丙氨酸對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響

孫玉杰，楊淑慎，張 琪，武 培，魏 娟

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西 楊凌 712100;2.天方藥業(yè)有限公司,河南 駐馬店 463000)

丙氨酸對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響

孫玉杰1,2，楊淑慎1*，張 琪2，武 培2，魏 娟2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué),陜西楊凌712100;2.天方藥業(yè)有限公司,河南駐馬店463000)

在林可鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)林可霉素的過程中添加丙氨酸有利于林可霉素的生物合成。在搖瓶發(fā)酵過程中，于發(fā)酵開始24h向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.02%的丙氨酸，林可霉素的效價(jià)提高了15%；放大至15L發(fā)酵罐，成功驗(yàn)證了丙氨酸對(duì)林可霉素生物合成的促進(jìn)作用，發(fā)酵罐放罐效價(jià)達(dá)5300U/mL,比對(duì)照罐效價(jià)提高了20%。通過檢測(cè)發(fā)酵液中的丙酮酸發(fā)現(xiàn)，丙酮酸可能抑制了磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸轉(zhuǎn)化，使菌體內(nèi)積累高濃度磷酸烯醇式丙酮酸，進(jìn)而提高林可霉素的產(chǎn)量。

林可鏈霉菌；丙酮酸激酶；丙氨酸

林可霉素(Lincomycin)具有較好的抗革蘭陽性菌的能力，它與已知的抗生素間不存在交叉耐藥性，并且毒性很低、抗菌活性更強(qiáng)，因此林可霉素和它的衍生物鹽酸林可霉素已經(jīng)廣泛用于醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)[1]。林可霉素是在美國林肯市的土壤中發(fā)現(xiàn)的由林可鏈霉菌林可變種所產(chǎn)生的一類能抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成，對(duì)大多數(shù)革蘭陽性菌和某些厭氧的革蘭陰性菌有抗菌作用的抗生素。在林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)過程中除主要產(chǎn)生林可霉素A組分外，還伴有少量的林可霉素B組分。林可霉素及其下游半合成產(chǎn)品稱為林肯酰胺類抗生素。林肯酰胺類抗生素已成為臨床應(yīng)用上主要的抗生素之一[2]。

目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)林可霉素的生物合成進(jìn)行了多方面優(yōu)化研究，當(dāng)然也取得了一定成果。例如：周曉芳等[3]用棉籽蛋白粉和花生粉替代林可鏈霉菌培養(yǎng)基中的黃豆餅粉，用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了林可鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)林可鏈霉菌，林可霉素的產(chǎn)量提高了12%～17%。李嘯等[4]人在林可鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氨基酸和生物素，使林可霉素的產(chǎn)量提高了42%。湯海云等[5]人在林可鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了不同濃度、不同種類的金屬離子，使林可霉素的產(chǎn)量提高了20%。

本文通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)考察不同濃度的丙氨酸、丙氨酸不同添加時(shí)間對(duì)林可霉素產(chǎn)量的影響，并擴(kuò)大到15L發(fā)酵罐進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵液中丙酮酸的濃度，以明確丙氨酸對(duì)林可霉素生物合成的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用菌種

Js0215-03F1

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(%)

玉米淀粉2，黃豆餅粉(生)2，葡萄糖1，玉米漿4，(NH4)2SO40.2，CaCO30.4，pH值:6.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%)

黃豆餅粉(生)2.5，葡萄糖12，玉米漿0.4，(NH4)2SO40.8，NaCl 0.8， K2HPO40.025，NaNO30.6，CaCO30.8，pH值:7.2。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 搖瓶培養(yǎng)

搖瓶種子培養(yǎng)：挖斜面培養(yǎng)基1cm2左右的菌塊，接種到裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL的三角瓶中，29℃條件下，230 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量移種到裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，29℃條件下，230r/min搖床振蕩培養(yǎng)7d。

1.2.1.2 15L發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵罐所需要的一級(jí)種子培養(yǎng)方法和搖瓶種子培養(yǎng)方法相同，二級(jí)種子培養(yǎng)24h。

將二級(jí)種子液以10%的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐中。控制好發(fā)酵溫度29℃，轉(zhuǎn)速120r/min，風(fēng)量：0.5vvm。發(fā)酵24h起每隔4h補(bǔ)一次料，以滿足發(fā)酵過程中菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求。

