NtNramp1基因參與不同鎘積累基因型煙草品種鎘積累差異的功能解析

蔡海林，李帆，曾維愛，楊紅武，唐仲

1 湖南省煙草公司長沙市公司，煙葉生產(chǎn)技術中心，長沙市雨花區(qū)勞動東路359號 410011；

2 湖南省煙草公司，科技處，長沙市芙蓉南路一段628號 410004；

3 南京農(nóng)業(yè)大學，資源與環(huán)境科學學院，南京市玄武區(qū)衛(wèi)崗1號 210095

生物技術

NtNramp1基因參與不同鎘積累基因型煙草品種鎘積累差異的功能解析

蔡海林1，李帆1，曾維愛1，楊紅武2，唐仲3

1 湖南省煙草公司長沙市公司，煙葉生產(chǎn)技術中心，長沙市雨花區(qū)勞動東路359號 410011；

2 湖南省煙草公司，科技處，長沙市芙蓉南路一段628號 410004；

3 南京農(nóng)業(yè)大學，資源與環(huán)境科學學院，南京市玄武區(qū)衛(wèi)崗1號 210095

【目的】探究不同品種煙草鎘積累差異的分子機制?！痉椒ā坎捎猛纯寺》椒◤臒煵莶煌k積累基因型品種中克隆擬南芥AtNramp1同源基因NtNramp1；應用生物信息學方法分析煙草不同鎘積累基因型品種中NtNramp1基因序列差異；通過酵母異源表達系統(tǒng)研究煙草不同鎘積累基因型品種的NtNramp1對鎘的轉(zhuǎn)運活性差異?！窘Y果】金英和Komotini Basma兩個煙草品種對鎘的積累存在顯著差異；從鎘積累顯著差異的兩個煙草品種中克隆到的NtNramp1基因（分別命名為NtNramp1a和NtNramp1b）編碼區(qū)存在57個單堿基差異，其中NtNramp1a1305位堿基變異(G＞A)導致所編碼蛋白比NtNramp1b編碼蛋白缺少C端兩次跨膜；酵母異源表達結果表明來自低鎘含量品種金英的NtNramp1a轉(zhuǎn)運鎘的活性比來自高鎘含量品種Komotini Basma的NtNramp1b轉(zhuǎn)運鎘活性顯著降低?！窘Y論】金英和Komotini Basma兩個煙草品種中NtNramp1蛋白活性差異是導致兩煙草品種鎘積累差異的重要原因。

煙草；鎘；Nramp基因；序列差異；酵母異源表達

隨著我國工業(yè)化、城鎮(zhèn)化的快速發(fā)展，環(huán)境重金屬污染問題日益突出。根據(jù)國土資源部的調(diào)查結果，我國受重金屬污染耕地已超過3億畝[1]。國內(nèi)外大量的研究表明，重金屬鎘（Cd）對人體毒性較強，被國際衛(wèi)生組織列為生物毒性最強的重金屬元素之一，而且比較容易從土壤被植物吸收進入食物鏈，也是影響農(nóng)產(chǎn)品安全最重要的重金屬污染元素之一。煙草是我國重要的經(jīng)濟作物，也是一種易積累鎘的作物[2]，環(huán)境中過量的Cd被煙草吸收和積累，不僅會影響煙草的生長發(fā)育，造成煙葉產(chǎn)量及品質(zhì)的下降[3]，同時煙葉中積累的Cd也能通過呼吸道進入人體，可對人體的腎臟、骨骼、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生毒性[4-5]。隨著社會對煙草的關注度越來越高，煙草的安全性問題受到高度重視。因此，煙葉中鎘的控制成為近年來煙草減害的研究熱點之一。植物對鎘的吸收存在基因型差異，利用這種差異，已經(jīng)培育出低鎘累積的小麥、向日葵、大豆等[6]，培育低鎘品種在控制作物鎘含量中顯示出了良好的應用前景。煙草對鎘的吸收和積累也存在基因型差異，但造成煙草品種間鎘吸收積累差異的原因尚不清楚。

