重組Microdochium nivale還原糖氧化酶用于制備乳糖酸方法的研究

顧利敏， 周 星， 金征宇*， 徐學明， 周家慧

（1.食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

重組Microdochium nivale還原糖氧化酶用于制備乳糖酸方法的研究

顧利敏1，2， 周 星1，2， 金征宇*1，2， 徐學明1，2， 周家慧1，2

（1.食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

Microdochium nivale（M.nivale）還原糖氧化酶可以催化乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸，作者采用實驗室保存的重組M.nivale還原糖氧化酶基因工程菌X33-pPICZαA-MnCO，通過誘導(dǎo)在畢赤酵母中表達并制備了重組M.nivale還原糖氧化酶，通過單因素和正交實驗考查了乳糖濃度，重組M. nivale還原糖氧化酶用量，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時間對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明：重組M. nivale還原糖氧化酶催化乳糖制備乳糖酸的最適轉(zhuǎn)化條件為：乳糖濃度5 mmol/L，酶的添加量為1.5 U/ml，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時間為48 h，最終反應(yīng)乳糖酸的轉(zhuǎn)化率接近100%。

乳糖酸；乳糖；重組Microdochium nivale還原糖氧化酶；轉(zhuǎn)化率

乳糖酸（Lactobionic acid，LA）是一種新型多羥基有機酸[1]，是集修護、抗衰老、保濕、抗氧化、促進機體更新[2]等多種功效于一身的最先進的果酸。在食品中乳糖酸可以做為食品添加劑，并且能夠與礦物質(zhì)鹽形成復(fù)合物，促進腸道中益生菌的生長以及對礦物質(zhì)的吸收[3]。在酸奶的制作過程中，乳糖酸的存在能夠改善酸奶凝乳的持水力、調(diào)和酸味、促進風味形成。在肉制品中添加一定量的乳糖酸，可以減少肉制品在冷凍后產(chǎn)生的水分損失[3]。乳糖酸在醫(yī)學中是是器官移植前保護性緩沖液的重要組分[5-6]，可螯合Fe3+，降低由于離子催化產(chǎn)生的氫氧自由基對組織的損傷，增加了器官的保存性[7]。在美容行業(yè)中，由于乳糖酸有極強的吸水性，并且能夠促進上皮形成，加速傷口愈合，有修護肌膚的功效，因此乳糖酸可用于防止皮膚干燥以及肌膚修護[8]。

目前制備乳糖酸的方法有生物制備法[9]、化學氧化法[10]、電化學法和催化氧化法等多種方法，但是這些方法存在著副產(chǎn)物多，產(chǎn)物的分離純化比較復(fù)雜以及化學污染等問題。生物酶法常以高效、綠色著稱，目前酶法制備乳糖酸所使用的酶包括乳糖脫氫酶，葡萄糖果糖氧化酶和還原糖氧化酶，但是乳糖脫氫酶是一種膜蛋白，分離純化過程復(fù)雜，且酶極易失活。葡萄糖果糖氧化酶可將乳糖和果糖轉(zhuǎn)化為山梨醇和乳糖酸，但是山梨醇和乳糖酸混在一起使得乳糖酸的分離純化極為復(fù)雜。Elizabeth J團隊在Microdochium nivale（M.nivale）中發(fā)現(xiàn)一種還原糖氧化酶[11]，該酶可以將末端帶有還原性糖殘基的單糖和低聚糖氧化成相應(yīng)的酸，沒有其他副產(chǎn)物產(chǎn)生，具有更加有效催化乳糖氧化形成乳糖酸的潛力[12-13]。作者采用實驗室保存的在C-末端加入組氨酸標簽的重組M.nivale還原糖氧化酶基因工程菌，通過誘導(dǎo)在畢赤酵母中表達制備了重組M.nivale還原糖氧化酶，并研究了其作用于乳糖的最適溫度和pH及優(yōu)化了制備乳糖酸的反應(yīng)條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種畢赤酵母X33-pPICZαA-MnCO：作者所在實驗室保存；過氧化氫試劑盒、蛋白Marker：生工生物技術(shù)（上海）有限公司產(chǎn)品；乳糖、乳糖酸標品：Sigma公司產(chǎn)品；酵母粉、胰蛋白胨：英國Oxoid公司產(chǎn)品；其它分析純試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司；YPD、BMGY種子培養(yǎng)基、BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基：按Invitrogen公司畢赤酵母操作表達手冊配制。

