基于MALDI-TOF MS的串聯(lián)富集策略在磷酸化蛋白組學(xué)中的應(yīng)用

張傳靜，吳 婷，任紅鑫，張玲帆，杜一平

(華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237)

研究報告

基于MALDI-TOF MS的串聯(lián)富集策略在磷酸化蛋白組學(xué)中的應(yīng)用

張傳靜，吳 婷*，任紅鑫，張玲帆，杜一平

(華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237)

提出一種除鹽-富集串聯(lián)用于磷酸肽富集研究的思路。選用C18柱和鈰(Ⅳ)修飾的殼聚糖材料進行脫鹽實驗，以制備的基于聚合物基體螯合Fe3+的親和色譜材料為富集材料。將直接富集和串聯(lián)策略應(yīng)用到標(biāo)準(zhǔn)品和血清中，研究結(jié)果表明，該富集材料具有高選擇性和高靈敏度(1.6 fmol)，鈰(Ⅳ)修飾的殼聚糖材料前提下的串聯(lián)策略能明顯降低樣品的復(fù)雜性。相比直接富集方法，能夠提高磷酸化肽的覆蓋率。

脫鹽；固定金屬離子親和色譜；基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜；磷酸肽；串聯(lián)富集

蛋白質(zhì)的磷酸化是一個可逆過程，是極其重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式之一，調(diào)控著很多的生理過程，諸如基因表達、細(xì)胞的增殖與分裂、新陳代謝以及信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[1-3]。因此，關(guān)于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究備受關(guān)注。

生物質(zhì)譜技術(shù)具備反映生物信息的能力，現(xiàn)已被廣泛用于蛋白質(zhì)的磷酸化分析。然而，在磷酸化蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物中，磷酸化肽段的含量低，與此同時離子化效率也低。在進行質(zhì)譜檢測時，磷酸化肽段的信號會被高豐度的非磷酸化肽段的信號干擾和抑制[4]，甚至無法進行檢測。所以，在檢測之前，需從樣品中將磷酸化肽選擇性地分離富集出來。目前，固定金屬離子親和色譜法(IMAC)的操作過程最簡單方便，是磷酸化肽段分離富集中使用最為頻繁的重要技術(shù)之一，其基本原理是利用金屬離子與磷酸肽中的磷酸基團之間形成強的螯合作用力，從而實現(xiàn)磷酸肽的分離與富集。IMAC材料主要由色譜基質(zhì)、連接臂和金屬離子組成。傳統(tǒng)的固定Fe3+、Ga3+和Al3+的IMAC材料[5-7]以亞氨基二乙酸和次氮基三乙酸為連接臂，連接臂和金屬離子間的親和作用力較弱，在使用過程中易丟失金屬離子，限制了材料的富集效率。近年來，固定Zr4+和Ti4+的IMAC材料[8-10]基于磷酸肽的磷酸根與金屬離子間牢固的親和作用力實現(xiàn)磷酸肽富集；固定Ce4+的IMAC材料[11]金屬離子固載量豐富且可重復(fù)使用性好，實驗室現(xiàn)有的鈰(Ⅳ)修飾的殼聚糖材料(Ce-MCM)不僅具備上述優(yōu)點，還具有寬泛的使用范圍，在pH 3.0～11.0下均可使用，在一般的有機介質(zhì)中也很穩(wěn)定，能夠耐受離心和超聲處理。

一般直接采用IMAC方法來實現(xiàn)磷酸化肽的富集。但由于一些鹽分和污染物的存在，造成加合峰過多形成峰包，給質(zhì)譜分析帶來不便。為解決實際問題，相關(guān)的研究致力于串聯(lián)策略[12]。二維色譜的完美結(jié)合，諸如強陰離子交換-金屬氧化物親和色譜法(SAX-MOAC)[13]、強陽離子交換-固定金屬離子親和色譜法(SCX-IMAC)[14]、固定金屬離子親和色譜-親和作用色譜(IMAC-HILIC)[15]、固定金屬離子親和色譜- C18(IMAC-C18)[16]柱和固定金屬離子親和色譜(IMAC-IMAC)[17]已成為趨勢并在磷酸化肽的識別上表現(xiàn)出各自的特性。

