嗜吞噬細胞無形體對宿主細胞影響研究進展

張　艷，寧長申（河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450002）

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嗜吞噬細胞無形體對宿主細胞影響研究進展

張艷，寧長申＊
（河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450002）

摘 要：嗜吞噬細胞無形體是一種革蘭陰性菌，專性細胞內寄生，可經蜱傳播。主要侵染宿主的髓系細胞和非髓系細胞，引起動物蜱傳熱病和人粒細胞無形體病。論文總結了近年來與嗜吞噬細胞無形體入侵宿主細胞相關的蛋白質，如主要表面蛋白MSP2、外膜蛋白OmpA、嗜吞噬細胞無形體表面蛋白AipA等的研究成果，以及該病原菌進入宿主細胞后引起的宿主細胞的變化，如激活一系列蛋白激酶、抑制氧化反應和炎癥反應、干擾自噬作用等影響及其可能的機制。關于嗜吞噬細胞無形體，還有很多領域的問題亟待研究解決，國內外許多學者致力于研究該病原菌與宿主細胞的互作，以期找出嗜吞噬細胞無形體如何影響宿主細胞的信號傳導和相關基因的表達，從而逃避宿主免疫系統(tǒng)并在其中正常生存的機制。

關鍵詞：嗜吞噬細胞無形體；宿主細胞；影響

嗜吞噬細胞無形體（A.phagocytophilum）屬于甲型變形菌綱，立克次體目，無形體科，無形體屬。直徑0.4μm～1.3μm，個別可達2μm，專性胞內寄生，由雙層膜包裹的多形性球菌，外膜多褶皺，具有革蘭陰性的細胞壁，該病原菌存在于真核細胞胞質中與膜結合的空泡內，并從其中獲取營養(yǎng)物質進行二分裂繁殖，由于缺乏肽聚糖和脂多糖生物合成體系，因此該病原菌對機械壓力（如超聲波，凍融，滲透壓變化等）非常敏感［1］。電鏡觀察可見嗜吞噬細胞無形體常以兩種形態(tài)存在，即網狀體和致密體（DC）。致密體直徑多為1.5μm～2.5μm，個別可達6μm。蛋白質組學研究表明，網狀體只是嗜吞噬細胞無形體發(fā)育過程中的中間體形式，不具備感染哺乳動物細胞的能力，而致密體致密的類核不僅可以抵抗外界環(huán)境變化，而且可使該病原菌獲得侵染哺乳動物細胞的能力［2］。嗜吞噬細胞無形體適宜在髓系細胞或粒細胞中生長，其主要的宿主細胞是粒細胞，也可侵染內皮細胞［3］。目前已在人早幼粒細胞HL-60、早幼粒細胞白血病細胞KG-1、髓單核細胞THP-1、內皮細胞培養(yǎng)物和蜱細胞培養(yǎng)物中成功培養(yǎng)嗜吞噬細胞無形體［4］。該病原可感染人類、鹿、犬、貓、馬、反芻動物、嚙齒類動物等，導致感染動物發(fā)生蜱傳熱、無形體病。無形體病的主要臨床癥狀有高熱、食欲不振、精神萎靡，還可引起懷孕母畜流產等［5-6］。

