混合酶酶解法對天龍粉水提液抗腫瘤作用影響的研究

朱明珠，王 穎，張由芹，王彥多，王集會

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心，山東 濟(jì)南 250355 )

混合酶酶解法對天龍粉水提液抗腫瘤作用影響的研究

朱明珠1，王 穎1，張由芹1，王彥多1，王集會2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心，山東濟(jì)南250355 )

目的： 比較天龍粉水提液經(jīng)混合酶酶解前后對喉癌hep2細(xì)胞株的抑制作用。方法： 使用MTT法，以細(xì)胞抑制率為指標(biāo)，研究天龍粉水提液經(jīng)胰蛋白酶和彈性蛋白酶作用前后對喉癌hep2細(xì)胞株的抑制作用。結(jié)果： 在所選藥物濃度范圍內(nèi)，天龍粉水提液對喉癌hep2細(xì)胞株無抑制作用，一定濃度的天龍粉酶解液對喉癌hep2細(xì)胞株有抑制作用。結(jié)論： 天龍粉水提液經(jīng)胰蛋白酶和彈性蛋白酶酶解后在一定藥物濃度下產(chǎn)生抑制喉癌hep2細(xì)胞株生長的作用。

天龍粉；MTT法；喉癌hep2細(xì)胞株；混合酶

中藥天龍又名守宮、壁虎，為壁虎科動物無蹼壁虎等的干燥全體，其用于腫瘤的治療已有數(shù)百年的歷史[1]。研究表明，天龍對多種惡性腫瘤的治療有確切的療效[2]，比如肝癌[3]、人食管鱗癌細(xì)胞EC9706[4]等。有相關(guān)研究報道，壁虎的醇提物可以誘導(dǎo)人喉癌hep2細(xì)胞的凋亡[5]，說明壁虎中可能存在抑制人喉癌hep2細(xì)胞株生長的有效成分。有研究發(fā)現(xiàn)，某些動物類中藥經(jīng)酶解后可以釋放出活性多肽和其它活性的小分子物質(zhì)[6]，可以更好地發(fā)揮藥理作用。

本實驗以天龍粉水提液為初始藥液，使用胰蛋白酶和彈性蛋白酶混合酶酶解天龍粉水提液制備天龍粉酶解液，使用MTT分析法，以細(xì)胞抑制率為指標(biāo)，從而比較天龍粉水提液經(jīng)混合酶酶解前后對喉癌hep2細(xì)胞株的作用。

1 實驗材料

1.1 藥材

天龍購自安徽亳州，天龍粉由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心化學(xué)實驗室自制。

1.2 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50FBS)；FA-1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；KQ-500E 型超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限公司)；倒置顯微鏡(XDS-1B)；PHS-25型pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)等。

1.3 試劑

胰蛋白酶;彈性蛋白酶；注射用順鉑(齊魯制有限公司);蒸餾水等。

1.4 實驗細(xì)胞

喉癌hep2細(xì)胞株由山東省立醫(yī)院提供。

2 實驗方法

2.1 天龍粉水提液的制備

精密稱取天龍粉兩份，每份1.0000g，以料液比1:30加入定量的蒸餾水，進(jìn)行超聲提取30min，抽濾、離心，取其中一份水提液，置100 mL錐形瓶中，使用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值=8，置37 ℃恒溫水溫箱中攪拌放置4 h，得天龍粉水提液。

2.2 天龍粉酶解液的制備

取2.1中另一份水提液，置100 mL錐形瓶中，使用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值=8，彈性蛋白酶0.0667 g，加入胰蛋白酶0.04 g，置37 ℃恒溫水溫箱中進(jìn)行攪拌酶解4 h，得天龍粉酶解液。

表1 2種蛋白酶的水解條件

2.3 MTT分析法

2.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇

從超低溫冰箱取出凍存的腫瘤細(xì)胞，將其立即投入到37 ℃滅菌水中，等待液體溶化后，將其以2000 r/min的速度離心3 min，收集細(xì)胞，放置在5 % CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中用含10 %胎牛血清的1640新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

2.3.2 接種

用0.25 %的胰酶細(xì)胞消化液(含0.02 %EDTA)對生長至80 %融合的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行消化，將對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞以100 μL孔進(jìn)行接種于96孔板中，而預(yù)留下3個調(diào)零孔不加腫瘤細(xì)胞，只加不含血清的1640培養(yǎng)基。

2.3.3 加藥

使用10 mL的1640培養(yǎng)液溶解精密稱取的10 mg凍干粉，配成藥物濃度為1 mg/mL的初始藥液，使用0.22 um的濾膜過濾、濾過液依次稀釋配成1、0.5、0.25 mg/mL的藥物濃度，等待細(xì)胞長滿單層后，棄去培養(yǎng)基，調(diào)零組、空白對照組加入100 μL不含血清的1640培養(yǎng)基，陽性對照組加入100 ul的100 μg/mL的順鉑，其他組每孔分別加入100 μL含不同藥物濃度的1640 培養(yǎng)基,每個濃度藥物分別加5個孔，使其在37 ℃、5 %CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.3.4 測定細(xì)胞抑制率

