利用渥堆發(fā)酵制備銀杏葉茶的研究

袁丹丹， 陳曉燕， 侯麗君， 蔣秋燕， 劉 飛， 朱希強(qiáng)

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 /山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品藥品學(xué)院，山東 濟(jì)南 250103）

利用渥堆發(fā)酵制備銀杏葉茶的研究

袁丹丹1， 陳曉燕1， 侯麗君*2， 蔣秋燕2， 劉 飛1， 朱希強(qiáng)1

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 /山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2.山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品藥品學(xué)院，山東 濟(jì)南 250103）

制備發(fā)酵型銀杏葉茶，并探究銀杏葉在發(fā)酵過程中不同時(shí)期總黃酮和銀杏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化。利用渥堆的方式制備發(fā)酵型銀杏葉，在渥堆過程中定期取樣，紫外分光光度法測(cè)定銀杏葉中總黃酮的含量，高效液相色譜法測(cè)定銀杏葉中銀杏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。渥堆后銀杏葉顏色變?yōu)樽睾稚?，苦澀感降低，滋味微甘醇和，總黃酮與銀杏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所下降，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降了6.86%，銀杏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降了29.08%。此結(jié)果為合理開發(fā)銀杏葉提供了參考。

銀杏葉茶；渥堆發(fā)酵；總黃酮；銀杏酸

銀杏是現(xiàn)今地球上最古老的樹種之一，其全身是寶，集食用、藥用、觀賞于一身，具有重要的研究價(jià)值，被稱為植物界的“活化石”[1]。銀杏葉中的成分主要包括銀杏黃酮、內(nèi)酯類、萜類、酚酸類、聚異戊二烯等化合物。以銀杏葉為原料制成的銀杏葉提取物（EGb）是目前國內(nèi)外最暢銷的藥品和食品添加劑之一，EGb對(duì)心肌梗塞、防治冠心病、老年性癡呆等具有良好的藥效，另外，銀杏葉還是一種重要的保健品資源，銀杏葉茶則是深受人們歡迎的綠色保健品[2]。

銀杏黃酮是銀杏葉的主要有效成分之一，具有捕獲游離基、清除活性氧、促進(jìn)血液循環(huán)、抗腫瘤活性及腦代謝等功能[3]。銀杏酸具有潛在的致敏、致突變作用和細(xì)胞毒性[4-7]，隨著國際貿(mào)易的推進(jìn)，一些企業(yè)生產(chǎn)的EGb常常在外銷過程中遭遇退貨，究其原因基本都是由于銀杏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，質(zhì)量檢測(cè)不符合要求。德國衛(wèi)生部規(guī)定EGb制劑中的銀杏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)須小于5 mg/kg[8]，《中國藥典》2010年版也限定EGb中銀杏酸應(yīng)在10 mg/kg以下]，但對(duì)銀杏葉茶中銀杏酸的限量還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，2010年國家質(zhì)監(jiān)局將銀杏葉茶確定為保健食品，因此建立降低銀杏葉茶中銀杏酸含量的方法具有重要意義。

目前市售的銀杏葉茶均是經(jīng)過殺青、揉捻、干燥等基本步驟制備，味道苦澀，口感較差。渥堆可以促使粗老的鮮葉通過一定程度的發(fā)酵，形成優(yōu)良的品質(zhì)特征，作者研究了銀杏葉的渥堆發(fā)酵工藝對(duì)銀杏葉口感的影響，并分別利用分光光度法及高效液相色譜法測(cè)定渥堆發(fā)酵過程中的總黃酮、銀杏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為銀杏葉的開發(fā)利用提供實(shí)踐及理論基礎(chǔ)。在渥堆過程中，銀杏葉中的黃酮類、酚酸類等物質(zhì)在濕熱、微生物的作用下發(fā)生了酶促及非酶促氧化，可以形成銀杏葉的特殊色香味，減少苦澀感，降低銀杏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，制備的發(fā)酵型銀杏葉可直接飲用，或制成銀杏葉提取物供藥用或食用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏葉：采集于山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院葉用銀杏林教學(xué)科研實(shí)驗(yàn)基地；蘆?。罕本┌凫`威科技有限公司產(chǎn)品；白果新酸：森貝伽生物科技公司產(chǎn)品；銀杏酸A（C15∶0，C17∶1）、銀杏酸B（C13∶0，C15∶1，C17∶2）：編號(hào)111594-201304，中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；FA1004型分析天平：上海良平儀器儀表有限公司產(chǎn)品；TES1310快速電子測(cè)溫儀：蘇州特安斯電子有限公司產(chǎn)品；UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9000型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海高致精密儀器有限公司產(chǎn)品；1200型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品。