1.2.2 丙氨酸對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中林可霉素產(chǎn)量的影響

1.2.2.1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中丙氨酸最適添加濃度的確定

在搖瓶發(fā)酵開始0h時(shí)分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的丙氨酸作為實(shí)驗(yàn)組，以不添加丙氨酸的作為對(duì)照組，進(jìn)行放瓶搖瓶中林可霉素含量的測(cè)定，對(duì)比放瓶效價(jià)，來確定搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中丙氨酸的最適添加濃度。

1.2.2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中丙氨酸最適添加時(shí)間的確定

在發(fā)酵搖瓶中分別于24,48,72,96,120h和144h添加0.02%的丙氨酸作為實(shí)驗(yàn)組，以不添加丙氨酸的作為對(duì)照組，進(jìn)行放瓶效價(jià)的比較，以確定發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中丙氨酸的最適添加時(shí)間。

1.2.2.3 15L發(fā)酵罐進(jìn)行不添加丙氨酸(對(duì)照組)和在發(fā)酵24h添加濃度為0.02%的丙氨酸(實(shí)驗(yàn)組)的發(fā)酵培養(yǎng)，一定發(fā)酵時(shí)間取樣，通過比較放罐效價(jià)以及發(fā)酵過程中丙酮酸的含量變化，進(jìn)一步確定丙氨酸對(duì)林可霉素合成的影響。

1.2.3 測(cè)定方法

1.2.3.1 生物效價(jià)

生物效價(jià)的測(cè)定方法：見中國藥典[6]。

1.2.3.2 丙酮酸的測(cè)定

采用高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中丙氨酸濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度丙氨酸對(duì)林可霉素產(chǎn)量的影響

中日醫(yī)院呼吸中心煙草病學(xué)與戒煙中心主任肖丹教授說，雖然理論上電子煙的危害應(yīng)比普通卷煙略小，但依然含有尼古丁、丙二醇、丙三醇、重金屬等有害物質(zhì)，會(huì)增加患慢性阻塞性肺疾病、肺癌、心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，只要接觸人體就會(huì)帶來安全隱患。

在發(fā)酵開始時(shí)向發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中加入不同濃度的丙氨酸，考察林可霉素產(chǎn)量的變化，具體結(jié)果見圖1。

圖1 添加不同濃度丙氨酸對(duì)林可霉素合成的影響

從圖1可知，在搖瓶發(fā)酵0h時(shí)，當(dāng)丙氨酸的添加濃度為0.02%時(shí)，林可霉素?fù)u瓶發(fā)酵效價(jià)達(dá)到了4210U/mL，比對(duì)照組效價(jià)提高了20%，可能原因是只有在丙氨酸的添加濃度合適的情況下，才會(huì)對(duì)林可霉素的效價(jià)產(chǎn)生正影響。

2.2 丙氨酸不同添加時(shí)間對(duì)林可霉素效價(jià)的影響

在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別在發(fā)酵的不同時(shí)間點(diǎn)添加0.02%的丙氨酸，以不添加丙氨酸的作為對(duì)照，發(fā)酵結(jié)束后，搖瓶效價(jià)測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

圖2 在不同時(shí)間添加丙氨酸對(duì)林可霉素效價(jià)的影響

從圖2可以看出，當(dāng)24h添加一定濃度的丙氨酸時(shí)，其效價(jià)達(dá)到3950U/mL,比對(duì)照組的3400U/mL提高了15%。可能原因是在發(fā)酵24h時(shí)，丙氨酸抑制磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化，從而提高林可霉素的效價(jià)。

2.3 15L發(fā)酵罐中添加丙氨酸對(duì)林可霉素效價(jià)的影響

前期搖瓶實(shí)驗(yàn)證明，在搖瓶發(fā)酵過程中，于發(fā)酵24h向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.02%的丙氨酸，林可霉素的效價(jià)提高了15%。以此濃度和添加時(shí)間為基點(diǎn)放大至15L發(fā)酵罐，分析放罐效價(jià)，進(jìn)一步確定丙氨酸對(duì)林可霉素合成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 15L發(fā)酵罐中添加丙氨酸對(duì)林可霉素效價(jià)的影響

圖3表明，當(dāng)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了丙氨酸之后，林可霉素的效價(jià)有了明顯提高，放罐效價(jià)達(dá)到5300U/mL,比沒有添加丙氨酸的對(duì)照罐提高了20%。