為改善質(zhì)譜檢測結(jié)果[18]，通常需對肽和蛋白樣品進行除鹽。本文提出一種除鹽-富集串聯(lián)策略用于研究磷酸化肽的分離富集，分別選用商品化的C18柱和Ce-MCM進行除鹽實驗，以制備的一種基于聚合物基體螯合Fe3+的IMAC材料為富集材料。綜合比較了兩者的除鹽能力以及串聯(lián)之后富集磷酸化肽的效果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

真空掃描電子顯微鏡(SEM，型號：HITACHI-S3400N)，傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR，型號：6700)，基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀(AB SCIEX 4800 plus MALDI-TOF/TOF MS)。美國Millipore公司Milli-Q(Millipore，Bedford，MA)水處理系統(tǒng)。

甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、2，2′-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、三氟乙酸(TFA，99%)購自阿拉丁試劑有限公司。乙氧化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯(SR454)、α-酪蛋白(α-Casein)、β-酪蛋白(β-Casein)、牛血清白蛋白(BSA)、2，5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)、二硫蘇糖醇(DTT，99%)、碘代乙酰胺(IAA，99%)、亞氨基二乙酸(IDA)和乙腈(ACN，高效液相色譜級別)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。無水碳酸鈉、六水合氯化鐵、氯化鈉、濃氨水和碳酸氫銨購自國藥控股有限公司。人血清為100例健康人血清混合樣品，樣品存儲于-80 ℃冰箱待用。實驗用水由Milli-Q水處理系統(tǒng)處理。

1.2 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的制備

GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA的合成流程如圖1所示。

圖1 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的制備示意圖Fig.1 Synthesis of GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA material

粉末狀GMA-co-SR454材料的合成：稱取甲基丙烯酸縮水甘油酯1.9 g，乙氧化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯2.9 g，2，2′-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)0.12 g，置于10 mL離心管中。移取環(huán)己醇6.234 mL和甲醇1.517 mL于上述離心管中，使用渦旋振蕩器加速固體完全溶解。轉(zhuǎn)移上述溶液于8 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，用波長為365 nm的便攜式紫外燈照射10 min，促使自由基聚合反應(yīng)發(fā)生。聚合反應(yīng)完成后，關(guān)閉紫外燈，分別用甲醇和超純水洗去致孔劑和未反應(yīng)完的單體，得到整體柱材料。將所合成的整體柱材料通過研磨、篩分后，獲得一定大小的粉末狀GMA-co-SR454材料。

GMA-co-SR454-IDA材料的合成：根據(jù)已有報道[19]，對GMA-co-SR454材料進行羧基改性。將1.5 g上述合成的粉末狀GMA-co-SR454材料置于100 mL圓底燒瓶中，加入0.50 g 20 mL IDA 的碳酸鈉溶液(pH 10.0)，再加入0.25 g氯化鈉，置于75 ℃水浴中，攪拌反應(yīng)6 h。之后離心，棄去上清液，將材料用超純水洗至中性。

GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的合成：根據(jù)方法[8]，對GMA-co-SR454-IDA材料固定金屬離子。取適量的上述材料于100 mL圓底燒瓶中，隨后加入40 mL 50 mmol/L的三氯化鐵溶液，常溫下攪拌反應(yīng)3 h。減壓抽濾，用超純水洗至中性，自然環(huán)境下晾干，即得粉末狀的GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的酶解及人血清樣品制備

1）部分街道名稱標(biāo)注不清。如創(chuàng)新街和創(chuàng)業(yè)街，兩條街的地理位置接近，老百姓極易混淆。個別街道名稱后來經(jīng)過更名，而更名后的街道名稱反而給老百姓帶來記憶上的混亂。如北宮街的其中一段在2014年更名為通亭街，新、老北宮街沒有實現(xiàn)實際的對接，給老百姓出行帶來一定困擾。