1.2 實驗儀器

高速冷凍離心機 （BIOFUGE PRIMOR）：美國Thermo Scientific有限公司產(chǎn)品；低速臺式大容量離心機（RJTDL-50A）：無錫瑞江分析儀器有限公司產(chǎn)品；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1900）：北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀（LC-20AT230V）、示差折光檢測器 （RID-10A）、AKTA purifier 900蛋白純化系統(tǒng)：島津公司產(chǎn)品；NH2P-50色譜柱：美國Thermo公司產(chǎn)品；Ni-NTA親和層析柱：GE Healthcare life sciences公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組畢赤酵母pPICZαA-MnCO的誘導(dǎo)表達將保存的菌種X33-pPICZαA-MnCO接種到Y(jié)PD中，30℃，220 r/min培養(yǎng)至A600nm為2～3，按照體積分數(shù)3%的接種量接種到BMGY中，30℃，220 r/ min培養(yǎng)至A600nm為4～5，用無菌管離心收集菌體，菌體用BMMY懸浮，加入到含有BMMY的錐形搖瓶中，28℃，220 r/min每隔12 h添加甲醇至終體積分數(shù)0.5%，誘導(dǎo)表達72 h，離心收集上清液。將上清液放入pH 6.0的20 mmol/L的PBS中透析48 h，去除培養(yǎng)基中的大分子得到粗酶液。

1.3.2 重組 M.nivale還原糖氧化酶的分離純化重組M.nivale還原糖氧化酶在C-末端加入組氨酸標簽，鎳柱中鎳離子與組氨酸產(chǎn)生配位相互作用，選用鎳柱親合層析對其進行純化。具體步驟為：用過膜（0.22 μm）并脫氣后的超純水沖洗 AKTA蛋白純化系統(tǒng)，基線平穩(wěn)后換淋洗液（50 mmol/L，pH 7.0的Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）平衡Ni-NTA柱，流量為 1 mL/min，平衡完畢后將粗酶液通過0.22 μm的膜后進樣，進樣量為1 mL。待雜蛋白去除后換洗脫液（50 mmol/L，pH 7.0的Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑）洗脫目標蛋白，收集洗脫液[14]，將洗脫下來含M.nivale還原糖氧化酶的組分用20 mmol/L的PBS（pH 6.0）透析脫鹽。采用SDS-PAGE對重組M.nivale還原糖氧化酶進行鑒定。

1.3.3 M.nivale還原糖氧化酶理化性質(zhì)分析

1）SDS-PAGE電泳 濃縮膠質(zhì)量濃度選為5 g/ dL，分離膠質(zhì)量濃度選為12 g/dL，純化酶液與5×樣品緩沖液混合，沸水浴5 min，將10 μL處理好的樣品加入到凝膠孔中，調(diào)節(jié)電壓保持100 V。電泳結(jié)束，取出凝膠染色，選用質(zhì)量分數(shù)為0.1%考馬斯亮藍R-250染色5 min后，換成考馬斯亮藍脫色液，震蕩脫色[15]。

2）重組M.nivale還原糖氧化酶酶活的測定取200 μL的乳糖（0.1 mol/L）保溫10 min，加入20 μL的酶液，在一定溫度下避光反應(yīng)20 min，采用過氧化氫試劑盒測定過氧化氫濃度。

酶活定義：在pH 6.0，50℃下1 min內(nèi)催化乳糖反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol/L的過氧化氫所需的酶量為1 U。

3）蛋白質(zhì)濃度的測定 標準品選用牛血清蛋白，采用Bradford法[16]對蛋白質(zhì)濃度進行測定。

1.3.4 乳糖酸含量的測定 用高效液相色譜法對乳糖酸的含量進行定量測定，采用示差檢測器檢測，色譜柱為NH2P-50。流動相為乙腈和40 mmol/L Na2HPO4－20 mmol/L檸檬酸緩沖液，在pH 5.0的條件下，以0.8 mL/min的流量在40℃下泵入[17]。

1.3.5 重組M.nivale還原糖氧化酶作用于乳糖的最適溫度和最適pH 在30～80℃范圍內(nèi)，以5℃為溫度間隔，測定重組M.nivale還原糖氧化酶作用于乳糖的最適溫度，測定的酶活最大值為100%，各溫度條件下的酶活為相對酶活。

以不同pH的緩沖溶液為底物溶液，將pH分成3段 （3-6、6-8、8-9），依次選用20 mmol/L的檸檬酸/檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉、氨酸/氫氧化鈉緩沖液，在相同溫度下測定重組M.nivale還原糖氧化酶作用于乳糖的活性，測定的酶活最大值為100%，各pH條件下的酶活為相對酶活。

