茉莉酸甲酯誘導(dǎo)煙草抗蟲的有效濃度和持效期

張林娜，陳文峰，范銳，周琳，尹新明，馮超，趙特，高飛，孫淑君，游秀峰，劉向陽

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 鄭州 450002;

2 河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點實驗室, 鄭州450002;

3 商丘師范學(xué)院環(huán)境與規(guī)劃學(xué)院, 商丘 476000;

4 信陽農(nóng)林學(xué)院, 信陽 464000;

5 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所, 青島 266101

植物保護

茉莉酸甲酯誘導(dǎo)煙草抗蟲的有效濃度和持效期

張林娜1,2，陳文峰3，范銳1,2，周琳1,2，尹新明4，馮超5，趙特1,2，高飛1,2，孫淑君1,2，游秀峰1,2，劉向陽1,2

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 鄭州 450002;

2 河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點實驗室, 鄭州450002;

3 商丘師范學(xué)院環(huán)境與規(guī)劃學(xué)院, 商丘 476000;

4 信陽農(nóng)林學(xué)院, 信陽 464000;

5 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所, 青島 266101

為闡明茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)煙草抗蟲機制，用50 μmol/L和150 μmol/L的MeJA乙醇水溶液噴灑煙苗，24 h和48 h后取葉片分別喂食棉鈴蟲和甜菜夜蛾，每隔6 h監(jiān)測取食量及體重變化，同時通過Folin-Ciocalteu比色法檢測煙葉總多酚含量變化，并利用組織化學(xué)染色法統(tǒng)計分泌蔗糖酯的腺毛數(shù)。結(jié)果顯示：（1）對于棉鈴蟲，50 μmol/L和150 μmol/L的MeJA噴施煙苗24 h～48 h后，試蟲取食量和體重增加量均顯著低于對照，而對于甜菜夜蛾，僅150 μmol/L MeJA處理煙苗24 h后引起試蟲取食量和體重增加量明顯降低；（2）MeJA誘導(dǎo)煙葉總多酚含量增加，增加量與MeJA濃度呈正相關(guān)；（3）MeJA導(dǎo)致煙葉分泌蔗糖酯的腺毛密度降低，腺毛密度與MeJA濃度呈負相關(guān)。MeJA誘導(dǎo)煙草抗蟲具有一定的持效期且抗蟲效果受其濃度影響，而總多酚含量增加和代謝改變或許是煙草產(chǎn)生抗蟲性的部分原因。

煙草；抗性；茉莉酸甲酯；持效期；有效濃度

茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate, MeJA）不僅能夠誘導(dǎo)植物生成特殊次生代謝物質(zhì)和揮發(fā)性化合物，還可以誘導(dǎo)植物形成防御性結(jié)構(gòu)，抵御病蟲侵害[1-3]。水稻、番茄和棉花噴施外源MeJA不僅可提高對咀嚼式口器害蟲（棉鈴蟲、甜菜夜蛾和斜紋夜蛾）的抗性，還可增強對刺吸式口器害蟲（蚜蟲和飛虱）的防御能力[4-10]。外源MeJA還可提高茶樹、楊樹、松樹、柿樹等對害蟲的抗性[11-14]。

棉鈴蟲（Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）是煙葉生產(chǎn)的重要害蟲。王俊斌等證實100 μmol/L的MeJA處理的煙草對棉鈴蟲的抗性顯著提升[15]，席征等的結(jié)果顯示不同濃度MeJA處理的煙草對斜紋夜蛾展現(xiàn)了不同程度的抗性[16]。MeJA能否誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對甜菜夜蛾的抗性尚未見報道。本文測定了不同濃度MeJA處理對煙葉總多酚含量、腺毛密度和對棉鈴蟲、甜菜夜蛾取食、生長的影響，以期探明MeJA誘導(dǎo)煙草抗蟲的有效濃度和持效時間，為MeJA在煙草上的防蟲應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試煙草

品種“豫煙11號”，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)賈宏昉和蔣士君提供。

1.1.2 試劑

Hoagland營養(yǎng)液；MeJA（英國Apex Organics公司）；羅丹明B（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；Folin-Ciocalteu試劑（美國Sigma公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制

稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1g溶于70%乙醇，配制濃度為10 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）；稱取10.0 g無水Na2CO3，用去離子水溶解，配制10% Na2CO3溶液；稱取0.2 g MeJA，用無水乙醇溶解，用去離子水稀釋，配制所需濃度的MeJA溶液，所含乙醇終濃度為0.1%。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)方程

取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、1、2、3、4、5、6 mL，各加入Folin-Ciocalteu試劑0.5 mL，充分振蕩后靜置3 min，加入10% Na2CO3溶液0.5 mL，置25℃水浴2 h，測定720 nm處吸光度值。建立吸光度與沒食子酸含量的回歸方程。

1.2.3 試蟲取食量和體重增加量的測定

將3葉期的煙苗放置在溫室中25±2℃培養(yǎng)，每隔3 d澆灌1次Hoagland營養(yǎng)液，待煙苗長至6葉期。

棉鈴蟲、甜菜夜蛾取食量和體重增加量的測定參照王俊斌等[15]和Howe等[17]所述方法，并稍做改良。選取3組大小一致的6葉期煙苗，每組10株，分別噴灑50 μmol/L、150 μmol/L的MeJA乙醇水溶液和0.1%乙醇（對照）。選擇大小一致、健康狀況良好的3齡棉鈴蟲幼蟲和4齡甜菜夜蛾幼蟲作為供試?yán)ハx，試驗前饑餓2 h，逐頭稱重，放入24孔養(yǎng)蟲板中，每孔1頭。摘取處理24 h和48 h后的煙葉，用蒸餾水洗凈，用圓形打孔器打制直徑為1 cm的葉碟，采用1孔+1葉+1蟲的方式放入養(yǎng)蟲板，每組30頭試蟲，每隔6 h檢查1次，及時補充葉片。48 h后統(tǒng)計葉片被取食面積并收集幼蟲，饑餓2 h后稱重。

1.2.4 煙草葉片表面腺毛數(shù)量測定

分泌蔗糖酯（Sucrose Esters, SE）腺毛的組織化學(xué)標(biāo)記參照Lin和Wanger的方法[18-19]，并稍做改良。選取5組大小一致的6葉期煙苗，每組10株，分別用0.025 mmol/L、0.25 mmol/L、0.75 mmol/L和3 mmol/L MeJA的乙醇水溶液和0.1%乙醇（對照）噴灑煙苗， 48 h后剪下煙株第4片葉，用0.2%（w/v）羅丹明B水溶液染色60 min后，在清水中浸泡5 s，除去未結(jié)合的羅丹明B。晾干后在葉片中間位置以主脈為軸對稱地用圓形打孔器打制直徑為1 cm的2個圓形葉碟，體視顯微鏡下觀察，計數(shù)葉碟上分泌蔗糖酯的腺毛數(shù)。每個處理重復(fù)5次，統(tǒng)計單位面積上的腺毛數(shù)量。

1.2.5 煙草植株總多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu比色法[20]，以沒食子酸為對照。

選出5組性狀大小接近的6葉期煙苗，每組10株，分別用0.025 mmol/L、0.25 mmol/L、0.75 mmol/L和3 mmol/L MeJA的乙醇水溶液和0.1%乙醇（對照）噴灑煙苗，48 h后從第4片葉取0.03g剪碎，浸入5 mL 30%甲醇溶液中12 h，低速離心除去煙草碎片，取上清液0.2 mL于容量瓶中，加入Folin-Ciocalteu 0.5 mL，靜置3 min后加10% Na2CO3溶液0.5 mL，用去離子水定容至10 mL，25℃水浴2 h，測定765 nm處吸光度，重復(fù)2次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

葉片被取食面積、昆蟲體重增加量等數(shù)據(jù)經(jīng)正弦轉(zhuǎn)換后，采用Duncan’s新復(fù)極差測驗（α = 0.05或0.01）進行單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0（SPSS Inc., USA）進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA處理煙草對害蟲取食的影響

2.1.1 MeJA對煙草抵御棉鈴蟲取食的影響

試驗結(jié)果顯示，用150 μmol/L和50 μmol/L的MeJA處理煙苗24 h后，葉片被取食面積分別為9.37 cm2和10.74 cm2，方差分析無顯著差異（P≥0.05），而對照煙苗被取食面積是21.22 cm2，顯著高于處理（P＜0.05）。用 150 μmol/L 和 50 μmol/L 的MeJA處理植株48 h后，葉片被取食面積分別為9.57 cm2和12.60 cm2，二者無顯著差異（P≥ 0.05），而對照煙草被取食面積是26.25 cm2，顯著高于處理（P＜0.05）（圖1）。