1　嗜吞噬細胞無形體蛋白質研究

盡管嗜吞噬細胞無形體的基因組研究有助于揭示該病原菌的結構和功能，然而研究得較為清楚的蛋白質數量非常有限。嗜吞噬細胞無形體中含量最多的蛋白質是主要表面蛋白2（MSP2/p44），由多基因家族編碼，該多基因家族可能與嗜吞噬細胞無形體的宿主偏好性有關。嗜吞噬細胞無形體基因組中含有133 個MSP2/p44基因位點，編碼該基因家族的一系列外膜糖蛋白，后者參與了病原菌的多種生物學過程，如抗原多樣性、宿主適應性、細菌黏附和膜孔蛋白活性等［1］。MSP2基因的變化導致了不同地區(qū)嗜吞噬細胞無形體株型間抗原的多樣性，而這種多樣性則可能由免疫選擇誘發(fā)，導致病原菌在宿主中的長期感染。但有趣的是，該病原菌在細胞中經多次傳代后，MSP2基因的轉錄和蛋白質的表達受到抑制，表明該病原菌會選擇適宜其生存的新宿主細胞，這一發(fā)現(xiàn)證明MSP2在細胞黏附方面有重要作用［1，7］。嗜吞噬細胞無形體能結合在中性粒細胞和粒細胞表面的巖藻糖基化和唾液酸化的骨架蛋白上。目前研究最多的配體是P-選擇素糖蛋白配體-1（PSGL-1/CD162），嗜吞噬細胞無形體部分通過MSP2黏附在該配體上［7］。MSP2是黏附復合物的一個組成部分，該復合體除包含MSP2寡聚體外，還含有一些其他膜蛋白，如糖基磷脂酰肌醇（GIP）錨定蛋白（GAP）和Flotillin 1，這二者對病原

菌與宿主細胞的結合是必須的［8］。當病原菌以內體的形式被宿主細胞內化后，內體即不再積累晚期內體的標記分子，從而不能發(fā)育至成熟階段。內化是通過胞吞途徑完成的，病原菌的內化也影響了宿主細胞的胞吞過程，導致空泡不再被酸化或融合入溶酶體。

除了MSP2，另外一個研究較多的蛋白質是錨蛋白A（AnkA）［9］。該蛋白質的分子量為153ku～160 ku，包含氨基端的至少11個錨蛋白重復序列和1個羧基端短隨機重復序列。AnkA蛋白是目前研究者發(fā)現(xiàn)的Ⅳ型分泌系統(tǒng)兩個效應分子之一。嗜吞噬細胞無形體感染導致AnkA蛋白的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，磷酸化后的蛋白與宿主的酪氨酸磷酸酶SHP-1相互作用。AnkA蛋白在感染的粒細胞胞核中與染色質形成復合物。雖然關于AnkA蛋白是否影響嗜吞噬細胞無形體在宿主細胞中的存活還知之甚少，但它是目前已知的由該病原菌分泌的唯一一個蛋白質，它可能是通過嗜吞噬細胞無形體Ⅳ型分泌系統(tǒng)穿過病原菌和空泡膜，再進一步穿過細胞質膜和核膜進入細胞核內。在感染的中性細胞或HL-60細胞核中，AnkA與核蛋白質結合，隨后該復合體結合在DNA上缺乏保守區(qū)域的富含AT堿基的部位［9］，該蛋白只存在于受感染細胞的核中，可能這一結合會影響靶細胞中某些基因的轉錄，然而，AnkA是怎樣發(fā)揮作用影響真核基因轉錄的，還需要進一步的研究來證實。

在嗜吞噬細胞無形體附著和入侵宿主細胞這一過程中研究的較透徹的是兩種表面蛋白，即外膜蛋白A（OmpA）和14ku的A.phagocytophilum表面蛋白（Asp14）。OmpA氨基端胞外結構域中的19-74位氨基酸殘基可結合PSGL-1的路易斯抗原，當使用OmpA的抗體或重組OmpA全長蛋白或僅其氨基端結構域處理宿主細胞后，病原菌的進入都受到抑制［10］。Asp14對病原菌的侵入也是很關鍵的，其發(fā)揮作用的結構域是蛋白質羧基端12-24位氨基酸殘基。使用Asp14或OmpA重組蛋白單獨預先處理宿主細胞，可使病原菌的感染率減少57%～65%，而用兩者同時處理，則可使感染率下降90%，可見二者在促進病原菌入侵方面具有協(xié)同作用［11］。最新的研究表明，嗜吞噬細胞無形體表面蛋白AipA可介導病原菌入侵宿主細胞，該蛋白的1-87位氨基酸殘基對其發(fā)揮作用是必需的，進一步的試驗表明，該結構域中的9-21位氨基酸殘基介導了病原菌的入侵。使用AipA 1-87位氨基酸殘基結合Asp14以及OmpA重組蛋白幾乎可完全阻斷嗜吞噬細胞無形體的感染［12］。