1.3.6 單因素試驗設(shè)計

1）乳糖濃度對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響 分別以1，5，10，25 mmol/L的乳糖為底物，每100 mL的反應(yīng)液中添加3.0 U/mL的過氧化氫酶，通氣量為0.6L/min，每隔12 h加入1.5 U/mL的重組M.nivale還原糖氧化酶，通過加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH在5～6，55℃反應(yīng)48 h后對乳糖酸的轉(zhuǎn)化率進行分析。

2）加酶量對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響 以5 mmol/ L的乳糖為底物，每100 mL的反應(yīng)液中添加3.0 U/ mL的過氧化氫酶，通氣量為0.6 L/min，每隔12 h分別加入0.5，1.0，1.5，2.0 U/mL的重組M.nivale還原糖氧化酶，通過加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH在5～6，55℃反應(yīng)48 h后對乳糖酸的轉(zhuǎn)化率進行分析。

3）反應(yīng)溫度對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響 以5 mmol/L的乳糖為底物，每100 mL的反應(yīng)液中添加3 U/mL的過氧化氫酶，通氣量為0.6 L/min，每隔12 h加入1.5 U/mL的重組M.nivale還原糖氧化酶，通過加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH在5～6，分別在40，45，50，55，60℃反應(yīng)48 h后對乳糖酸的轉(zhuǎn)化率進行分析。

4）反應(yīng)時間對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響 以5 mmol/L的乳糖為底物，每100 mL的反應(yīng)液中添加3.0 U/mL的過氧化氫酶，通氣量為0.6 L/min，每隔12 h加入1.5 U/mL的重組M.nivale還原糖氧化酶在55℃下反應(yīng)，通過加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH在5～6，分別在反應(yīng)12，24，36，48，60 h后取樣，對乳糖酸的轉(zhuǎn)化率進行分析。

1.3.7 正交試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交表對乳糖濃度、加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間進行優(yōu)化，以乳糖酸轉(zhuǎn)化率為評定指標，試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計表Table 1 Design table of factor and level in orthogonal test

2 結(jié)果與討論

2.1 重組M.nivale還原糖氧化酶的SDS-PAGE分析

以甲醇誘導(dǎo)表達的重組畢赤酵母X33/ pPICZαA-MnCO，誘導(dǎo)表達72 h，離心取上清，透析得到粗酶液，粗酶液經(jīng)Ni-NTA純化后得到重組M. nivale還原糖氧化酶，由圖1可以看出粗酶液在60KDa出有明顯條帶，經(jīng)Ni-NTA純化后得到純度大于95%的重組M.nivale還原糖氧化酶。

2.2 重組M.nivale還原糖氧化酶的酶活和蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)

經(jīng)實驗測定重組M.nivale還原糖氧化酶活力為500.435 U/mL，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為0.501 mg/mL。

圖1 重組M.nivale還原糖氧化酶SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE anlysis of the recombinant MnCO

2.3 重組M.nivale還原糖氧化酶作用于乳糖的最適溫度和最適pH

按照2.3.2中的方法測定重組M.nivale還原糖氧化酶作用于乳糖的最適溫度和最適pH。圖2顯示，該酶作用于乳糖的的最適溫度為55℃，最適pH為6.0，且pH值在4.0～6.0時，酶活大于85%，該特性有助于重組M.nivale還原糖氧化酶催化乳糖氧化轉(zhuǎn)化為乳糖酸。

圖2 重組M.nivale還原糖氧化酶作用于乳糖的最適溫度與pHFig.2 Optimal reaction pH of the recombinant MnCO on lactose

2.4 單因素試驗

2.4.1 乳糖濃度對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響 由圖3可以看出，乳糖濃度為10 mmol/L和25 mmol/L時，轉(zhuǎn)化率均低于60%。當乳糖濃度為1 mmol/L和5 mmol/L時，轉(zhuǎn)化率接近100%，造成這一現(xiàn)象的原因可能為：隨著乳糖濃度的增大。乳糖與酶分子之間無法充分相互接觸，從而使得乳糖酸的轉(zhuǎn)化率降低。

圖3 乳糖濃度對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of concentration of lactose on the LA conversion rate

2.4.2 加酶量對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響 由圖4可以看出加酶量為0.5 U/mL時，乳糖的轉(zhuǎn)化率大于90%，提高加酶量至1.0 U/mL時乳糖的轉(zhuǎn)化率接近100%。造成這一現(xiàn)象的原因可能為：酶的濃度較低時，酶分子不能夠完全與乳糖相互接觸，從而使得乳糖酸的轉(zhuǎn)化率較低，增加酶濃度之后，酶分子與乳糖完全接觸，能夠完全催化乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸。

