葉酸修飾的載藥相變納米粒體內靶向顯影腫瘤的實驗研究

葉鳴 翟蓓 劉瑩 陳昶宇 李奧 周洋

·實驗研究·

葉酸修飾的載藥相變納米粒體內靶向顯影腫瘤的實驗研究

葉鳴 翟蓓 劉瑩 陳昶宇 李奧 周洋

目的 研究葉酸受體（FR）靶向的、載紫杉醇（PTX）的相變納米粒造影劑（FR－PTX－PNPCA）用于顯影裸鼠移植瘤的能力。方法 制備FR－PTX－PNPCA乳劑和非靶向的相變納米粒乳劑（PTX－PNPCA）備用；選取載卵巢癌移植瘤的裸鼠30只，根據(jù)注射藥物不同隨機等分為生理鹽水組、非靶向組及靶向組，于注射藥物前后采用活體熒光儀對裸鼠進行熒光顯影，比較各組熒光顯影情況。熒光顯影后48 h，分別重新注射藥物，2 h后采用治療超聲輻照腫瘤10 min，對腫瘤再次超聲顯影，比較各組顯影強度，分析FR－PTX－PNPCA體內靶向顯影腫瘤的能力。結果 活體熒光顯影實驗中，注射藥物后，生理鹽水組、非靶向組腫瘤內幾乎未見紅色熒光顯影，靶向組組腫瘤內可見明顯的紅色熒光顯影。超聲顯影實驗中，治療超聲輻照前，各組腫瘤內顯影強度無顯著差異；超聲輻照后，造影模式下靶向組顯影強度為（383．65±32．05）U，明顯高于生理鹽水組和非靶向組［（86．78±7．74）U、（81．86±11．98）U］，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．01），且較常規(guī)模式下這種差異更為顯著。結論 經靜脈注射FR－PTX－PNPCA能靶向裸鼠卵巢癌移植瘤，并顯著增強其超聲顯影，為腫瘤的精準醫(yī)療提供了一種有前途的、多功能的分子探針。

靶向；載藥；納米粒；相變；顯影；裸鼠

現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展使人類平均生存年齡不斷提高，而同時惡性腫瘤的發(fā)病率也急驟增高，人類健康仍受到嚴重威脅。分子影像學的應用為腫瘤的早期診斷和治療提供了有效路徑?；诔曃⑴莸某暦肿佑跋駥W，不僅具備超聲固有的無創(chuàng)、價廉、穿透性強及顯影分辨力高的優(yōu)點，而且還能利用超聲靶向破壞微泡釋藥。其中，相變納米粒超聲造影劑被認為是較有希望取代普通微泡的新型造影劑［1］。然而，目前對其的研究多局限于體外實驗，鮮見載藥相變納米粒的體內實驗研究。本實驗在前期制備載藥相變納米粒的研究［2－3］基礎上，將其用于體內靶向顯影，驗證其體內靶向腫瘤的能力，進一步驗證其體內增強超聲顯影能力。

材料與方法

一、主要試劑與設備

1．主要試劑：制作葉酸受體靶向的、載紫杉醇的相變納米粒造影劑（FR－PTX－PNPCA）的脂質殼材，磷脂酰膽堿（DPPC）、偶聯(lián)葉酸的磷脂酰乙醇胺［DSPE（PEG）Folate］、普通磷脂酰乙醇胺（DSPE）、甘油磷脂（DPPG，美國Avanti公司）、泊洛沙姆（PF68）、膽固醇（CH，美國Sigma公司）；相變材料為液態(tài)氟碳（PFH，法國Elf Atochem公司）；包載藥物為紫杉醇（PTX，上?？道噬锟萍迹?/p>

2．主要設備：制備FR－PTX－PNPCA的RE－52A型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化），I25型高速分散均質機（德國IKN公司），Vcx－130型超聲破碎儀（美國Sonic公司），用于檢測載藥性能的高效液相色譜儀，用于超聲顯影的MyLab 90超聲診斷儀（意大利百勝公司），用于體內熒光顯影的IVIS Lumina XR小動物活體熒光成像系統(tǒng)（美國Calipers公司）。

二、FR－PTX－PNPCA的制備和性質檢測

1.制備：參照文獻［2－3］，將脂質殼材和PTX按比例（質量比3∶1）使用氯仿溶解，經過成膜、水合，加入相變材料，乳化后得到乳白色的乳劑FR－PTX－PNPCA，若成膜材料中用普通DSPE取代DSPE（PEG）Folate，即制得普通非靶向相變乳劑PTX－PNPCA。在成膜過程中加入少許紅色熒光染料DiI制備出含紅色熒光物質的納米粒乳劑。

2.性質檢測：將上述制備好的乳液稀釋后在光鏡下觀察其形態(tài)及分布，并將樣本送至重慶大學生物工程學院檢測其粒徑、電位及濃度。將樣品交重慶醫(yī)科大學藥學院，采用高效液相色譜法測定FR－PTXPNPCA藥物包封率和載藥量［2］。