1.3 銀杏葉的渥堆發(fā)酵

1.3.1 渥堆發(fā)酵 稱取銀杏鮮葉55 kg，經(jīng)清洗、晾曬處理，使其水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)維持在45%，將銀杏葉置于滅菌鍋內(nèi)，升溫至100℃，汽蒸殺青10 min，趁熱將銀杏葉堆積在渥堆室中，整堆，茶堆內(nèi)部要松緊適當(dāng)，邊緣筑緊，茶堆尺寸長寬高為70 cm×70 cm× 55 cm，上面加蓋濕布，利于保溫保濕，隨時(shí)監(jiān)測(cè)堆內(nèi)溫度及空氣溫、濕度變化，并取樣測(cè)定銀杏葉的含水量。堆內(nèi)溫度升至50～60℃時(shí)，保溫一段時(shí)間，翻堆。根據(jù)銀杏葉的色香味等來評(píng)判發(fā)酵進(jìn)程，最后將渥堆結(jié)束的銀杏葉置于滅菌鍋內(nèi)，100℃汽蒸10 min，室外曬干。

1.3.2 溫、濕度及含水量的測(cè)定 堆內(nèi)溫度：將電子測(cè)溫儀探針插入茶堆內(nèi)部30 cm處，測(cè)3處不同位置，取平均值，并記錄數(shù)據(jù)；空氣溫、濕度：利用加熱器及加濕器控制渥堆室溫濕度，并用溫濕度計(jì)監(jiān)測(cè)溫濕度的變化；銀杏葉含水量：用鑷子取茶堆內(nèi)部25～35 cm處的銀杏葉，每4 h取樣一次，銀杏葉含水量按GB/T8304-2002第二法測(cè)定，并將銀杏葉做樣品保存。

1.3.3 銀杏葉的感官審評(píng) 聘請(qǐng)有銀杏葉茶品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的8位品嘗員參照GB/T23776-2009對(duì)銀杏葉樣品進(jìn)行感官審評(píng)，記錄審評(píng)結(jié)果。

1.4 銀杏葉中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

1.4.1 供試品溶液的制備 將渥堆樣品粉碎至40目，分別精密稱取5 g，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，按固液質(zhì)量體積比1 g∶8 mL，放入索氏提取器中回流提取4 h，抽濾得提取液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[9]，稱取蘆丁10mg，50%的乙醇溶解定容于50 mL容量瓶中。吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL加入 10 mL容量瓶中，50%的乙醇補(bǔ)充至5 mL，加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2，搖勻，放置5 min后加入0.3 mL Al（NO3）3，6 min后加入2 mL 1 mol/L的NaOH，混勻，用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇稀釋至刻度，10 min后于波長510 nm處進(jìn)行比色測(cè)定。以0為對(duì)照，以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=11.1C+0.033，r=0.998 8，質(zhì)量濃度在0.001 2～0.04 g/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

1.4.3 銀杏葉中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 取銀杏葉提取液適量，加入10 ml容量瓶中，按2.2.2中的方法操作，測(cè)定銀杏葉中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5 銀杏葉中銀杏酸的測(cè)定

1.5.1 供試品溶液的制備 將渥堆樣品粉碎至40目，稱取1 g于100 mL三角瓶中，加入20 mL甲醇，超聲輔助提取50 min（超聲頻率40 kHz），冷卻后稱取質(zhì)量，并用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，5 000 r/min離心10 min，濾液用微孔濾膜過濾，得供試品溶液。

1.5.2 對(duì)照品溶液的制備 銀杏酸A、銀杏酸B以1∶2的質(zhì)量比加入到10 mL容量瓶中，甲醇定容，得總銀杏酸定位用溶液。精密稱取9.9 mg白果新酸，用甲醇定容至10 mL，作為對(duì)照品溶液。

1.5.3 HPLC檢測(cè)條件 色譜柱，安捷倫ZORBAX，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動(dòng)相，V（甲醇）∶V（體積分?jǐn)?shù)1%冰醋酸）=90∶10；流量，1.0 mL/min；柱溫，40℃；紫外檢測(cè)波長，310 nm；進(jìn)樣量，20 μL。