圖1 不同濃度MeJA處理不同時間對棉鈴蟲取食量的影響Fig.1 Effects of various concentration MeJA and treating time on the feeding amount ofH.armigera

棉鈴蟲取食 150 μmol/L 和50 μmol/L MeJA 處理24 h后的煙葉后平均體重增加量分別為19.55 mg和20.65 mg，方差分析表明，取食高濃度和低濃度MeJA處理煙葉的棉鈴蟲體重增加量差異不顯著（P≥ 0.05）。取食對照煙葉的試蟲體重增加量為35.28 mg，顯著高于取食處理葉片棉鈴蟲的體重增加量（P＜0.05）（圖2）。棉鈴蟲取食150 μmol/L和50μmol/L MeJA處理48 h后的煙葉，平均體重增加量分別為17.85 mg和23.19 mg，差異不顯著（P≥0.05），而取食對照煙葉的試蟲平均體重增加量高達40.83 mg，明顯高于取食處理葉片棉鈴蟲的體重增加量（P＜0.05）（圖2）。

圖2 不同濃度MeJA處理不同時間對棉鈴蟲體重增加量的影響Fig.2 Effects of MeJA with various concentration and treating time on the weight gains ofH.armigera

2.1.2 MeJA對煙草抵御甜菜夜蛾取食的影響

用150 μmol/L和50 μmol/L MeJA處理24 h后的煙草葉片喂食甜菜夜蛾，葉片被取食量為17.27 cm2和20.31 cm2，二者差異不顯著（P≥0.05），而對照煙葉被取食量為21.98 cm2，顯著高于150 μmol/L MeJA處理的煙葉被取食面積（P＜0.05），但與50 μmol/L MeJA處理的煙草被取食量無顯著差異（P≥ 0.05）（ 圖3）。用 150 μmol/L 和 50 μmol/L MeJA處理48h后的煙草葉片喂食甜菜夜蛾，葉片被取食面積分別是16.91 cm2和20.41 cm2，而對照煙葉被取食面積為21.91 cm2，三者間無顯著差異（P≥0.05）（圖3）。

圖3 不同濃度MeJA處理不同時間對甜菜夜蛾取食量的影響Fig.3 Effects of MeJA with various concentration and treating time on the feeding amount ofS.exigua

MeJA處理煙草植株24 h，取50 μmol/L MeJA處理煙葉的甜菜夜蛾體重增加量為50.85 mg，顯著高于取食150 μmol/L MeJA處理煙葉甜菜夜蛾的體重增加量（36.15 mg）（P＜0.05），而取食對照煙葉的甜菜夜蛾體重增加量為81.08 mg，與取食50μmol/L MeJA處理煙草的試蟲體重增加量無顯著差異（P≥0.05），但顯著高于取食150 μmol/L MeJA處理煙草的試蟲體重增加量（P＜0.05）（圖4）。150 μmol/L和50 μmol/L MeJA處理煙草植株48 h，取葉片分別喂食甜菜夜蛾，試蟲體重增加量分別是33.63 mg和61.03 mg，而取食對照煙草的甜菜夜蛾體重增加量為75.60 mg，方差分析表明三者間差異不顯著（P≥0.05）（圖4）。

圖4 不同濃度MeJA處理不同時間對甜菜夜蛾的體重增加量的影響Fig.4 Effects of MeJA with various concentration and treating time on the weight gains ofS.exigua

2.2 茉莉酸甲酯對總多酚含量和腺毛密度的影響

2.2.1 茉莉酸甲酯對煙葉總多酚含量的影響

通過測定不同濃度沒食子酸的吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.101x-0.001（R2=0.9534）。根據(jù)各處理煙葉樣品的吸光值計算總多酚含量。結(jié)果顯示，煙葉總多酚含量與MeJA濃度成正相關(guān)，其中150 μmol/L MeJA處理的煙葉總多酚含量最高，達到33.17 mg/g，50 μmol/L MeJA處理的煙葉總多酚含量相對較低，為13.53 mg/g，對照煙葉總多酚含量最低，僅為11.80 mg/g。方差分析表明，150 μmol/L MeJA處理的煙葉總多酚含量顯著高于50μmol/L MeJA處理和對照煙葉的總多酚含量（P＜0.05）（圖5）。

