人精品电影| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 六月丁香七月| 国产伦在线观看视频一区| 日日撸夜夜添| 91精品国产九色| 寂寞人妻少妇视频99o| 搡老乐熟女国产| 日日啪夜夜爽| 大话2 男鬼变身卡| 男女边吃奶边做爰视频| a 毛片基地| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产熟女午夜一区二区三区 | 黄色怎么调成土黄色| 国产精品久久久久久精品古装| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 午夜免费观看性视频| 22中文网久久字幕| 夫妻午夜视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久精品免费免费高清| 男女啪啪激烈高潮av片| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 人妻一区二区av| 99热国产这里只有精品6| 大片免费播放器 马上看| 久久久久久久久久久丰满| 久久国产精品大桥未久av | 国产精品国产三级国产专区5o| 97超碰精品成人国产| 蜜臀久久99精品久久宅男| 搡老乐熟女国产| 国产精品一二三区在线看| 99国产精品免费福利视频| 欧美日韩在线观看h| 嫩草影院新地址| 色婷婷av一区二区三区视频| 嫩草影院新地址| 国产乱人偷精品视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲高清免费不卡视频| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲国产av新网站| 国产黄片美女视频| 涩涩av久久男人的天堂| 看十八女毛片水多多多| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 精品人妻熟女av久视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一区二区av电影网| 国精品久久久久久国模美| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 高清毛片免费看| 黑丝袜美女国产一区| 黑人高潮一二区| 乱系列少妇在线播放| 中文资源天堂在线| 久久精品国产自在天天线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 观看免费一级毛片| 22中文网久久字幕| √禁漫天堂资源中文www| 曰老女人黄片| 人人妻人人看人人澡| 日韩中字成人| 少妇 在线观看| 免费观看av网站的网址| 国精品久久久久久国模美| 国产又色又爽无遮挡免| 大片电影免费在线观看免费| 国产成人精品一,二区| 亚洲美女视频黄频| 国产精品蜜桃在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 老司机影院成人| .国产精品久久| 色视频在线一区二区三区| 久久久精品免费免费高清| 爱豆传媒免费全集在线观看| 在线观看人妻少妇| 亚洲av成人精品一二三区| 另类精品久久| 日本与韩国留学比较| 日本欧美国产在线视频| 在线播放无遮挡| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲,欧美,日韩| 欧美精品一区二区免费开放| 国产av国产精品国产| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲av欧美aⅴ国产| 在线观看美女被高潮喷水网站| 自线自在国产av| 大话2 男鬼变身卡| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲精品一区蜜桃| 交换朋友夫妻互换小说| 一级毛片久久久久久久久女| 97在线人人人人妻| 亚洲精品自拍成人| 毛片一级片免费看久久久久| 免费少妇av软件| 这个男人来自地球电影免费观看 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 黄色怎么调成土黄色| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 777米奇影视久久| 亚洲图色成人| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 91精品国产九色| 一区二区三区精品91| 亚洲人与动物交配视频| 日韩欧美 国产精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产高清有码在线观看视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品久久久久久久电影| 男女国产视频网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日本免费在线观看一区| 久久久久久久精品精品| 午夜激情福利司机影院| 亚洲中文av在线| 国产男人的电影天堂91| 免费看日本二区| 欧美三级亚洲精品| 9色porny在线观看| av线在线观看网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品少妇内射三级| 日韩电影二区| 我的女老师完整版在线观看| 另类精品久久| 观看av在线不卡| 国产一级毛片在线| 欧美bdsm另类| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 大香蕉97超碰在线| 国产成人精品久久久久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久久久久久久久免费av| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 少妇人妻 视频| xxx大片免费视频| 最黄视频免费看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 在线播放无遮挡| 久久久久久久久大av| 乱系列少妇在线播放| 亚洲在久久综合| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 韩国av在线不卡| 亚洲无线观看免费| 久久久久久伊人网av| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美人与善性xxx| 亚洲国产av新网站| 久久精品久久久久久久性| 性高湖久久久久久久久免费观看| 午夜久久久在线观看| 老熟女久久久| 国产精品成人在线| 午夜福利影视在线免费观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日日撸夜夜添| 国产视频内射| 亚洲av日韩在线播放| 国精品久久久久久国模美| av视频免费观看在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 99久久综合免费| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲天堂av无毛| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 97在线视频观看| 国产在线一区二区三区精| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜影院在线不卡| 国产亚洲5aaaaa淫片| videossex国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 免费在线观看成人毛片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 中文资源天堂在线| 日韩三级伦理在线观看| 91精品国产九色| 日韩av不卡免费在线播放| 国产免费一区二区三区四区乱码| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产精品人妻久久久影院| 国产91av在线免费观看| 2022亚洲国产成人精品| 久久久久网色| 