1.5.4 總銀杏酸含量的測(cè)定 精密吸取供試品溶液、定位用溶液、對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，計(jì)算供試品溶液中與總銀杏酸定位用溶液色譜峰的總面積，以白果新酸對(duì)照品，外標(biāo)法計(jì)算總銀杏酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀杏葉茶的制備

渥堆技術(shù)最早應(yīng)用在黑茶（如湖南黑茶、云南普洱茶、四川邊茶、廣西六堡茶等）中，是形成黑茶品質(zhì)的關(guān)鍵工序，可以促使鮮葉通過一定程度的發(fā)酵，形成葉色黑潤、香氣純正、滋味醇和、湯色明亮的品質(zhì)特征，并可通過微生物、濕熱作用的轉(zhuǎn)化形成黑茶的功效成分[10]。為了減少銀杏葉的苦澀感，并提高其品質(zhì)，作者即采用渥堆技術(shù)處理銀杏葉，經(jīng)過數(shù)天的發(fā)酵，當(dāng)銀杏葉由黃色變?yōu)樽睾稚?，青澀氣消除，葉坯出現(xiàn)黏汁，發(fā)出醇香，即為渥堆適度，渥堆發(fā)酵時(shí)間為8 d，最后進(jìn)行晾曬處理后，得發(fā)酵型銀杏葉。渥堆前后的銀杏葉如圖1所示。如圖1（a）、（b）所示，渥堆后，銀杏葉的色澤發(fā)生了明顯的變化，從亮黃色變?yōu)樽睾稚纬闪司哂歇?dú)特色澤的銀杏葉茶。

2.2 銀杏葉的渥堆發(fā)酵進(jìn)程

銀杏葉茶品質(zhì)的好壞與環(huán)境條件有較大的關(guān)系，要保持適宜的環(huán)境溫、濕度，溫、濕度過高或過低都不利于渥堆發(fā)酵的進(jìn)行。渥堆過程中最為關(guān)鍵性的因素是銀杏葉的含水量以及堆內(nèi)溫度?？刂七m宜的含水量，含水量太高，容易滋生腐敗菌，銀杏葉易酸餿而軟爛；含水量太低，微生物生長緩慢，且不利于濕熱作用的進(jìn)行。隨著氧化的進(jìn)行及微生物的生長代謝，堆內(nèi)溫度不斷升高，堆內(nèi)溫度較高時(shí)進(jìn)行翻堆處理，否則容易“燒芯”；溫度低于40℃時(shí)，注意保溫處理，否則容易滋生大量黑曲霉和青霉。渥堆進(jìn)程曲線如圖2所示。

圖1 銀杏葉渥堆前后的對(duì)比圖Fig.1 Comparison of Ginkgo biloba leaves before and after pile-fermentation

圖2 渥堆發(fā)酵進(jìn)程曲線Fig.2 Pile-fermentation course curve of Ginkgo biloba leaves

渥堆發(fā)酵進(jìn)程曲線如圖2所示，室內(nèi)溫度維持在23～30℃，空氣相對(duì)濕度維持在50%～70%，空氣溫、濕度條件基本滿足渥堆過程中微生物的生長需求。渥堆初始，堆內(nèi)溫度較高，為汽蒸余熱，稍后有小幅度下降。在40 h時(shí)堆內(nèi)溫度開始快速上升，觀察發(fā)現(xiàn)，此時(shí)堆表有霉菌生長，但茶堆內(nèi)部沒有霉菌生長，由于內(nèi)部溫度較高，抑制了霉菌的生長。溫度上升后，保持一定時(shí)間開始翻堆，整個(gè)過程翻堆兩次，翻堆時(shí)打散茶坯，將邊上茶坯翻入中心。翻堆時(shí)間在76、132 h，翻堆后堆內(nèi)溫度有較大下降，但在很短的時(shí)間溫度上升，溫度最高可達(dá)到58℃。銀杏葉的初始含水量為45%，在渥堆開始的72 h，銀杏葉含水量變化緩慢，只有小幅度下降，翻堆后含水量有所降低，此時(shí)做灑水處理，使水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持在30%～35%。整個(gè)過程中嚴(yán)格控制各參數(shù)，以保證渥堆發(fā)酵的順利進(jìn)行。