2.2.2 茉莉酸甲酯對煙葉分泌SE腺毛數(shù)量的影響

如圖6所示，對照煙葉腺毛密度高達554.40根/cm2，0.025 mmol/L MeJA處理的煙葉腺毛密度降低到357.96根/cm2，顯著低于對照（P＜0.05），而且伴隨著MeJA濃度的升高，煙葉腺毛密度變得更低，其中0.25 mmol/L MeJA處理的煙葉腺毛密度為114.39根/cm2，0.75 mmol/L MeJA處理的煙葉腺毛密度為98.60根/cm2，最高濃度（3 mmol/L）MeJA處理的煙葉腺毛密度為42.29根/cm2，顯著低于其他處理和對照（P＜0.05），表明MeJA誘導(dǎo)煙葉分泌蔗糖酯的腺毛數(shù)量降低，而且誘導(dǎo)效果取決于MeJA的濃度。

圖5 不同濃度MeJA對煙草葉片總多酚含量的影響Fig.5 Effects of MeJA with various concentration on total polyphenol content in tobacco leaves

圖6 不同濃度MeJA對煙草腺毛密度的影響Fig.6 Effects of MeJA with various concentration on glandular hair density of tobacco leaves

3 結(jié)論與討論

曾有報道，經(jīng)MeJA噴灑的煙草、落葉松等植物對害蟲表現(xiàn)出了一定的驅(qū)避活性，但發(fā)揮驅(qū)避作用的不是MeJA，而是MeJA誘導(dǎo)煙草、落葉松等植物產(chǎn)生的對害蟲有驅(qū)避作用的揮發(fā)性物質(zhì)，而且驅(qū)避的對象主要是成蟲[21-22]。劉波和桂連友通過研究MeJA對朱砂葉螨選擇行為的影響，證實MeJA對朱砂葉螨并無直接驅(qū)避或吸引作用[23]。因此，本文以棉鈴蟲和甜菜夜蛾的幼蟲為研究對象，排除MeJA自身對試蟲的驅(qū)避作用，幼蟲取食量和體重增加量的減少應(yīng)是MeJA誘導(dǎo)煙苗產(chǎn)生抗性所致。

對于供試?yán)ハx甜菜夜蛾，用高濃度（150 μmol/L）、低濃度（50 μmol/L）的MeJA處理煙苗24 h后，低濃度處理組的試蟲取食量和體重增加量與對照組差異不顯著，但高濃度處理組的取食量和體重增加量均顯著低于對照組，特別是體重增加量，甚至顯著低于低濃度處理組。對于另一種供試?yán)ハx棉鈴蟲，用高、低2個濃度的MeJA處理煙苗48 h后，單頭試蟲取食量相差3.03 cm2，體重增加量相差5.34 mg；用低濃度MeJA處理煙苗24 h和48 h，棉鈴蟲的體重增加量相差2.54 mg，甜菜夜蛾體重增加量相差高達10.18 mg，取食處理48 h煙葉的試蟲體重增加量稍高。綜合上述結(jié)果，無論用高濃度還是低濃度的MeJA處理煙苗，均導(dǎo)致棉鈴蟲和甜菜夜蛾的取食量和體重增加量降低，只是MeJA的濃度越低，試蟲所受的影響越不明顯，說明MeJA對煙草抗蟲的誘導(dǎo)效果與其濃度有關(guān)；隨著時間的推移，特別是MeJA處理煙苗24 h至48 h期間，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗性逐漸減弱，說明MeJA誘導(dǎo)煙草抗蟲具有一定的持效期。

植物體內(nèi)的多酚與抗蟲性有關(guān)，總多酚含量越高，植物的抗蟲性越強[24]。本研究表明，當(dāng)外源MeJA施用到煙草之后，植株總多酚含量呈現(xiàn)出上升趨勢，特別是150 μmol/L MeJA處理的煙葉總多酚含量顯著高于對照?？梢酝茰y，MeJA通過影響煙草的生理生化代謝導(dǎo)致煙草植株總多酚含量升高是其誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗蟲性的機制之一。