天然抗性相關巨噬細胞蛋白家族(natural resistance-associated macrophage protein, NRAMP) 是古老的膜整合轉(zhuǎn)運蛋白家族，也是廣泛存在于細菌、真菌、動物和植物中的一個高度保守的膜蛋白家族，參與多種二價金屬離子（如Mn2+、Zn2+、Fe2+、Cd2+等）的運輸[7]。NRAMP蛋白最早在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)，小鼠中NRAMP1是第一個被鑒定的NRAMP家族成員，該基因主要在吞噬細胞中特異性表達，其通過對金屬離子如Mn2+和Fe2+等的轉(zhuǎn)運來參與巨噬細胞對病菌侵染的抵御過程[8-9]。已發(fā)現(xiàn)在酵母中存在3個NRAMP同源基因SMF1～3，具有調(diào)節(jié)Mn、Cu、Cd、Fe和Co運輸?shù)墓δ躘10-12]。在高等植物中鑒定到多個NRAMP家族基因。擬南芥中存在6個NRAMP基因，分別為AtNramp1-AtNramp6。AtNramp1基因表達受缺鐵誘導，其編碼的蛋白不僅是重要的鐵轉(zhuǎn)運體，也是一種高親和錳轉(zhuǎn)運蛋白，參與擬南芥錳的吸收轉(zhuǎn)運[13-14]。AtNramp3和AtNramp4 都是定位在液泡膜上的NRAMP蛋白，參與液泡中鎘離子外排至細胞質(zhì)中[15]。擬南芥過量表達AtNramp3，4和6均能增加擬南芥對Cd的敏感性[15-17]。水稻中OsNramp1參與根系細胞對Cd 的吸收和轉(zhuǎn)運，不同品種間根系OsNramp1表達量的差異是品種間Cd積累的差異的重要原因之一[18]。OsNramp5主要在根系成熟區(qū)外皮層和內(nèi)皮層細胞表達，是水稻主要的Cd吸收轉(zhuǎn)運體，對水稻Cd吸收能力的貢獻率超過90%[19-20]。盡管很多研究表明NRAMP在植物對Cd的吸收和轉(zhuǎn)運過程中起著重要作用，但目前還沒有不同煙草品種中NRAMP基因功能活性差異的研究報道。

本文采用同源序列分析法從兩種鎘積累顯著差異的煙草品種中克隆獲得與擬南芥AtNramp1同源的NtNramp1基因，通過實時熒光定量PCR方法比較了NtNramp1基因在不同鎘積累品種中的表達，對不同品種來源NtNramp1基因序列及預測蛋白結構差異進行了分析；同時通過酵母異源表達系統(tǒng)對煙草不同鎘積累品種中NtNramp1活性進行了比較。初步揭示了造成不同煙草品種鎘積累能力差異的原因，本文可為培育低鎘煙草品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草品種為曬煙品種金英（Nicotiana tabacumL.）和香料煙品種Komotini Basma（Nicotiana tabacumL.）。煙草種子滅菌后于28℃黑暗條件下催芽，發(fā)芽后移入蛭石：營養(yǎng)土（1:2）培養(yǎng)基中培養(yǎng)至6葉1心期備用。煙苗培養(yǎng)在恒溫光照培養(yǎng)箱中進行，控制條件為光照16 h/d，溫度28℃（晝）/20℃（夜），相對濕度為70%。

RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit及熒光定量試劑盒HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；測序及引物合成均在南京金斯瑞生物科技有限公司進行。

供試酵母菌株為SEY6210 (MATα; leu2–3112;ura3–52; his3-Δ200; trp1-Δ901; suc2-Δ9; lys2–801)；酵母表達質(zhì)粒pYES2購自Invitrogen公司。

1.2 試驗設計

采用苗期水培試驗，設置0和0.5 μmol/L兩個鎘處理水平，每處理4次重復。具體操作為：選取大小基本一致的6葉1心期煙苗，用1/2 Hoagland營養(yǎng)液預培養(yǎng)1周后，將煙苗移入5 L含Cd營養(yǎng)液（CdCl2配制）的塑料小盆，每盆移栽8株，每品種4株。培養(yǎng)期間每3天更換1次營養(yǎng)液，除鎘處理外，培養(yǎng)條件與預培養(yǎng)一致。培養(yǎng)3天后，將煙苗從盆中取出，先用自來水沖洗3次，再用去離子水沖洗3次，最后用0.5 mM CaCl2溶液洗根10 min，濾紙吸干表面水分，將根系及地上部分開，于70℃烘箱烘干至恒重備用。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 鎘含量測定