2.3 渥堆過程中堆樣感官審評(píng)

在渥堆過程中，由含水量、葉溫、微生物等的共同作用，銀杏葉的色香味發(fā)生著不同的變化。從審評(píng)結(jié)果看（表1），隨著渥堆的進(jìn)行，葉色由黃色變?yōu)樽睾稚?，條索變得更加緊結(jié)，湯色橙紅明亮，香氣由原來的略帶青草氣變?yōu)榇枷阒新詭У菟幭?，滋味由單一苦澀轉(zhuǎn)為醇和，葉底由黃色較整變?yōu)樽睾置髁?。由此可見，?jīng)過渥堆發(fā)酵，銀杏葉的感官品質(zhì)發(fā)生了一定的變化，口感尚佳，適于飲用。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間銀杏葉的感官審評(píng)結(jié)果Table 1 Results of sensory evaluation of Ginkgo biloba leaves at different times during fermentation

2.4 渥堆過程中黃酮含量的變化

渥堆過程中復(fù)雜的物質(zhì)轉(zhuǎn)化，主要來自于茶葉中的微生物，微生物類群包括黑曲霉、青霉、根霉、酵母菌、細(xì)菌等，多數(shù)研究認(rèn)為黑曲霉是優(yōu)勢(shì)菌群，發(fā)揮主要作用，酵母菌其次[11]。在銀杏葉茶的渥堆中發(fā)現(xiàn)黑曲霉亦最多。黑曲霉能產(chǎn)生多種酶，果膠酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶等，可以分解多糖、蛋白質(zhì)、果膠和水不溶性化合物等有機(jī)物，形成其它化合物[12]。銀杏葉在微生物的作用下，其內(nèi)含成分—黃酮發(fā)生了一定的變化，變化趨勢(shì)如圖3所示。

圖3 渥堆發(fā)酵過程中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化曲線Fig.3 Change curve of total flavonoids in the process of pile-fermentation

由圖3可見，渥堆開始時(shí)，銀杏葉中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.02%，隨著渥堆的進(jìn)行，總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在第4～6 d，下降速度最快，此時(shí)也是微生物數(shù)量最多、代謝活動(dòng)最劇烈的時(shí)期。至發(fā)酵結(jié)束時(shí)，總黃酮的下降率為6.86%。銀杏黃酮是銀杏葉中的生理活性物質(zhì)，雖然質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所降低，但是，在微生物胞外酶的作用下，使黃酮發(fā)生了轉(zhuǎn)化、降解等反應(yīng)，可能生成了更具活性的物質(zhì)，機(jī)理需進(jìn)一步的研究探討。

2.5 渥堆發(fā)酵過程中總銀杏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

按2.3中的方法測(cè)定，以總銀杏酸作為定位用對(duì)照品，以白果新酸為對(duì)照品外標(biāo)法測(cè)總銀杏酸的含量。色譜圖見圖4。

圖4 銀杏葉提取物的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC Chromatograms of Ginkgo biloba extract

從高效液相色譜圖4（c、d）兩圖可以看出，渥堆后銀杏葉中的總銀杏酸明顯減少。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜4（a、b），計(jì)算出銀杏葉渥堆各時(shí)期總銀杏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，總銀杏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化如圖5所示，隨著渥堆發(fā)酵的進(jìn)行，總銀杏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低，0～6 d銀杏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較小，6～8 d銀杏酸迅速下降，最終下降率達(dá)到29.08%。在渥堆中后期銀杏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)才開始減少，顯然這些變化都與微生物的變化有關(guān)系的，可能是微生物在生長過程中利用代謝銀杏酸，將這種有毒物質(zhì)分解掉。因此，渥堆發(fā)酵達(dá)到了降低總銀杏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的目的。

圖5 渥堆發(fā)酵過程中銀杏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化曲線Fig.5 Change curve of Ginkgolic acids in the process of pile-fermentation