2.4 15L發(fā)酵罐中添加丙氨酸對(duì)丙酮酸含量的影響

15L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)林可霉素時(shí)，按一定時(shí)間點(diǎn)取樣，采用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中丙酮酸的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 丙酮酸在發(fā)酵過程中含量的變化

圖4可以看出，在發(fā)酵中后期，處理組和對(duì)照組的丙酮酸含量有明顯的差異，可能是因?yàn)?，添加了丙氨酸的處理組抑制了磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化，才會(huì)使得發(fā)酵過程中丙酮酸的積累量相對(duì)于對(duì)照組降低。

3 結(jié)論

在搖瓶發(fā)酵過程中，于發(fā)酵開始時(shí)24h向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.02%的丙氨酸，林可霉素的搖瓶效價(jià)提高15%，放大至15L發(fā)酵罐，驗(yàn)證了發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加丙氨酸可大幅度提高林可霉素的效價(jià)，使得放罐效價(jià)達(dá)到5300U/mL,比對(duì)照罐效價(jià)提高了20%。同時(shí)采用高效液相色譜法檢測(cè)發(fā)酵液中丙酮酸的含量，發(fā)現(xiàn)丙氨酸作為林可霉素代謝途徑中關(guān)鍵酶的抑制劑，能夠?qū)α挚擅顾氐暮铣僧a(chǎn)生重要影響。

[1] 丁 琳.復(fù)合誘變選育林肯霉素高產(chǎn)菌株[J].基酸和生物資源，2006，28(4)68-70.

[2] Wright J L C.The lincomycin-celesticetin-anthramycin group[M]// Vining L C .Biochemistry and Genetic Regulation of Commercially Important Antibiotics, London: Addison-Wesley Publishing Company ,1983.

[3] 周曉芳，葉蕊芳，儲(chǔ)成亮,等林可霉素生物合成培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].工業(yè)微生物，2011，41(2)：21-25.

[4] 李 嘯，儲(chǔ) 矩，張嗣良,等.生物素和氨基酸對(duì)林可霉素生物合成的影響[J]中國抗生素雜志，2008，33(1)：6-10.

[5] 湯海云，李 嘯，儲(chǔ) 矩,等.金屬離子對(duì)林可霉素合成的影響[J].中國抗生素雜志，2007，32(12)：723-726.

[6] 國家藥典委員會(huì).ChP 中國藥典(二部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2010.

(本文文獻(xiàn)格式：孫玉杰，楊淑慎，張琪，等.丙氨酸對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響[J].山東化工，2017，46(16)：9-10,12.)

The Effect of Alanine on the Fermentation of Lincomycin

Sun Yujie1,2，Yang Shushen1*，Zhang Qi2，Wu Pei2，Wei Juan2

(1 .Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2 .Topfond Pharmaceutcal Co.,Ltd., Zhumadian 463000, China)

This topic is mainly used in the process of lincomycin, which can be used to make the biosynthesis of lincomycin. During the fermentation process, the effect price of lincomycin was increased by 15% by adding 0.02% of alanine to the fermentation medium during the fermentation period. It was amplified to 15L starter, successfully validating the effect of alanine on the biosynthesis of lincomycin, and the efficiency of the pot was up to 5300U/mL, which was 20% higher than that of the control pot.Pyruvic acid in the fermented liquid through testing found that pyruvate may inhibit the pyruvate kinase in the glycolytic pathway of enzyme activity, thus inhibiting the enol phosphate type pyruvate to pyruvic acid, make the bacteria in the body accumulation of high concentrations of enol phosphate type pyruvic acid, and improve the output of lincomycin.

streptomyces lincolnensis; pyruvate kinase;alanine

TQ465

：A

：1008-021X(2017)16-0009-02

2017-06-16

陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2015SF308，野生名貴植物紅豆杉產(chǎn)天然抗癌藥物紫杉醇的研究)

孫玉杰(1986—)，女，河南駐馬店人，主要從事林可霉素、紅霉素等菌種選育的研究；通訊作者：楊淑慎(1956—)，女，西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)院學(xué)院教授，博士，博士生導(dǎo)師，九三學(xué)社社員，主要從事植物抗逆生理、植物細(xì)胞培養(yǎng)工程方面的研究工作。