植物樣品中鎘含量采用NY/T1100-2006硝酸高氯酸混合酸的消解方法進行消解，采用ICP-MS（PerkinElmer公司）進行鎘含量測定。

1.3.2NtNramp1基因克隆

利用RNA提取試劑盒提取幼苗根系的總RNA，用核酸濃度測定儀測定提取的RNA的濃度和純度。以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）公布的擬南芥AtNramp1的基因序列，BLAST NCBI數(shù)據(jù)庫中普通煙草物種基因組。檢索到相似性較高的序列，登錄號為XM_016625392.1，根據(jù)該序列設計上下游引物NtNramp1F: 5’-CGTTTACCTGACATCAGAACAAC-3’,NtNramp1R: 5’-GGGATATCAGCAAGATCCTCTC-3’，以煙草根系反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系為25.0 μL：cDNA 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Taq 聚合酶1μL，5 X Taq Buffer 4 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2 μL，ddH2O 15.0 μL。 擴增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃90s，進行30個循環(huán)；72℃7min；4℃10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，目標片段切膠回收。回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞。陽性克隆進行菌液PCR驗證，并挑選陽性菌株送金斯瑞公司測序。

1.3.3NtNramp1基因序列及進化分析

采用DNAMAN軟件進行多序列比對；采用NCBI的BLAST序列比對工具進行同源性比對；使用TMHMM 軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析跨膜結構域。

1.3.4NtNramp1基因表達量分析

將兩基因型煙草6葉期幼苗預培養(yǎng)后，1/2 Hoagland營養(yǎng)液中添加終濃度為10 μM CdCl2處理24h后，去離子水清洗根系兩遍，液氮速凍備用。利用百泰克公司RNA提取試劑盒提取根系總RNA。紫外分光光度計測定OD260/OD280，確定總RNA的質(zhì)量。采用南京諾唯贊生物科技有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成總RNA的第一鏈cDNA。根據(jù)已克隆的基因序列用Premier5.0軟件設計特異性檢測引物（qNtNramp1F: 5’-CGTAGTATTTCCGTTGATGGC-3’；qNtNramp1R：5’-TGGATTGTCCTTAATTGGGTC-3’）。以UBC(GenBank: AB026056.1)為內(nèi)參基因，引物為：qUBCF：5’-GCGAGATTGTTGAACAGAGCT-3’；qUBCR：5’-TACATAGTCCATTCGTAGTTGAGC-3’，采用SYBR GREEN染料法， CFX96定量PCR儀（BioRad公司）進行實時熒光定量PCR檢測。反應程序為：95℃ 5min；95℃ 20s，55℃ 20s，72℃20s，40個循環(huán)；72℃單點檢測SYBR GREEN 熒光信號。結束后最后加入熔解曲線程序：95℃ 0s，60℃15s，0.5 ℃遞增至95℃，每梯度10s，連續(xù)檢測信號。根據(jù)數(shù)據(jù)分析得到各個樣品的CT值，相對表達量水平采用2-ΔΔCT的方法進行計算。

1.3.5NtNramp1基因酵母異源表達分析

提取的重組質(zhì)粒pYES2-NtNramp1a，pYES2-NtNramp1b以及空載pYES2采用醋酸鋰的方法[21]轉(zhuǎn)化釀酒酵母SEY6210，接種重組酵母菌株(轉(zhuǎn)有目的基因的實驗組與對照組)單菌落于SD-U中活化，30℃搖床中培養(yǎng)至OD600＝1.0時，將其菌液分別稀釋 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，取2μL點板在含有 0、10、20和30 μM鎘的SD-U固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3d，觀察酵母菌生長情況并拍照記錄，每種鎘濃度處理3個重復。

1.3.6 酵母轉(zhuǎn)化子鎘處理條件下的生長曲線

為了解NtNramp1酵母轉(zhuǎn)化子的耐鎘能力，挑取轉(zhuǎn)化后的酵母SEY6210 單菌落（分別含空表達載體和目的基因表達載體，分別命名為WT+PYES2，WT+NtNramp1a和WT+NtNramp1b），接種至5mLSD-U液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，30℃下220 rpm振蕩過夜培養(yǎng)。測定OD600值至0.5左右。各取1 mL過 夜培 養(yǎng) 的WT+PYES2， WT+NtNramp1a和WT+NtNramp1b菌液，將OD600調(diào)整至0.5后各取0.1 ml接種至50 mL分別含5 μM CdCl2的SD-U液體培養(yǎng)基中，混合均勻后測得初始的OD600值。隨后在30℃、220 rpm條件下振蕩培養(yǎng)，每隔2-4h 測定一次OD600值，至58 h。每種菌液重復三次接種，并通過OD600值作出生長曲線圖。