3 結(jié)語

渥堆發(fā)酵宜采用較粗老原料，不易渥爛。作者采集11月下旬的銀杏葉，此時(shí)銀杏葉黃色，較粗老，利于渥堆發(fā)酵的進(jìn)行。渥堆后，口感發(fā)生了明顯的改善，苦澀感消失，滋味醇和，色香味等各方面均優(yōu)于普通市售銀杏茶，更符合大眾口味，說明渥堆處理方式可作為以后銀杏葉大規(guī)模開發(fā)利用的方法。利用紫外分光光度法測(cè)定，銀杏黃酮含量從最初的1.02%下降到0.95%，下降率為6.86%，但從整個(gè)發(fā)酵8d的時(shí)間來看，下降率較小。HPLC法測(cè)定銀杏酸含量，從1.41%下降到1.0%，下降率達(dá)29.08%，因此增加了發(fā)酵型銀杏葉的質(zhì)量品質(zhì)。另外，由于發(fā)酵型銀杏葉中銀杏酸含量有較大的下降，其后續(xù)經(jīng)過分離提取制備的EGb中銀杏酸的含量勢(shì)必減少，提高了銀杏葉制劑的安全性。

[1]王新雯.銀杏葉黃酮類化合物的提取、分離純化及其生物活性研究[D].桂林：桂林理工大學(xué)，2010.

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科技信息

歐盟發(fā)布蛋白質(zhì)健康聲明的評(píng)估意見

2017年6月13日，歐盟發(fā)布在限制攝取能量和減少體重的情況下蛋白質(zhì)比例≤1.8的健康聲明的評(píng)估意見。根據(jù)Marks和Spencer PLC的申請(qǐng)，經(jīng)由英國主管機(jī)關(guān)提交的依照（EC）第1924/2006號(hào)條例第13（5）條授予衛(wèi)生要求的食品，EFSA營養(yǎng)產(chǎn)品，營養(yǎng)和過敏要求（NDA）在限制飲食能量和體重的背景下就能量基礎(chǔ)上的CHO：P比值≤1.8的健康聲明的科學(xué)證據(jù)發(fā)表意見。

根據(jù)所提交的數(shù)據(jù)，得出結(jié)論：（一）在能量限制飲食背景下消耗的能量基礎(chǔ)上的固定CHO：P比≤1.8是充分表征的。（二）申請(qǐng)人提出的要求賠償?shù)男Ч恰霸谀芰渴芟迼l件下減少總體重”。在能量限制飲食的背景下減輕體重是有益的生理效應(yīng)。（三）在能量限制飲食背景下消耗的能量基礎(chǔ)的CHO：P比值≤1.8與體重減輕之間的因果關(guān)系尚未確定。

［信息來源］廈門WTO工作站.歐盟發(fā)布蛋白質(zhì)健康聲明的評(píng)估意見[EB/OL].(2017-6-21).http://www.xmtbt-sps.gov. cn/detail.asp?id=54670

Study on Production of Ginkgo biloba Tea with Pile-Fermentation

YUAN Dandan1， CHEN Xiaoyan1， HOU Lijun*2， JIANG Qiuyan2， LIU Fei1， ZHU Xiqiang1
（1.Polysaccharide Drugs Engineering Laboratory of Shandong Province/Shandong Key Laboratory of Biological Drugs/Shandong Academy of Pharmaceutical Science，Jinan 250101，China；2.Food and Drug Department，Shandong Institute of Commerce and Technology，Jinan 250103，China）

To produce Ginkgo biloba tea and research the changes of total flavonoids and ginkgolic acids during the process of Ginkgo biloba leaves with pile-fermentation.Pile-fermentation was used to produce Ginkgo biloba leaves.The contents of total flavonoids and ginkgolic acids in different times of fermentation were determined by UV spectrophotometry and HPLC respectively.After pile-fermentation，the colour of Ginkgo biloba leaves was brown.Soup was decreasing bitterness，slightly sweet and mellow taste.During the fermentation，the content of total flavonoids and ginkgolic acids showed a downward trend，total flavonoids dropped 6.86%，ginkgolic acids dropped 29.08%. These results provide reference for reasonable development of Ginkgo biloba leaves.

Ginkgo biloba tea，pile-fermentation，total flavonoids，ginkgolic acids

TS 27

：A

：1673—1689（2017）07—0750—06

2015-06-17

山東省教育廳科技計(jì)劃課題（J06K59）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2015GSF121003）。

*通信作者：侯麗君（1961—），女，山東煙臺(tái)人，教授，主要從事醫(yī)藥教育與研究。E-mail：lfshwu@163.com

袁丹丹，陳曉燕，侯麗君，等.利用渥堆發(fā)酵制備銀杏葉茶的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（07）：750-755.