Ⅳ型分泌系統(tǒng)的另外一個效應分子是無形體轉位基質-1（Ats-1）蛋白，它是在有目的地篩選嗜吞噬細胞無形體Ⅳ型分泌系統(tǒng)的效應分子時發(fā)現(xiàn)的［13］。Ats-1以依賴受體的形式跨過5層膜到達線粒體。Ats-1能抑制依托泊苷依賴的細胞色素C的釋放以及多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的剪切，而后兩者與細胞凋亡是密切相關的［13］。Huang B等［14］對含有嗜吞噬細胞無形體的空泡相關蛋白進行了一系列研究，結果顯示定位在空泡膜上的APH-1387在該病原菌胞內發(fā)育的整個過程中都有表達，然而，同樣位于空泡膜上的APH-0032只在感染的后期才有表達［15］。研究者利用抗體中和試驗證實致密體形態(tài)蛋白APH-1235在嗜吞噬細胞無形體感染宿主細胞的過程中也發(fā)揮作用，然而具體的機制還有待研究［16］。

2　嗜吞噬細胞無形體感染后宿主細胞的變化

嗜吞噬細胞無形體進入HL-60細胞后導致PSGL-1信號通路的活化，進而激活酪氨酸激酶（Syk），后者可將ROCK1磷酸化［35］，ROCK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可調節(jié)肌動蛋白（actin）的組裝，由此推測由ROCK1活化引起的actin的重組促進該病原菌進入靶細胞［17］。另有研究表明，嗜吞噬細胞無形體可通過依賴PSGL-1和不依賴PSGL-1兩種途徑感染哺乳動物細胞［18］。后者不需要Syk蛋白的參與，同時AnkA蛋白向核內的轉運也會減少。有研究表明，嗜吞噬細胞無形體可調節(jié)PI3K/AKT信號通路，該通路又可通過調控抗凋亡蛋白Mcl-1的表達進而影響中性粒細胞的凋亡過程［19］。另外一組學者的研究表明，嗜吞噬細胞無形體可活化ERK信號通路，并證實與中間絲狀體蛋白波形蛋白共定位的毒力分子AptA促使Erk1/2發(fā)生磷酸化［20］。

嗜吞噬細胞無形體的組氨酸激酶PleC和二鳥苷酸環(huán)化酶PleD組成雙組分系統(tǒng)，這一系統(tǒng)在該病原菌的胞內感染過程中發(fā)揮作用，活化的PleD產生cdi-GMP，后者能使嗜吞噬細胞無形體在哺乳動物細胞中定殖［21］。單核細胞受到嗜吞噬細胞無形體感染后，p38MAP激酶、PKC、PKA和PTK在促炎細胞因子的分泌方面有重要作用［8］。而在中性粒細胞中，p38 MAP激酶可使嗜吞噬細胞無形體抑制宿主細胞的凋亡［22］。嗜吞噬細胞無形體可通過清除由吞噬細胞氧化酶產生的過氧化物而在其最初侵染的宿主細胞中存活下來，這一過程可能是借助于其自身的超氧化物歧化酶實現(xiàn)的。受感染的HL-60細胞因為吞噬細胞氧化酶復合物（包括gp91phox/NOX2和Rac2）轉錄表達的減少而不能產生呼吸暴發(fā)［23］。吞噬細胞氧化酶的減少還可能產生其他效應，如局部炎癥調節(jié)作用受到抑制。嗜吞噬細胞無形體感染導致人中性粒細胞釋放IL-8，后者可招募中性粒細胞至感染部位，進

而成為病原菌新的靶細胞［24］。嗜吞噬細胞無形體感染還可引起中性粒細胞遷移率下降以及炎性內皮部位白細胞滲出減少，這兩種效應抑制了炎癥反應，促進該病原菌在宿主細胞內的生存［25］。