1.3.7 酵母轉(zhuǎn)化子鎘含量測定

為了測試轉(zhuǎn)基因酵母內(nèi)的鎘含量，分別取WT+PYES2， WT+NtNramp1a和 WT+NtNramp1b菌液加鎘處理，處理條件同1.3.6，培養(yǎng)48 h 后，用50 mL離心管以2500 rpm 的轉(zhuǎn)速離心2 min，除去上清。加入50 mL蒸餾水重懸，2500 rpm，離心2 min，除去上清，并重復洗滌3次。將50 mL離心管置于80℃烘箱中烘干至恒重。萬分位天平秤取一定量的樣品放入消化管中，加5 mL硝酸高氯酸混合酸，石墨爐消解儀中180℃下消解， 直至消解管中剩0.5 mL的液體，冷卻至室溫后，雙蒸水沖洗后定容至25 mL，應用ICP-MS測定鎘含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS18.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，葉片和根系鎘含量數(shù)據(jù)采用student’s T-test檢驗；酵母鎘含量數(shù)據(jù)用Tukey多重比較檢驗，所有數(shù)據(jù)均在5%水平進行顯著性分析，以a、b、c表示其差異性，未標有相同小寫字母表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 兩基因型品種根系與地上部鎘含量比較

同一水培鎘處理條件下，兩種基因型煙草品種葉片和根系鎘積累如圖1A所示，金英品種葉片鎘含量為7.41mg kg-1，顯著低于Komotini Basma品種葉片鎘含量13.7 mg.kg-1，金英葉片中鎘含量約為Komotini Basma葉片種鎘含量的54%；金英品種根系中鎘含量約為Komotini Basma根系鎘含量的60%（圖1B），根系中鎘含量差異呈現(xiàn)與葉片鎘含量差異一致的趨勢。

圖1 兩基因型品種葉片與根系鎘含量比較Fig.1 Cd concentration in roots and leaves of two tobacco cultivars

葉片/根系鎘含量比值能反應鎘從根系往葉片轉(zhuǎn)運情況[22]，分析圖2結果可以看出兩個煙草品種間葉片/根系鎘含量比無顯著差異（圖2），說明兩個煙草品種間鎘從根系往葉片轉(zhuǎn)運的能力沒有顯著差異。

圖2 兩基因型品種葉片/根系鎘含量比Fig.2 The shoot/root ratio of Cd in two tobacco cultivars

2.2 兩基因型品種NtNramp1基因克隆與序列分析

將擬南芥鎘轉(zhuǎn)運蛋白基因AtNRAMP1序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得普通煙草NtNRAMP1基因序列（登錄號：XM_016625392.1），根據(jù)NtNRAMP1基因序列設計特異引物 （NtNramp1F和NtNramp1R），分別對煙草品種金英和Komotini Basma的cDNA進行擴增，產(chǎn)物克隆至pEasy-blunt載體測序，得到兩基因型煙草品種NtNramp1基因序列，分別命名為NtNramp1a和NtNramp1b，從兩序列比對結果（圖3）看出，煙草品種金英中NtNramp1a編碼區(qū)序列與Komotini Basma中NtNramp1b編碼 區(qū) 序 列 存 在57個SNP（Single Nucleotide Polymorphisms，單核苷酸多態(tài)性）位點（圖3），編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸發(fā)現(xiàn)，金英品種中NtNramp1a在編碼區(qū)1305位的堿基變異（G＞A）(圖3箭頭所示處)導致蛋白翻譯提前終止，形成一個不完整的蛋白(圖4A)，跨膜分析表明金英中NtNramp1a蛋白(圖4B)比Komotini Basma中NtNramp1b蛋白(圖4C)缺少兩次跨膜，這可能會導致兩個品種NtNramp1蛋白活性存在差異。