三、FR－PTX－PNPCA體內靶向增強腫瘤顯影的研究

1．建立動物模型：按照常規(guī)貼壁細胞培養(yǎng)和傳代方法，培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細胞，取對數(shù)生長的細胞，采用臀背部皮下注射的方法建立荷瘤裸鼠模型。每日觀測腫瘤的生長情況，待3～4周腫瘤長至約1．0 cm×1．0 cm× 1．0 cm時，使用超聲檢查篩選內部無明顯壞死的裸鼠進行下一步顯影實驗。

2．分組：選取建模成功的裸鼠30只，隨機等分為3組，每組各10只，分別于顯影實驗前2 h通過尾靜脈注射藥物，即生理鹽水組從尾靜脈注射生理鹽水200 μl；非靶向組從尾靜脈注射稀釋10倍的PTXPNPCA 200 μl；靶向組注射同非靶向組等量的FRPTX－PNPCA。

3．活體熒光顯影：將裸鼠送至陸軍軍醫(yī)大學（原名第三軍醫(yī)大學）小動物活體熒光顯影中心，進行第一次熒光顯影。之后在裸鼠尾靜脈注射加入熒光染料的藥物，2 h后將裸鼠用戊巴比妥鈉麻醉后分別放入顯影倉內，使用儀器對準裸鼠進行二次熒光顯影。顯影結束后采用儀器自帶軟件消除頭顱、肝臟及脾臟等的顯影部分，然后采用IPP軟件（美國Media Cybernetics公司）分析腫瘤區(qū)的顯影強度值。比較各組間熒光顯影的差異。

4．超聲顯影：熒光顯影后48 h，分別重新注射藥物2 h后將裸鼠麻醉，腫瘤浸泡于37℃恒溫脫氣水槽中，使用L5－10探頭（頻率8 MHz）對準腫瘤，采用常規(guī)模式和造影模式（MI＝0．10）觀察腫瘤的顯影情況。之后取出各組裸鼠，采用低功率治療超聲（重慶醫(yī)科大學超聲影像學研究所自制）探頭對準裸鼠腫瘤部位輻照，輻照條件為頻率1 MHz，峰值負壓1 MPa，時間10 min，脈沖模式（即探頭每發(fā)射聲波1 min，休息10 s）。最后再將裸鼠放入水槽中用同樣條件對腫瘤進行再次超聲顯影。觀察治療超聲作用前后腫瘤顯影強度的變化情況，采用IPP軟件定量強度值，比較各組間顯影強度的差異。

本實驗經我院動物實驗倫理委員會同意。

四、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 14．0統(tǒng)計軟件，所有測值以x±s表示，組間比較采用方差分析；若方差不齊，則行秩和檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、FR－PTX－PNPCA的制備與一般性質檢測

成功制備出載藥靶向相變納米粒乳液FR－PTX－PNPCA，其分散性好，約7．5×109/ml，粒徑為（325±47）nm。PTX的包封率為70．42%，載藥量為20．05%。

二、各組注射藥物前后腫瘤熒光顯影比較

注射藥物后，生理鹽水組和非靶向組中腫瘤內幾乎未見紅色熒光顯影；靶向組中腫瘤內部可見明顯的紅色熒光顯影（圖1），與生理鹽水組和非靶向組強度值比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．01），見表1。

圖1 各組注射藥物前后裸鼠臀背部腫瘤灶熒光顯影情況

表1 各組注射藥物前后腫瘤熒光顯影強度比較（x±s） U

三、各組治療超聲輻照前后腫瘤內超聲顯影強度比較

生理鹽水組和非靶向組在常規(guī)模式和造影模式下，腫瘤內部顯影強度在治療超聲輻照前后均無明顯變化。靶向組在常規(guī)模式和造影模式下，腫瘤內部顯影強度在治療超聲輻照前與生理鹽水組和非靶向組比較無明顯差異；治療超聲作用后，常規(guī)模式下靶向組顯影強度組均明顯高于生理鹽水組和非靶向組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．05），造影模式下這種差異更顯著（均P＜0．01）。見表2和圖2。

