哈尼族藥銅錘白花片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

付開(kāi)聰　崔明筠　周兵

【摘 要】 目的：建立哈尼藥銅錘白花片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法（TLC）定性鑒別三七、獨(dú)活和白芍，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定制劑中龍血素b的含量。結(jié)果：TLC法能定性檢出三七、獨(dú)活和白芍，斑點(diǎn)清晰，且陰性對(duì)照無(wú)干擾；HPLC法測(cè)定龍血素b，進(jìn)樣量在0.031～0.157μg，龍血素b峰面積與進(jìn)樣量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.998），平均回收率98.42%（RSD 0.82%）。結(jié)論：所建標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)便可行，穩(wěn)定性好，可用于哈尼族藥銅錘白花片的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 銅錘白花片；薄層色譜法；高效液相色譜法；龍血素b

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）04-0019-02

銅錘白花片來(lái)源于云南哈尼族民間，主要用于治療治腰椎間盤突出癥、腰椎間盤突出癥引起的腰腿疼痛等癥狀，本方在普洱市民族醫(yī)院臨床使用多年，療效顯著。該方由銅錘草、白花丹、龍血竭和三七等十九味藥組成，臨床上以湯藥使用，為方便患者儲(chǔ)存、攜帶和服用，將其劑型改為片劑。為建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床療效，采用薄層色譜法鑒別方中的三七、獨(dú)活和白芍，高效液相色譜法測(cè)定方中的有效成分龍血素b，為銅錘白花片的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters 1525 HPLC 儀（美國(guó)Waters公司）；KQ250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AG135十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Scanner-3薄層色譜掃描儀（瑞士CAMAG公司）。

1.2 試藥 銅錘白花片（規(guī)格0.5g/片，北京師范大學(xué)制備，批號(hào)20140815，20140816，20140817）；龍血素b（批號(hào)111558-201407）；人參皂苷R1（批號(hào)110703-200424）；芍藥苷（批號(hào)110736-201438）；獨(dú)活對(duì)照藥材（批號(hào)1200940-201111）；均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純；硅膠板（青島海洋化工廠分廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 銅錘白花片的制備 將銅錘草、三七、龍血竭、蜈蚣等藥材粉碎成細(xì)粉，備用，白花丹、獨(dú)活、牛膝、桂枝、燈盞花、當(dāng)歸、白芍等藥材加水煮提三次，第一次加10倍量水浸泡2h，煮沸2h，第二次加8倍量水，煮沸1h，第三次加8倍量水，煮沸1h，合并濾液，濃縮成稠膏狀后加入備用細(xì)粉攪拌均勻，制粒，整粒，壓片，即得。

2.2 薄層色譜鑒別[1-3]

2.2.1 三七的鑒別 取銅錘白花片5g，研碎，粉末加乙醇50ml，超聲30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?ml乙醇溶解，作為供試品溶液；再取人參皂苷R1對(duì)照品，加甲醇制成1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；按供試品制備方法制得缺少三七樣品的陰性液；吸取上述溶液，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上。分液漏斗中加入三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水的混合溶液，比例為7.5∶20∶11∶5，置10 ℃以下放置，取下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，以10%的硫酸乙醇溶液為顯色劑，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。置紫外光燈（365nm）下檢視，銅錘白花片供試品與人參皂苷R1對(duì)照品在薄層板相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.2.2 獨(dú)活的鑒別 取銅錘白花片5g，研碎，粉末加乙酸乙酯50ml，超聲30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?ml乙酸乙酯溶解，備用；取獨(dú)活對(duì)照藥材加甲醇25ml，超聲30min，濾過(guò)，濾液濃縮至1ml的溶液，作為對(duì)照品溶液；按銅錘白花片供試品制備方法制得缺少獨(dú)活樣品的陰性液；吸取上述溶液，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以正己烷-甲苯-乙酸乙酯（2∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，于紫外光燈（365nm）下檢視。銅錘白花片供試品與對(duì)照藥材在薄層板相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

2.2.3 白芍的鑒別 取銅錘白花片5g，研碎，粉末加甲醇5ml，超聲30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?ml甲醇溶解，作為供試品溶液；對(duì)照品溶液取適量芍藥苷，加甲醇制成1ml含1mg芍藥苷的溶液；除去白芍樣品，按銅錘白花片供試品制備方法制得的陰性液；吸取上述溶液，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.4）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干， 5%香草醛硫酸溶液為顯色劑，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。銅錘白花片供試品與對(duì)芍藥苷在薄層板相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