圖3 兩基因型品種NtNramp1基因編碼區(qū)序列差異Fig.3 Sequence difference in coding region ofNtNramp1between two tobacco cultivars

圖4 兩基因型品種NtNramp1基因氨基酸序列及跨膜結構差異Fig.4 The difference of amino acid sequence and transmembrane structure ofNtNramp1between two tobacco cultivars

2.3 兩基因型品種NtNramp1的表達

為了解兩基因型煙草品種中NtNramp1基因的表達模式，分析了鎘處理條件下，兩基因型煙草品種根系和葉片中NtNramp1的表達量，結果發(fā)現(xiàn)NtNramp1基因主要在根系表達，葉片中幾乎檢測不到；不加鎘處理中，金英和Komotini Basma根系中NtNramp1基因表達量并無顯著差異；在10 μM鎘處理中，金英和Komotini Basma根系中NtNramp1基因表達量有受誘導的趨勢，但差異不顯著，說明鎘處理不會顯著誘導或抑制煙草中NtNramp1基因的表達（圖5）。另外，該結果也表明兩基因型煙草根系中NtNramp1基因的表達量對兩基因型煙草鎘積累差異沒有顯著影響。

圖5 兩基因型品種NtNramp1基因表達Fig.5 Expression ofNtNramp1in the roots of two tobacco cultivars

2.4 兩基因型品種NtNramp1酵母異源表達分析

為弄清NtNramp1a和NtNramp1b蛋白轉(zhuǎn)運鎘的活性是否存在差異，分別構建NtNramp1a和NtNramp1b酵母過表達載體，將NtNramp1a、NtNramp1b酵母表達載體和空載體分別轉(zhuǎn)入SEY6210酵母中，篩選陽性菌株，搖菌活化后稀釋成相同的倍數(shù)并在含有 0 μM、10 μM、20 μM 和 30 μM CdCl2的SD-U 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d。結果（圖6）發(fā)現(xiàn)，在不加鎘的培養(yǎng)基上，含有空表達載體、NtNramp1a和NtNramp1b基因表達載體的酵母菌落大小和數(shù)量基本一致，長勢也基本一致。10 μM鎘處理中，含有空載體的酵母生長幾乎不受影響，表達NtNramp1a酵母的生長受到輕微抑制，而表達NtNramp1b基因的酵母轉(zhuǎn)化子受抑制情況比表達NtNramp1a酵母轉(zhuǎn)化子嚴重；20 μM鎘處理時，含有空載體的酵母生長受到輕微抑制，表達NtNramp1a和NtNramp1b兩種酵母的生長均受到一定程度的抑制，但表達NtNramp1b基因的酵母轉(zhuǎn)化子受抑制程度比表達NtNramp1a酵母轉(zhuǎn)化子嚴重，尤其是30 μM濃度下，趨勢更為明顯。該結果表明，在鎘處理條件下，異源表達NtNramp1a和NtNRAMP1b基因增加了酵母對鎘的吸收積累，從而產(chǎn)生嚴重的鎘毒害作用，而表達NtNramp1b基因的酵母比表達NtNramp1a基因的酵母受鎘毒害更為嚴重，說明NtNramp1b轉(zhuǎn)運鎘的能力比NtNramp1a更強。

圖6 鎘脅迫下NtNramp1基因的酵母異源表達Fig.6 Heterologous expression ofNtNramp1aandNtNramp1bin yeast under Cd stress