稱取1.00 mg 標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白質(zhì)(α-/β-酪蛋白)，溶解于500 μL 25 mmol/L碳酸氫銨溶液(pH 8.2)，按照酶與蛋白質(zhì)量比1∶50的比例加入胰蛋白酶，于37 ℃酶解18 h。

稱取2.00 mg牛血清白蛋白，溶于1 mL含8 mol/L尿素和50 mmol/L碳酸氫銨(pH 8.3)的溶液中，加入20 μL 1 mol/L二硫蘇糖醇，于60 ℃孵育1 h。隨后加入7.20 mg碘代乙酰胺，置于室溫和暗室的環(huán)境下烷基化反應(yīng)45 min，用50 mmol/L碳酸氫銨(pH 8.3)溶液稀釋10倍。按照酶與蛋白質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶，37 ℃酶解18 h。酶解結(jié)束后，分裝凍干，存儲于-20 ℃冰箱備用。

對于人血清，收集血液樣品5 mL于室溫下凝結(jié)1 h，離心，保留上清液并分裝，存儲于-20 ℃冰箱備用。

1.4 樣品脫鹽處理

C18柱除鹽步驟比較成熟，可參考已有文獻[20]。而Ce-MCM脫鹽的流程如下：首先用60% ACN/1.0% TFA體系將樣品稀釋至所需濃度，加入0.10 mg Ce-MCM，室溫下振蕩10 min。離心，移去上清液，用50% ACN/0.1% TFA體系清洗殘留物3次，將殘留在材料表面的鹽分、干擾物或結(jié)合不牢固的肽段清洗下來。最后，使用5%(體積分?jǐn)?shù))NH3·H2O作為洗脫液，將結(jié)合在材料上的肽段洗脫下來，待用。

1.5 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料分離富集磷酸肽

將樣品溶液用上樣液(80% ACN/0.1% TFA或1.0% TFA)稀釋至所需濃度，加入0.50 mg GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料，室溫下振蕩30 min。于8 000 r/min下離心5 min，棄去上清液。依次用上樣液和80% ACN溶液進行清洗，前者洗2次，后者洗1次。加入10 μL 15% NH3·H2O洗脫2次，收集洗脫液，待用。

取0.5 μL洗脫液點覆于不銹鋼靶板的圓點處，室溫自然揮干，再將0.5 μL DHB基質(zhì)溶液點覆在樣品表面，室溫下自然揮干；將制備好的樣品送入MALDI-TOF MS進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的合成與表征

圖1為GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA的合成過程。首先，GMA單體在交聯(lián)劑和紫外光的共同作用下，發(fā)生聚合反應(yīng)，制備出GMA-co-SR454整體柱材料。其次，整體柱材料上的環(huán)氧基與IDA發(fā)生親電取代反應(yīng)而開環(huán)，生成GMA-co-SR454-IDA材料。最后，通過Fe3+與雜原子氧之間的螯合作用，而成功將Fe3+固載在材料上。

采用傅立葉紅外光譜(FT-IR)分析GMA與SR454的聚合情況以及亞氨基二乙酸與該聚合物的反應(yīng)情況(圖2)。如圖2a所示，908 cm-1處的峰對應(yīng)于GMA中環(huán)氧基的對稱伸縮振動，說明聚合反應(yīng)生成了GMA-co-SR454。圖2b中3 425 cm-1處的吸收峰對應(yīng)于締合的O—H的伸縮振動，1 129 cm-1處的峰對應(yīng)于C—OH的伸縮振動，608 cm-1處的峰對應(yīng)于締合狀態(tài)的醇類中O—H的面外變形振動，說明亞氨基二乙酸接到GMA-co-SR454聚合物上，從而使環(huán)氧基發(fā)生開環(huán)。