圖4 加酶量對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of the amount of MnCO on the LA conversion rate

2.4.3 溫度對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響 由圖5可以看出在40℃到55℃，隨著溫度的上升乳糖的轉(zhuǎn)化率也呈現(xiàn)上升趨勢，在55℃時達到最高，接近100%，當反應(yīng)溫度為60℃時乳糖的轉(zhuǎn)化率下降，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是當溫度較低時，重組M. nivale還原糖氧化酶的活性中心沒有完全打開，當溫度升高后，活性中心完全打開，能夠完全氧化乳糖成乳糖酸，當反應(yīng)溫度高于重組M.nivale還原糖氧化酶做用于乳糖的最適溫度后，部分酶分子在反應(yīng)過程中已經(jīng)失去活性，使得乳糖酸的轉(zhuǎn)化率降低[18]。

2.4.4 反應(yīng)時間對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響 由圖6可以看出，在12～48 h內(nèi)隨著反應(yīng)時間的延長，乳糖酸的轉(zhuǎn)化率逐漸上升，在反應(yīng)至36 h乳糖酸的轉(zhuǎn)化率達到96%，在反應(yīng)48 h后達到最高，為99.98%，接近100%。

圖5 溫度對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of temperature on the LA conversion rate

2.5 正交試驗結(jié)果

通過正交試驗可知，影響乳糖酸轉(zhuǎn)化率的因素大小依次為A（乳糖濃度）＞B（反應(yīng)時間）＞D（反應(yīng)溫度）＞C（加酶量），最佳工藝為A2B2C2D2，即乳糖濃度為5 mmol/L，反應(yīng)時間為48 h，反應(yīng)溫度為55℃，加酶量為1.5 U/mL。按照此方案進行驗證試驗，乳糖酸的轉(zhuǎn)化率為99.98%。

圖6 時間對乳糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of temperature on the LA conversion rate

3 結(jié)語

通過研究重組M.nivale還原糖氧化酶作用于乳糖的最適溫度和最適pH及重組M.nivale還原糖氧化酶作用于乳糖制備乳糖酸的條件，測定重組M.nivale還原糖氧化酶活力為500.435 U/mL，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.501 mg/mL，其作用于乳糖的最適溫度為55℃，最適pH為6.0，當乳糖濃度為5 mmol/L，在55℃下加入1.5 U/mL的重組M.nivale還原糖氧化酶反應(yīng)48 h后可將乳糖轉(zhuǎn)化為乳糖酸，轉(zhuǎn)化率接近100%。

[1]AHMAD S K，BRINCH D S，F(xiàn)RIIS E P，et al.Toxicological studies on lactose oxidase from Microdochium nivale expressed in Fusarium venenatum[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology，2004，39（3）：256-270.

[2]TASIC K M，SAVIC S，LUKIC M，et al.Lactobionic acid in a natural alkylpolyglucoside-based vehicle：assessing safety and efficacy aspects in comparison to glycolic acid[J].Journal of cosmetic dermatology，2010，9（1）：3-10.

[3]TOSHIAKI S，SHUICHI Y，TOMOKO K，et al.Bifidus factors containing lactobionic acid[J].Japanese Patent，1995，7277990.

[4]VERSTREPEN K J，VAN Laere S D M，VANDERHAEGEN B M P，et al.Expression levels of the yeast alcohol acetyltransferase genes ATF1，Lg-ATF1，and ATF2 control the formation of a broad range of volatile esters[J].Applied and Environmental Microbiology，2003，69（9）：5228-5237.

[5]LUDWIG R，OZGA M，et al.Continuous enzymatic regeneration of electron acceptors used by flavoenzymes：cellobiose dehydrogenase-catalyzed production of lactobionic acid as an example[J].Biocatalysis and Biotransformation，2004，22（2）：97-104.

[6]HUA L，NORDKVIST M，NIELSEN P M，et al.Scale-up of enzymatic production of lactobionic acid using the rotary jet head system[J].Biotechnology and Bioengineering，2007，97（4）：842-849.

[7]ISAACSON Y，SALEM O，SHEPHERD R E，et al.Lactobionic acid as an iron chelator：a rationale for its effectiveness as an organ preservant[J].Life Sciences，1989，45（24）：2373-2380.

[8]BERARDESCA E，DISTANTE F，VIGNOLI G P，et al.Alpha hydroxyacids modulate stratum corneum barrier function[J]. British Journal of Dermatology，1997，137（6）：934-938.