2.5 酵母轉(zhuǎn)化子在鎘脅迫條件下的生長曲線

為進一步了解表達NtNramp1a和NtNramp1b基因?qū)湍改玩k能力的影響，將分別含有空載體、NtNramp1a和NtNramp1b基因表達載體的酵母轉(zhuǎn)化子過夜培養(yǎng)。接種相同的菌液至含10 μM CdCl2和不含鎘的SD-U液體培養(yǎng)基中，處理培養(yǎng)58 h，測定生長曲線。結果（圖7）發(fā)現(xiàn)：在不加鎘條件下， 0 h至14 h內(nèi)，空載體酵母和表達NtNramp1a、NtNramp1b基因的酵母長勢較為一致，而14 h之后，隨著時間的增長，三種酵母的OD600值均表現(xiàn)為指數(shù)增長的狀態(tài)，三種酵母之間增長幅度并無顯著差異；在加10 μM CdCl2條件下，0 h至27 h內(nèi)空載體酵母和表達NtNramp1a、NtNramp1b基因的酵母長勢較為一致，而27 h之后，含有空載體的酵母OD600值開始表現(xiàn)為指數(shù)增長的狀態(tài)，而表達NtNramp1a基因的酵母OD600值在培養(yǎng)40 h后才開始表現(xiàn)為指數(shù)增長的狀態(tài)，表達NtNramp1b基因的酵母在培養(yǎng)45 h后才緩慢生長，且OD600值在培養(yǎng)58 h后才達到0.1左右。以上結果表明，在鎘處理條件下，表達NtNramp1b基因的酵母生長狀況較表達NtNramp1a基因的酵母轉(zhuǎn)化子差。酵母轉(zhuǎn)化子在鎘處理條件下生長曲線的實驗結果與點板實驗結果一致，均表明表達NtNramp1b基因的酵母比表達NtNramp1a基因的酵母在鎘脅迫下生長受更嚴重的抑制。

圖7 兩基因型煙草NtNramp1轉(zhuǎn)基因酵母耐鎘性比較Fig.7 Difference of growth curve between the yeast expressedNtNramp1aandNtNramp1b

2.6 酵母轉(zhuǎn)化子鎘含量測定

為了更進一步分析NtNramp1a和NtNramp1b基因?qū)湍阜e累鎘的影響，分別將帶有空載體、NtNramp1a和NtNramp1b基因的酵母SEY6210活化，在含5 μM CdCl2的SD-U液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，測定其鎘含量。結果（圖8）發(fā)現(xiàn)，在鎘處理條件下，在酵母菌株SEY6210中，表達NtNramp1b基因酵母的鎘含量顯著高于表達NtNramp1a和空載體酵母的鎘含量。綜合上述結果一方面可以說明NtNramp1a和NtNramp1b基因的表達均增加了轉(zhuǎn)基因酵母對鎘離子的吸收，轉(zhuǎn)基因酵母體內(nèi)積累了更多的鎘離子，從而引起更為嚴重的鎘毒害作用，使轉(zhuǎn)基因酵母生長受抑制，另一方面也說明NtNramp1b轉(zhuǎn)運鎘離子能力顯著強于NtNramp1a。

圖8 兩基因型煙草NtNramp1轉(zhuǎn)基因酵母鎘含量差異Fig.8 Cd concentration in the yeast expressedNtNramp1aandNtNramp1b

3 討論與結論

植物對有毒重金屬的吸收積累與基本礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收密切相關，已有的研究表明重金屬如鎘、砷等進入并分布到植物體內(nèi)是通過礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收運輸通道來實現(xiàn)的[18-19,23]。轉(zhuǎn)運蛋白不僅在植物體內(nèi)礦質(zhì)必需元素運輸過程中發(fā)揮重要作用，而且可轉(zhuǎn)運重金屬。大多數(shù)NRAMP轉(zhuǎn)運蛋白有運輸必需元素如鐵(Fe)、錳(Mn)的能力，也能運輸如鎘的有毒重金屬[13-20]。盡管目前已經(jīng)從多種植物中克隆了多個NRAMP家族基因，并對其作用機制進行了研究，但在鎘超積累經(jīng)濟作物煙草中對NRAMP家族基因參與煙草鎘吸收積累的研究較少。

為進一步解析不同煙草品種間鎘積累能力差異的分子機制，本研究從前期工作篩選到的兩個具有顯著鎘積累差異的煙草種質(zhì)資源中克隆得到2個NtNramp1基因，這兩個基因的編碼區(qū)序列存在57個SNP差異。高鎘積累品種Komotini Basma中NtNramp1b編碼一個538個氨基酸組成的NtNramp1b蛋白，而低鎘積累品種金英中NtNramp1a因1305位SNP導致翻譯提前終止，編碼一個不完整的NtNramp1a蛋白。通過跨膜結構分析發(fā)現(xiàn)NtNramp1a比NtNramp1b在C端缺少兩次跨膜，這可能會導致兩者活性存在差異。