掃描電鏡圖(圖3)顯示，GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA呈堆積的球形結(jié)構(gòu)，直徑約為100 nm。

圖2 GMA-co-SR454(a)與GMA-co-SR454-IDA(b)的傅立葉變換紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of GMA-co-SR454(a) and GMA-co-SR454-IDA(b)

圖3 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的掃描電鏡圖Fig.3 SEM image of GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA material

2.2 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料用于標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白質(zhì)酶解液中磷酸化肽的富集

為考察GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料對磷酸化肽段的富集性能，首先使用磷酸化的β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(通常含有α-酪蛋白)的酶解液進行評價。如圖4A所示，直接分析時，僅能檢測到2條弱信號強度和低信噪比的目標(biāo)肽段，這是由于磷酸化肽的豐度低、離子化效率低，以及高豐度的非磷酸化肽對磷酸化肽有強烈的信號抑制作用。然而，經(jīng)GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料富集后(圖4B)，非磷酸化肽段的質(zhì)譜峰幾乎消失，檢測到4條高信號強度和高信噪比β-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽段以及4條低信號強度的α-酪蛋白中的磷酸化肽段。其中有一系列特征性的片段，如丟失磷酸基團的肽段，信號強度比較可觀。另外，評估了該材料對α-酪蛋白酶解液中磷酸化肽段的富集能力，成功捕捉到21條目標(biāo)肽段。以上富集到的目標(biāo)肽段的詳細(xì)信息見表1。

圖4 直接分析β-酪蛋白酶解液(A)以及經(jīng)GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料富集后(B)的質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI-TOF MS of tryptic digest of β-casein direct analysis(A) and after enrichment with GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA(B)the phosphopeptides and their dephosphorylated fragments of the metastable losses of phosphoric acid were marked with β and -nH3PO4,respectively

為進一步評價GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料的富集選擇性，將該材料用于β-酪蛋白酶解液與牛血清白蛋白酶解液的混合體系。當(dāng)兩者的摩爾比為1∶10時，在未富集之前有2條信號強度很低的磷酸化肽段，非磷酸化肽段的峰占主導(dǎo)位置。而經(jīng)該材料富集后，在洗脫液中檢測到4條β-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽段。即使將兩者的摩爾比降至1∶500，該材料仍能高效地富集到3條目標(biāo)肽段。

2.3 GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料對β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集靈敏度

將GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料分別用于富集不同稀釋濃度的β-酪蛋白酶解液。結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS可以檢測出4 fmolβ-酪蛋白酶解液中的4條磷酸化肽；當(dāng)β-酪蛋白酶解液的濃度降低至1.6 fmol時，質(zhì)譜圖上有β1和β5峰，β5峰的強度隨蛋白酶解液濃度的降低發(fā)生規(guī)律性地變化。由于在β-酪蛋白酶解液的濃度降于1.6 fmol的情況下，質(zhì)譜儀未檢測到任何峰。因此，當(dāng)選用β5峰來定義檢出限時，GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA材料對磷酸化肽的檢出限為1.6 fmol。優(yōu)于文獻[18-19]中其他IMAC材料的檢出限(如chitosan-GMA-IDA-Fe3+為5 fmol，NPs poly(AGE/DVB)-Fe3+wafer為2 fmol)。

圖5 直接分析β-酪蛋白酶解液(A)，經(jīng)C18吸附材料除鹽后(B)，以及經(jīng)Ce-MCM除鹽后(C)的質(zhì)譜圖Fig.5 MALDI-TOF MS of tryptic digest of β-caseinA.no desalting;B.desalted by C18;C.desalted by Ce-MCM;NPP:non-phosphopeptide(非磷酸肽);PP:phosphopeptide(磷酸肽)