每孔加20 uL的5 mg/mL MTT溶液,將其避光放置4 h,除去上清液，加入100 uL的DMSO，用酶標(biāo)儀在492 nm下進(jìn)行測定OD值,從而計算細(xì)胞抑制率，計算公式如下。

3 結(jié)果

實驗測得藥物對喉癌hep2細(xì)胞株的抑制率如表2所示。

表2 天龍粉水提液經(jīng)混合酶酶解前后對喉癌hep2細(xì)胞株的抑制率

4 討論

由表2可知，在所選的藥物濃度下，天龍粉水提液對喉癌hep2細(xì)胞株無抑制作用，天龍粉混合酶酶解液在較低的藥物濃度下對喉癌hep2細(xì)胞株無抑制作用，在較高的藥物濃度下，對喉癌hep2細(xì)胞株有一定的抑制作用。原因可能是因為天龍粉水提液經(jīng)混合酶酶解后，相應(yīng)的氨基酸之間的肽鍵發(fā)生斷裂，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生水解，進(jìn)而可以釋放出活性多肽以及其它活性小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)可能是抑制喉癌hep2細(xì)胞株生長的有效成分，在較低的藥物濃度下，活性多肽及活性小分子物質(zhì)的含量比較低，因此，發(fā)揮藥理作用比較弱，表現(xiàn)不出抑制喉癌hep2細(xì)胞株生長的作用，而當(dāng)藥物濃度升高后，相應(yīng)的活性多肽和小分子物質(zhì)的含量會隨之增加，當(dāng)藥物濃度達(dá)到一定程度時，進(jìn)而表現(xiàn)出抑制喉癌hep2細(xì)胞株生長的作用。

由于酶具有專一性，只能水解特定氨基酸之間形成的肽鍵，而混合酶相對于單一酶來講，其可以使肽鍵較多地被水解，因此，可以使蛋白質(zhì)水解成更小分子的活性肽類及其它活性小分子物質(zhì)，研究表明，動物類藥材發(fā)揮作用的主要有效成分為活性小分子肽類[6-7]，因此，混合酶酶解法作為一種生物技術(shù)運用在動物藥活性成分的提取中有較大意義，對于新藥的研發(fā)也有一定的意義，本實驗研究對后期天龍粉抗腫瘤的研究具有一定參考價值。

(本研究在山東中醫(yī)藥大學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心平臺完成，特此感謝)

[1] 崔朝初. 壁虎醇提物(Ⅱ)的抗腫瘤作用研究[D]. 洛陽:河南科技大學(xué),2013.

[2] 韓進(jìn)庭. 壁虎的抗腫瘤藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2011(13):2019-2020.

[3] 謝 斌. 無蹼壁虎抗腫瘤活性成分對人肝癌HepG2細(xì)胞作用的實驗研究[D].濰坊：濰坊醫(yī)學(xué)院,2012.

[4] 王曉蘭,王淑英,王建剛. 壁虎醇提物對人食管鱗癌細(xì)胞EC9706的作用和體內(nèi)抗腫瘤活性[J]. 中國中藥雜志,2010(16):2175-2179.

[5] 崔朝初,王建剛,段冷昕,等. 壁虎醇提物誘導(dǎo)人喉癌細(xì)胞Hep2凋亡的實驗研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013(04):551-554.

[6] 王愛華,柳美玲,戴志明,等.小肽的吸收機(jī)制與營養(yǎng)價值研究進(jìn)展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2008(2):7.

[7] 王克夷.開發(fā)小肽，篩選新藥[J].中國生化藥物雜志，2003，24(1)：48.

(本文文獻(xiàn)格式：朱明珠，王穎，張由芹，等.混合酶酶解法對天龍粉水提液抗腫瘤作用影響的研究[J].山東化工，2017，46(16)：11-12.)

Study on Anti-tumor Effect of Mixed Enzyme Enzymolysis for Water Extraction Liquid from Gecko Powder

Zhu Mingzhu1,Wang Ying1,Zhang Youqin1,Wang Yanduo1,Wang Jihui2*

(1. The Pharmacy College , Shandong Univerity of Traditional Chinese Medicine,jinan 250355,China;2.The Experiment Center ,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,jinan 250355,China)

Objective :To compare water extract from Gecko powder by mixed enzyme enzymolysis before and after have inhibition effect on laryngeal cancer cell hep2 line.Methods :Using MTT method,the inhibition rate on cells as indicator,comparing the inhibitory effect on laryngeal cancer cell hep2 line for water extract from Gecko powder by trypsin and elastase function before and after.Results:Within the scope of the selected drug concentration, water extract from Gecko powder laryngeal haven't inhibition on laryngeal cancer cell hep2 line, enzymolysis water extract from Gecko powder in certain concentration have inhibition on laryngeal cancer cell hep2 line.Conclusion: Water extract from Gecko powder in certain concentration produce inhibition on laryngeal cancer cell hep2 line by trypsin and elastase function.

gecko powder；MTT method; laryngeal cancer cell hep2 line；mixed enzyme

R285.5

：A

：1008-021X(2017)16-0011-02

2017-06-02

山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練(SRT)計劃資助項目(項目編號2016031)

朱明珠(1996—)，女，山東曲阜人，本科在讀，研究方向：制藥工程；通信作者：王集會(1962—)，副教授，研究方向：蟲類中藥發(fā)酵及活性成分研究。