中性粒細胞的半衰期通常很短，所以病原菌要在其中生存，就必須干擾宿主細胞正常的凋亡程序?；罨闹行粤＜毎?4h～48h內進入程序性細胞死亡。嗜吞噬細胞無形體感染后，中性粒細胞的凋亡過程被推遲約24h［26］。這是由于嗜吞噬細胞無形體感染后，抗凋亡基因blc-2的表達量增加，中性粒細胞自發(fā)凋亡過程中Fas的聚集被阻斷，酶原8的剪切受到抑制，半胱天冬酶8得到活化，Bax向線粒體的轉位受到抑制，半胱天冬酶9得到活化以及半胱天冬酶抑制子XIAP的降解［1，27］。有研究表明，嗜吞噬細胞無形體感染還能激活PI3K/AKT信號通路，該信號通路可增加抗凋亡蛋白Mcl-1的表達，同時活化NFκB，進而促進感染細胞IL8的分泌，延遲宿主細胞的凋亡［19］。另外嗜吞噬細胞無形體的T4SS分泌的Ats-1可阻止線粒體對凋亡信號產生響應［13］。嗜吞噬細胞無形體的桑椹體由雙層脂膜包裹，并有自噬體的一些標記分子，如LC3、beclin-1、ATG 8和ATG 6［28］。嗜吞噬細胞無形體感染早期，病原菌包涵體分泌Ats-1進入細胞質，與Beclin1和ATG 14結合從而誘導omega體的形成，進一步地形成一個由雙層膜包裹的表面標記有LC3的自噬體，隨后與病原菌包涵體融合，并向空泡腔內轉運自噬體樣的小泡［29］。用自噬作用的誘導劑雷帕霉素處理宿主細胞后，嗜吞噬細胞無形體的感染進一步加強，而用抑制自噬作用的3-甲基腺嘌呤處理后，病原菌的生長受到抑制然而其內化未受影響。這一對比試驗表明自噬作用受到抑制有利于嗜吞噬細胞無形體在宿主細胞內的生長［28］。

3　展望

目前，在世界范圍內嗜吞噬細胞無形體已經成為一個危害公眾健康的重要蜱傳病原菌。雖然嗜吞噬細胞無形體的基因組很小，并且是專性胞內寄生，但是它既能在哺乳動物中性粒細胞中正常生長繁殖，也能在傳播媒介節(jié)肢動物體內完成生長周期，并通過一系列復雜的機制影響宿主細胞的凋亡過程和自噬作用，抑制宿主細胞正常的殺菌活性，最終導致機體感染的發(fā)生。然而，在這一過程中還有很多重要的問題亟待解決，例如，病原菌通過哪一個配體引起宿主的炎癥反應；先天性免疫反應和適應性免疫反應在其中各自的作用以及如何受到調控等。關于專性胞內寄生菌，未來要做的工作還有很多。

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Progress on Effects of A.phagocytophilumon Host Cells

ZHANG Yan，NING Chang-shen
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan，450002，China）

Abstract：A.phagocytophilumis a Gram-negative and obligate intracellular pathogen transmitted by ixodid ticks. This bacterium predominantly invades myeloid and nonmyeloid cells and causes tick-borne fever in animals and granulocytic anaplasmosis in humans.Here，we provided an overview on research of the related proteins involved in A.phagocytophiluminvasion into host cells，such as major surface protein MSP2，outer membrane protein OmpA，A.phagocytophilumsurface protein AipA.What's more，we also focused on the effects of A.phagocytophilumon host cells after its invasion and the underlying mechanisms.The influences such as activation of some protein kinases，downregulation of oxidative and inflammatory response，subversion of host apoptosis and autophagy were summarized in this paper.However，many scientific gaps about A.phagocytophilumare needed to fill currently.Fortunately，a large amount of researchers are focusing on howA.phagocytophiluminfluences cellular signal transduction and expressions of some related genes in neutrophils through investigating the interaction of the pathogen and the host cell to explore the underlying mechanisms that the bacterium can escape host immune system and survive in it.

Key words：A.phagocytophilum；host cell

作者簡介：張 艷（1986-），女，河南鄧州人，博士，主要從事嗜吞噬細胞無形體流行病學及致病機制研究。＊通訊作者

基金項目：國家現(xiàn)代肉羊產業(yè)技術體系建設專項（nycytx-39）

收稿日期：2014-09-10

中圖分類號：S852.6

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）05-0095-04