2.4直接IMAC富集與串聯(lián)策略分離富集比較

為考察除鹽效果，首先檢測了脫鹽后的酶解液。如圖5A所示，直接分析β-酪蛋白的酶解液時，由于碳酸氫銨的干擾，僅能檢測到10條肽段。而經(jīng)過除鹽后，得到的質(zhì)譜圖有明顯改善，肽段的數(shù)目及信號強度有所增加(圖5B、C)。通過比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Ce-MCM除鹽后，質(zhì)譜儀能檢測出20條肽段數(shù)，其中磷酸化肽段有9條；而經(jīng)C18柱處理后的質(zhì)譜結(jié)果是15條肽段中有4條磷酸化肽段。這是由于Ce-MCM是一種IMAC材料，在使用的ACN/TFA體系下，對特定的肽段沒有選擇性，能保留更多的肽段，在堿性條件下，保留的肽段能被有效地洗脫下來；而C18吸附材料易使一些親水性的肽段丟失或者在鹽濃度高的情況下，作用效率低。由此可知，Ce-MCM的除鹽效果更為理想。

另外，將串聯(lián)策略分離富集的質(zhì)譜圖與直接富集的質(zhì)譜圖進行比較，發(fā)現(xiàn)C18柱和Ce-MCM的脫鹽對富集產(chǎn)生不同影響。如圖6所示，前者(圖A)使磷酸化肽的數(shù)目及信號強度減弱。后者(圖B)卻恰恰相反，單磷酸化肽段(β1，β4)的峰明顯增強，1條新的單磷酸化肽段(β3)被富集到，而在多磷酸化肽段中，β5肽段減弱，β2肽段幾乎不見。

為進一步說明問題，將串聯(lián)策略應(yīng)用到α-酪蛋白酶解液中。如圖7所示，相比直接IMAC富集，Ce-MCM/IMAC(圖7A)能捕捉到更多的目標(biāo)肽段(24條)，并且有不同的目標(biāo)肽段。而C18/IMAC(圖7B)表現(xiàn)效果不佳。通過比較圖7A與圖7B發(fā)現(xiàn)，圖7A中，單磷酸化肽段的峰如α3、α4、α6、α7、α10、α11從無到有，而且峰α8的信號強度顯著增強。但在一些多磷酸肽段的峰中，峰α21、α23、α25、α27、α29減弱，峰α18、α24、α26、α30消失不見。這些現(xiàn)象歸因于脫鹽材料各自不同的特性，Ce-MCM是一種金屬螯合親和色譜材料，在60% ACN/1.0% TFA上樣液體系下，非磷酸化肽和磷酸化肽在材料上產(chǎn)生共吸附，保留的肽段經(jīng)5% NH3·H2O洗脫液洗脫后，其質(zhì)譜響應(yīng)信號明顯改善，此外，Ce-MCM上的鈰(Ⅳ)金屬離子對磷酸酯鍵的水解作用[21]，使一些多磷酸肽的含量降低，甚至使含量不高的多磷酸肽達不到質(zhì)譜檢測時需求的濃度。而C18吸附材料是反相色譜材料，易造成一些親水性的肽段如磷酸肽的丟失[22]。綜上可知，Ce-MCM/IMAC串聯(lián)策略中的Ce-MCM的親和色譜性質(zhì)有利于磷酸化肽數(shù)目的增加。以上富集到的目標(biāo)肽段的詳細(xì)信息見表1。

圖6 β-酪蛋白酶解液經(jīng)C18/IMAC富集后(A)，經(jīng)Ce-MCM/IMAC富集后(B)的質(zhì)譜圖Fig.6 MALDI-TOF MS of tryptic digest of β-casein after enrichment by C18/IMAC(A) and Ce-MCM/IMAC(B)-nHPO3 ：the metastable losses of metaphosphoric acid(-nHPO3為脫亞磷酸基團肽段)

圖7 α-酪蛋白酶解液經(jīng)Ce-MCM/IMAC富集后(A)，以及經(jīng)C18/IMAC富集后(B)的質(zhì)譜圖Fig.7 MALDI-TOF MS of tryptic digest of α-casein after enrichment by Ce-MCM/IMAC(A) and C18/IMAC(B) *multi-phosphopeptides(多磷酸肽)