[9]GREEN J W.The halogen oxidation of simple carbohydrates.Advanced in Carbohydrat Chemistry[M].New York：AcadPress，1948.

[10]NORDKVIST M，NIELSEN P M，VILLADSEN J.Oxidation of lactose to lactobionic acid by a Microdochium nivale carbohydrate oxidase：Kinetics and operational stability[J].Biotechnology and bioengineering，2007，97（4）：694-707.

[11]XU F，GOLIGHTLY E J，F(xiàn)UGLSANG C C，et al.A novel carbohydrate：acceptor oxidoreductase from Microdochium nivale[J]. European Journal of Biochemistry，2001，268（4）：1136-1142.

[12]JANSSEN F W，RUELIUS H W.Carbohydrate oxidase，a novel enzyme from polyporus obtusus：II.Specificity and characterization of reaction products[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Enzymology，1968，167（3）：501-510.

[13]RUELIUS H W，KERWIN R M，JANSSEN F W.Carbohydrate oxidase，a novel enzyme from polyporus obtusus：I.Isolation and purification[J].Biochimicaet Biophysica Acta（BBA）-Enzymology，1968，167（3）：493-500.

[14]許燕.4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶作用于脫支淀粉制備大環(huán)糊精的研究[D].無錫：江南大學，2014.

[15]汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京：科學出版社，2000：42-46.

[16]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72（1）：248-254.

[17]ZHENG Yan，KUANG Lixue，LI Chao，et al.Optimization of fermentation conditions for lactobionic acid production by burkholderia cepacia[J].Food Science，2012，33（11）：181-184.（in Chinese）

[18]謝淵.脂肪酶活性中心區(qū)域進化提高酶動力學穩(wěn)定性和催化活性[D].長春：吉林大學，2014.

會議名稱(中文)：2017中國生物材料大會

所屬學科：生物技術(shù)與生物工程,生物及醫(yī)藥化工,紡織材料與紡織技術(shù),材料科學基礎(chǔ)學科

開始日期：2017-10-27

結(jié)束日期：2017-10-29

所在城市：江西省 南昌市

主辦單位：中國生物材料學會、中國生物醫(yī)學工程學會生物材料分會、華東交通大學

會議主席：王迎軍 萬明

聯(lián)系人：敖海勇15797863906

聯(lián)系電話：0791-87046893

E-MAIL：aohyong@126.com

會議網(wǎng)站：http://clxy.ecjtu.edu.cn/meeting2017/Action/TouristMain

會議背景介紹：由中國生物材料學會（CSBM）、中國生物醫(yī)學工程學會生物材料分會（CSBME-BMB）和華東交通大學共同主辦的“2017中國生物材料大會”將于2017年10月27-29日在“英雄城”南昌舉行。 “2017中國生物材料大會”以“生物醫(yī)用材料創(chuàng)新研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化”為主題，邀請學養(yǎng)深厚的專家學者就生物材料科學與產(chǎn)業(yè)的研究熱點、發(fā)展前沿在南昌論道。大會將由6個大會報告、24個專題報告會（專題分會場近百個）、4個專題研討會及論壇和墻報等組成。

Utilization of Recombinant Carbohydrate Oxidase from Microdochium nivale for Lactobionic Acid Production

GU Limin1，2， ZHOU Xing1，2， JIN Zhengyu*1，2， XU Xueming1，2， ZHOU Jiahui1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The carbohydrate oxidase from Microdochium nivale（MnCO）can catalyze the oxidation of lactose to produce lactobionic acid.In this study，we used the recombinant MnCO which expressed in Pichia pastoris from the genetically engineered bacteria X33-pPICZαA-MnCO stored in our lab.The production of lactobionic acid was optimized by single factor experiment and orthogonal test.The optimal fermentation conditions for the production of lactobionic acid were as follows：the concentration of lactose solution of 5 mmol/L，the amount of enzyme of 1.5 U/ml，the reaction temperature of 55℃，the reaction time of 48 h，the conversion rate of lactose to lactobionic acid could reach to 100%.

lactobionic acid，lactose，recombinant MnCO，conversion rate

TS 236.9

：A

：1673—1689（2017）07—0720—06

2015-06-23

江蘇省自然科學基金項目（BK20130140）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2013311）。

*通信作者：金征宇（1960—），男，江蘇揚州人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事碳水化合物化研究。E-mail：zjin@jiangnan.edu.cn

顧利敏，周星，金征宇，等.重組Microdochium nivale還原糖氧化酶用于制備乳糖酸方法的研究 [J].食品與生物技術(shù)學報，2017，36（07）：720-725.