本研究通過酵母異源表達NtNramp1a和NtNramp1b研究兩者對鎘轉(zhuǎn)運的影響，發(fā)現(xiàn)低鎘積累煙草品種金英中NtNramp1a對鎘的轉(zhuǎn)運活性顯著低于高鎘積累煙草品種Komotini Basma中的NtNramp1b。由于兩基因型煙草品種間鎘從根系向葉片轉(zhuǎn)運的能力并沒有顯著差異，因此造成兩基因型煙草品種間鎘積累差異的主要原因可能是根系對鎘的吸收能力的差異，結合兩基因型煙草品種中NtNramp1轉(zhuǎn)運蛋白對鎘的轉(zhuǎn)運活性存在顯著差異，可以認為兩基因型煙草品種中根系NtNramp1蛋白活性差異是導致兩基因型煙草品種間鎘積累差異的主要原因。

本研究表明不同煙草品種對重金屬鎘的吸收積累具有基因型差異，不同煙草品種中NtNramp1基因?qū)︽k轉(zhuǎn)運活性的差異是引起不同煙草品種鎘積累差異的重要原因。因此，下一步的研究可以通過遺傳操作敲除煙草根系中具有鎘吸收活性的NtNramp1基因，驗證NtNramp1基因功能缺失對降低煙草鎘積累的效果。當然植物中存在多個參與重金屬鎘吸收積累的基因，植物對鎘的吸收積累特性是由多個基因共同參與控制調(diào)節(jié)，因此克隆更多不同鎘積累基因型煙草相關基因序列，進一步深入探討不同基因型煙草鎘積累的分子機制對于培育低鎘煙草品種、降低煙草鎘含量具有重要意義。

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Functional analysis ofNtNramp1pariticipating in Cd accumulation in tobacco of different Cd accumulating genotypes

CAI Hailin1，LI Fan1，ZENG Weiai1，YANG Hongwu2，TANG Zhong3*
1 Hunan Changsha Municipal Tobacco Company, Changsha 410011, China;
2 Hunan Provincial Tobacco Company, Changsha 410004, China;
3 Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

The present study was conducted to investigate the molecule mechanism of different cadmium accumulation ability among tobacco varieties.Based onAtNramp1sequence ofArabidopsis thaliana,NtNramp1gene from Jinying and Komotini Basma with different cadmium accumulation ability were cloned and their sequence was analyzed by bioinformatics methods.Yeast heterologous expression system was used to analyze different cadmium transport activity of NtNramp1.Results showed that Jinying and Komotini Basma were two tobacco varieties (Nicotiana tabacumL.) that had significant difference of cadmium accumulation ability.NtNramp1cloned from Jinying and Komotini Basma were named asNtNramp1aandNtNramp1brespectively.There were 57 single nucleotide polymorphisms(SNP) in the coding region betweenNtNramp1aandNtNramp1b.The SNP in 1305 bp ofNtNramp1aled to premature termination of protein translation, which resulted in missing of two transmembrane structure in the C-terminal compared withNtNramp1b.Heterologous expression ofNtNramp1aandNtNramp1bin yeast showed that the yeast strain expressingNtNramp1bwas more sensitive to cadmium than the that expressingNtNramp1a, suggesting that cadmium transport activity of NtNramp1b was significantly stronger than that of NtNramp1a.Different cadmium transport activities ofNtNramp1between Jinying and Komotini Basma resulted in signi fi cant cadmium accumulation difference between the two tobacco varieties.

Nicotiana tabacum L.; cadmium; Nramp gene; sequence difference; yeast heterologous expression

蔡海林，李帆，曾維愛，等.NtNramp1基因參與不同鎘積累基因型煙草品種鎘積累差異的功能解析[J].中國煙草學報，2017, 23（4）

長沙市煙草公司科技專項(CYKJ2014-03)

蔡海林（1979—），博士，農(nóng)藝師，主要研究方向煙草病蟲害綠色防控技術，Tel：0731- 87969507，Email：hailincai@126.com

唐 仲（1985—），博士，講師，主要研究方向為植物重金屬積累與解毒的分子機制，Tel：025-84399551，Email：tangzhong@njau.edu.cn

2016-11-18；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡出版日期：

日期：2017-03-23

：CAI Hailin，LI Fan，ZENG Weiai, et al.Functional analysis ofNtNramp1pariticipating in Cd accumulation in tobacco of different Cd accumulating genotypes [J].Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(4)

*Corresponding author.Email：tangzhong@njau.edu.cn