表1 直接IMAC方法和串聯(lián)策略從α-/β-酪蛋白酶解液中富集到的磷酸化肽段的磷酸化位點及序列Table 1 Phosphorylation sites and the sequence of identified peptides in tryptic digest of α-/β-casein enriched by direct IMAC and tandem desalting/IMAC

a:phosphorylated residue,b:oxidation on methionine,c:pyroglutamylation on the N-terminal

圖8 正常人的血清經(jīng)IMAC材料富集后(A)，經(jīng)C18/IMAC富集后(B)以及經(jīng)Ce-MCM/IMAC富集后(C)的質(zhì)譜圖Fig.8 MALDI-TOF MS of the diluted human serum sample after enrichment with direct IMAC(A)，with C18/IMAC(B) and with Ce-MCM/IMAC(C)F：phosphopeptides；-nHPO3 ：dephosphorylated fragments of the metastable losses of metaphosphoric acid

以健康人血清為實際樣品，Ce-MCM/IMAC(圖8C)能捕捉到與直接IMAC方法(圖8A)等同的4條目標(biāo)肽段(1 389.5，1 460.5，1 545.6，1 616.6)，此外還檢測到多余的峰，即去亞磷酸基團的峰，這是鈰(Ⅳ)離子催化磷酸酯鍵發(fā)生水解作用的結(jié)果。但在C18/IMAC(圖8B)的情況下，僅能富集到3條目標(biāo)肽段，并且肽段F2和F3的峰強相對變?nèi)酢?/p>

3 結(jié) 論

制備了基于聚合物的GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA富集材料，并提出除鹽-富集串聯(lián)策略。通過考察標(biāo)準(zhǔn)品和實際樣品，發(fā)現(xiàn)該材料能選擇性地富集到β-酪蛋白酶解液中的4條目標(biāo)肽段和血清中的4條目標(biāo)肽段，檢出限達1.6 fmol。另外，Ce-MCM/IMAC串聯(lián)的結(jié)果優(yōu)于C18/IMAC和直接IMAC富集，能顯著降低樣品的復(fù)雜性和增加磷酸化肽的富集數(shù)目，方法重現(xiàn)性好。因此，該串聯(lián)富集策略可為增加磷酸化肽的覆蓋率提供一種新思路。

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[22] Hussain D,Najamulhaq M,Jabeen F,Ashiq M N,Athar M,Rainer M,Huck C W,Bonn G K.Anal.Chim.Acta,2013,775(7):75-84.

Application of Tandem Enrichment Strategy by MALDI-TOF MS in Phosphorylated Proteomics

ZHANG Chuan-jing,WU Ting*,REN Hong-xin,ZHANG Ling-fan,DU Yi-ping

(School of Chemistry and Molecular Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

A scheme was presented for the tandem purification of phosphopeptide using desalting prior to immobilized metal ion affinity chromatography(IMAC).Both C18tip and the cerium(Ⅳ)-modified chitosan material(Ce-MCM) were used in the desalting experiments.GMA-co-SR454/Iron(Ⅲ)-IDA was synthesized,and used as an excellent phosphopetides enrichment material.They were applied to selectively capture the phosphopeptides in standards and human serum.Results demonstrated that C18/IMAC and Ce-MCM/IMAC have different performances because of their hydrophobic or hydrophilic properties.Ce-MCM/IMAC tandem strategy notably decreased the complexity of peptides,and yielded a far greater coverage for phosphopeptides than single IMAC.

desalting; IMAC; matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS); phosphopeptides; tandem enrichment

O657.7；O657.63

：A

：1004-4957(2017)09-1061-08

2017-03-19；

：2017-05-20

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2015IK201)

*

：吳 婷，博士，高級工程師，研究方向：蛋白質(zhì)組學(xué)，Tel:021-64252107，E-mail:wu_ting@ecust.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.09.001