煙草植株經(jīng)4個不同濃度的MeJA分別處理后，煙葉分泌SE的腺毛密度顯著低于對照，腺毛密度與MeJA的濃度呈負相關(guān)，該結(jié)果與姚忠達等[25]的研究一致。腺毛分泌SE的功能受施肥、降雨等諸多因素的影響。通常情況下，煙株維持著C/N代謝平衡，當(dāng)外源MeJA作用于煙株后，該平衡被打破，煙株更傾向于分泌生物堿[26]。姚忠達等[25]據(jù)此推測煙草葉片部分腺毛因分泌生物堿而停止分泌SE導(dǎo)致分泌SE的腺毛總數(shù)減少，密度降低。生物堿的殺蟲活性比SE更強，而且SE會增加煙草表面的粘性，對于害蟲的天敵也會產(chǎn)生不利的影響[27]。因此，在長期的進化過程中，煙草選擇了降酯增堿的生存策略，通過生成殺蟲能力更強的生物堿來對抗害蟲。

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Effective concentration and period of methyl jasmonate for inducing tobacco resistance to insect pests

ZHANG Linna1,2, CHEN Wenfeng3, FAN Rui1,2, ZHOU Lin1,2, YIN Xinming4, FENG Chao5, ZHAO Te1,2, GAO Fei1,2,
SUN Shujun1,2, YOU Xiufeng1,2, LIU Xiangyang1,2*
1 College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;
2 Key Laboratory for Creation and Application of Novel Pesticides of Henan Province, Zhengzhou 450002, China;
3 Department of Environment and Urban Planning, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, Henan, China;
4 Xinyang Agriculture and Forestry University, Xinyang 464000, Henan, China;
5 Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China

To gain insights into the mechanism of tobacco resistance to insect pests induced by methyl jasmonate (MeJA), tobacco plants were sprayed with 50μmol/L and 150μmol/L of MeJA.Tobacco leaves were picked at 24h and 48h after tobacco plants were treated with MeJA, andHelicoverpa armigeraandSpodoptera exiguawere respectively fed with tobacco leaves.The feeding amount and weight gains ofH.armigeraand S.exiguawere determined at an interval of 6h.Subsequently, the effects of various concentration of MeJA on total polyphenol content were determined by folin-ciocalteu colorimetry and glandular hair density of tobacco leaves was investigated by histochemical staining.Results showed that (1) The feeding amount and weight gains ofH.armigerasigni fi cantly decreased compared with controls within 48h after tobacco plants were sprayed with 50μmol/L MeJA or 150μmol/L MeJA.As for another test insect,S.exigua, only tobacco plants exhibited resistance within 24 h after treatments with 150μmol/L of MeJA.(2) The total polyphenol content of tobacco leaves increased when tobacco plants were sprayed with MeJA, and the increased amount of the total polyphenol content was positively correlated with the applied concentration of MeJA.(3) The glandular hair density of tobacco leaves decreased when tobacco plants were treated with MeJA, and the glandular hair density was negatively correlated with the applied concentration of MeJA.Results indicated that the inducement of MeJA on resistance of tobacco plants to insect pests depended on the concentration and exposure time of MeJA, and that the increase of total polyphenol content and changes of metabolism of tobacco plants might result in insect resistance of tobacco plants induced by MeJA.

tobacco; resistance; methyl jasmonate; period; effective concentration

張林娜, 陳文峰, 范銳，等.茉莉酸甲酯誘導(dǎo)煙草抗蟲的有效濃度和持效期[J].中國煙草學(xué)報，2017, 23（4）

河南省煙草公司科技項目專項(201205)；中國煙草總公司重點項目(110201202003)

張林娜(1988—)，碩士，主要從事生物農(nóng)藥研究，Tel：0371-63558170，Email：961248889@qq.com

劉向陽(1980—)，博士，副教授，主要從事生物農(nóng)藥研究，Tel：0371-63558170，Email：liuxiangyang@henau.edu.cn

2016-08-24；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-06-08

：ZHANG Linna, CHEN Wenfeng, FAN Rui, et al.Effective concentration and period of methyl jasmonate for inducing tobacco resistance to insect pests [J].Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(4)

*Corresponding author.Email：liuxiangyang@henau.edu.cn