2.3 龍血素b含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[4-8] 色譜柱為 Waters XTerra@RP18 C18柱（3.9mm×150mm， 5μm）；乙腈-1%乙酸水溶液（37∶63）；檢測(cè)波長(zhǎng)275nm，流速1.0ml·min-1，柱溫：30℃，進(jìn)樣量10μl。理論塔板數(shù)按龍血素b峰計(jì)算不低于10000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品龍血素b10.48mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻， 精密量取適量，加甲醇稀釋成10.48μg·ml-1的溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）3.5g，精密稱定，精密加入甲醇100ml，稱定重量，超聲提取30min，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性液的制備 按處方比例稱取除去龍血竭的其他藥材適量，依照銅錘白花片的制備工藝制得陰性樣品，照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3.5 線性關(guān)系的考察 自動(dòng)精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下的龍血素b對(duì)照品溶液3、5、8、10、13、15μl，按色譜條件測(cè)定樣品溶液中龍血素b的含量，以龍血素b對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=40721X-13550，R2=0.998。結(jié)果表明， 龍血素b進(jìn)樣量在0.031～0.157μg，龍血素b峰面積與進(jìn)樣量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下的龍血素b對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果RSD為0.93%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份樣品（批號(hào)：20140815），分別按色譜條件操作，測(cè)定龍血素b含量。結(jié)果龍血素b的含量均值為254.75μg·ml-1，RSD為1.42%，表明本方法重復(fù)性好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)：20140815測(cè)定）， 按0、2、4、6、8、12h時(shí)間間隔，分別測(cè)定龍血素b峰面積。結(jié)果，RSD為1.87%，供試品溶液制備后12 h內(nèi)測(cè)定，色譜峰面積無(wú)明顯變化，在此時(shí)間內(nèi)測(cè)定銅錘白花片樣品溶液，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.3.9 加樣回收試驗(yàn) 取已知準(zhǔn)確含量的銅錘白花片樣品（批號(hào)：20140815），精密稱定，加入濃度為0.1048mg·ml-1的龍血素b對(duì)照品溶液4.3ml，定容至100ml， 稱定重量，超聲提取30min，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，按色譜條件操作， 測(cè)定龍血素b含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.10 樣品測(cè)定 取 3批銅錘白花片適量，分別按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品中龍血素b的含量分別為0.1750、0.182、0.183mg/片。

3 討論

銅錘白花片為云南省普洱市哈尼族的傳統(tǒng)藥方，具有治療治腰椎間盤突出癥、腰椎間盤膨出癥引起的腰腿疼痛癥狀的功效，有豐富的臨床使用數(shù)據(jù)，使用年限超過(guò)10年。為了更好的服務(wù)患者，保護(hù)民族民間醫(yī)藥，傳承民族醫(yī)藥文化，普洱市民族醫(yī)院對(duì)銅錘白花片進(jìn)行質(zhì)量控制研究。

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道、臨床服用方式、以及療效數(shù)據(jù)顯示，提取過(guò)程采取了加水煎煮的提取工藝[9-10]；方中三七、獨(dú)活、白芍采用TLC 法鑒別，簡(jiǎn)便，快速，且無(wú)陰性干擾。通過(guò)紫外分光光度法對(duì)龍血素b對(duì)照品溶液在200～400nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長(zhǎng)為275nm，峰形佳，因此確定采用275nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用乙腈-1%乙酸水溶液（37∶63）作為流動(dòng)相，理論塔板數(shù)63411，同時(shí)計(jì)算龍血素b與相鄰峰的分離度為2.9，符合定量分析要求；試驗(yàn)所建標(biāo)準(zhǔn)可用于哈尼族藥銅錘白花片的質(zhì)量控制依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]鄭劍紅，黃奕濱，閔顯鋒. 益心丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J]. 中成藥，2009，31（7）：1061-1065.

[2] 趙小勤，蒲旭峰，孔衛(wèi)東，等. 獨(dú)活寄生丸的藥材鑒別及蛇床子素的測(cè)定[J]. 華西藥學(xué)雜志，2012，27（3）：342-344.

[3] 劉淑花，劉玉濤，姚繼紅，等. 白芍在配方顆粒沖劑與傳統(tǒng)飲片煎劑薄層色譜鑒別及芍藥苷含量比較[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（8） ：2665-2667.

[4]李云，蕭偉，秦建平，等. HPLC測(cè)定龍血竭提取物中龍血素A，B和7，4′一二羥基黃酮的含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（3） ：45-47.

[5]李虹，孫小玲. HPLC法測(cè)定龍血竭軟膠囊中龍血素B的含量[J]. 中國(guó)藥事，2010，24，（7）：696-697.

[6]胡迎慶，宗寧，劉岱琳. 反相高效液相色譜法測(cè)定龍血竭中紫檀芪的含量[J]. 藥物分析雜志，2002，22（6） ：428-429.

[7]陳文珠，陳豆. HPLC法同時(shí)測(cè)定龍血竭片中龍血素B和白藜蘆醇的含量[J]. 中藥材，2013，36（5）：827-829.

[8] 李忠瓊，向東. HPLC測(cè)定龍血竭中龍血素A和龍血素B的含量[J]. 華西藥學(xué)雜志，2005，20（4）：348-349.

[9]國(guó)家藥典委員會(huì)編. 中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[10]宋偉. 三拗湯制劑水提工藝優(yōu)選[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（13）：48-50.

（收稿日期：2015.12.28）