在线天堂最新版资源| 国精品久久久久久国模美| 国产午夜精品一二区理论片| 最近最新中文字幕免费大全7| 另类精品久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 大片免费播放器 马上看| 亚洲国产精品999| 女人精品久久久久毛片| 性色av一级| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产黄片视频在线免费观看| 两个人免费观看高清视频 | 国产乱人偷精品视频| 亚洲天堂av无毛| 一级黄片播放器| 国产免费福利视频在线观看| 国精品久久久久久国模美| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产成人精品婷婷| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美bdsm另类| 久热久热在线精品观看| 老司机影院毛片| av在线播放精品| 国产毛片在线视频| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲综合色惰| 欧美日韩亚洲高清精品| 五月伊人婷婷丁香| 九草在线视频观看| 性色avwww在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 在线免费观看不下载黄p国产| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲综合色惰| 久热这里只有精品99| 99九九线精品视频在线观看视频| 女人久久www免费人成看片| 国产成人a∨麻豆精品| 色网站视频免费| 亚洲精品日本国产第一区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 少妇高潮的动态图| 大香蕉97超碰在线| 人体艺术视频欧美日本| 美女内射精品一级片tv| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 男人爽女人下面视频在线观看| 日本免费在线观看一区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲欧美日韩东京热| 男女边吃奶边做爰视频| 精品久久久噜噜| 久久97久久精品| 中国美白少妇内射xxxbb| 精品一区在线观看国产| 青春草视频在线免费观看| 日韩三级伦理在线观看| 国产高清三级在线| 女人精品久久久久毛片| av黄色大香蕉| 日韩中字成人| 中文字幕亚洲精品专区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲国产色片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日日爽夜夜爽网站| 岛国毛片在线播放| 毛片一级片免费看久久久久| 国产成人精品福利久久| 麻豆成人午夜福利视频| 久久青草综合色| 人人妻人人看人人澡| 久久久国产一区二区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 七月丁香在线播放| 国产乱人偷精品视频| 99久久精品热视频| 一级av片app| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲国产色片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 水蜜桃什么品种好| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲人成网站在线播| 国产亚洲91精品色在线| 99re6热这里在线精品视频| 午夜老司机福利剧场| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久久久人妻精品一区果冻| 性高湖久久久久久久久免费观看| 曰老女人黄片| 少妇被粗大猛烈的视频| 丝瓜视频免费看黄片| 七月丁香在线播放| tube8黄色片| 97超视频在线观看视频| 观看免费一级毛片| 2018国产大陆天天弄谢| 久热这里只有精品99| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲在久久综合| 国产成人免费无遮挡视频| 国产av码专区亚洲av| 女性被躁到高潮视频| 久久免费观看电影| 免费在线观看成人毛片| 一区在线观看完整版| 丝瓜视频免费看黄片| 在线观看三级黄色| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产在线视频一区二区| 好男人视频免费观看在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 中文字幕制服av| 少妇人妻久久综合中文| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲精品色激情综合| 成年女人在线观看亚洲视频| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 人人妻人人看人人澡| 久久综合国产亚洲精品| 欧美+日韩+精品| 国精品久久久久久国模美| 色94色欧美一区二区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产精品久久久久久久电影| 女性被躁到高潮视频| a级毛片在线看网站| 三级国产精品片| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 成人国产麻豆网| 国产成人精品一,二区| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品一区二区性色av| 18禁动态无遮挡网站| 有码 亚洲区| 色94色欧美一区二区| 少妇熟女欧美另类| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 欧美人与善性xxx| 在线 av 中文字幕| 深夜a级毛片| 日韩电影二区| 99久久综合免费| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久久a久久爽久久v久久| 综合色丁香网| 日韩欧美 国产精品| 国产深夜福利视频在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲电影在线观看av| 香蕉精品网在线| 大片电影免费在线观看免费| 三级经典国产精品| a级毛色黄片| 大码成人一级视频| 亚洲国产日韩一区二区| 国产美女午夜福利| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲,欧美,日韩| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲怡红院男人天堂| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 在现免费观看毛片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日本欧美国产在线视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 蜜桃在线观看..| 插阴视频在线观看视频| 日本午夜av视频| 国产av一区二区精品久久| 插阴视频在线观看视频| 欧美日韩精品成人综合77777| av视频免费观看在线观看| 亚洲综合精品二区| 观看av在线不卡| 另类亚洲欧美激情| 最近手机中文字幕大全| 欧美日韩视频精品一区| 国产欧美日韩精品一区二区| 午夜老司机福利剧场| 日本午夜av视频| 日韩电影二区| 精品少妇久久久久久888优播| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲人与动物交配视频| 26uuu在线亚洲综合色| 国产成人精品一,二区| 国产精品一区二区在线不卡| 黄色一级大片看看| 日韩欧美精品免费久久| 久久免费观看电影| 亚洲国产成人一精品久久久| 成人影院久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲国产精品一区三区|