表2 各組治療超聲輻照前后常規(guī)模式與造影模式腫瘤內超聲顯影強度比較（x±s） U

圖2 各組治療超聲輻照前后體內相變增強超聲顯影腫瘤情況（圖左為常規(guī)模式；圖右為造影模式）

討論

腫瘤的分子影像學融合了分子生物化學技術、納米技術、醫(yī)學圖像及數(shù)據(jù)處理等技術，針對腫瘤進行診治。而高特異性分子探針的研發(fā)是影響分子影像學發(fā)展的關鍵因素之一。普通微泡造影劑最早用于超聲分子影像學的分子探針，但其卻存在一系列的缺陷，如微泡粒徑大，不容易穿透血管內皮間隙；性質不穩(wěn)定，存留時間短；靶向性能差，載藥能力不高，治療效果差等。隨著納米技術的發(fā)展，各種靶向的、納米級的微泡相繼出現(xiàn)，但是，仍存在靶點選擇缺乏特異性、納米級微泡制作工藝復雜，以及諧波信號弱導致的超聲顯影效果差等不足。但腫瘤細胞的生長需要獲取大量能量，因此葉酸受體在多數(shù)腫瘤內高表達［4］，為此本實驗課題組從2006年起就選擇葉酸受體作為靶點，將造影劑經葉酸修飾取得了較好的腫瘤細胞靶向效果［3，5］。本實驗選擇的制備相變超聲造影劑的方法已經文獻［3-4］證實可成功制備出葉酸受體靶向的、載藥的相變納米粒超聲造影劑，該方法解決了以往納米微泡的缺陷；前期研究［6］也已證實其體外靶向和相變增強超聲顯影的能力。因此，本實驗以高表達葉酸受體的卵巢癌為模型，進一步研究造影劑在體內的靶向能力及相變增強超聲顯影的能力。

目前，腫瘤的超聲分子探針研究在國內各中心廣泛開展，也取得了一定的成果。但是，研究多集中于各種造影劑靶向腫瘤血管內皮［7］，或者在體外靶向腫瘤細胞［8］，真正采用靜脈注射后靶向顯影腫瘤的文獻［3，9］報道較少。本實驗通過設計兩方面的實驗來驗證造影劑體內靶向顯影腫瘤的能力。首先采用的是活體熒光顯像，其采用的Calipers成像系統(tǒng)穿透力較強，信噪比高，能獲得滿意的顯像效果。在濾除內臟的顯影后，能精確地顯示腫瘤區(qū)域的顯影情況。結果表明，靶向組裸鼠腫瘤內可見明顯的紅色熒光顯影，而非靶向組和生理鹽水組均未見腫瘤增強顯影，證明FR－PTX－PNPCA能較好地靶向腫瘤細胞，并停留在腫瘤組織內；雖然已有文獻［2-3，9］報道實體瘤的高通透性和滯留效應（即EPR效應）會導致納米粒存留于腫瘤內，但本實驗中非靶向組腫瘤內卻未見到熒光顯影，分析原因可能與本實驗制備的納米粒粒徑相對大，被動存留在腫瘤內的納米粒量較少有關。本實驗選擇注射藥物后2 h來進行觀察，其目的是給予足夠的時間，使造影劑能夠穿透血管內皮到達腫瘤細胞周圍，達到靶向目的，也使黏附于腫瘤血管或者停留于血管內的造影劑清除，避免干擾實驗結果。本實驗僅在一個時間點對腫瘤進行了熒光顯影，主要是為了證明納米粒在活體內對腫瘤的靶向能力，今后實驗將采取不同時間點來顯影，以確定最佳的靶向時間。

在上述基礎上，本實驗又探討了FR－PTX－PNPCA體內相變增強超聲顯影的能力。采用了治療超聲激發(fā)的方式來促進相變納米粒的相變，使用超聲在常規(guī)和造影模式分別顯影。結果表明，靶向組的納米粒能較好地靶向于腫瘤內，從而在治療超聲作用后相變產生超聲微泡，最終增強超聲顯影；而非靶向組與生理鹽水組在治療超聲作用前后卻無顯著的變化。本實驗總結既往研究［3，5］經驗發(fā)現(xiàn)，治療超聲采取的是固定的參數(shù)，既保證了納米粒發(fā)生液－氣相變的峰值負壓，又給予了足夠的時間以產生更多的微氣泡。

綜上所述，本實驗制備的FR－PTX－PNPCA能夠較好地靶向于腫瘤內，且在超聲激發(fā)下發(fā)生相變，在腫瘤原位產生微泡增強超聲顯影，為之后的腫瘤內靶向釋藥奠定了實踐基礎。

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Study on targeted imaging of tumors by folic acid modified drug-loaded phase transition nanoparticles

YE Ming，ZHAI Bei，LIU Ying，CHEN Changyu，LI Ao，ZHOU Yang
Department of Ultrasound，the Third People’s Hospital of Chengdu，Chengdu 610031，China

Objective To explore the performance of folate receptor-targeted（FR），paclitaxel（PTX）loaded phase transition nanoparticle contrast agent（FR-PTX-PNPCA）in imaging xenograft in nude mice.Methods The FR-PTX-PNPCA emulsions and non-targeted phase change nanoparticle emulsions（PTX-PNPCA）were prepared.Then 30 nude mice with xenograft ovarian cancer were randomly divided into normal saline group，non-targeted group and targeted group according to different injection.The fluorescence imaging of nude mice was performed before and after the injection.The mice were re-injected with drug 48 h after the fluorescence imaging，and 2 h later the tumors were irradiated with therapeutic ultrasound for 10 min，then the ultrasonography of tumor was re-performed.Meanwhile，the ultrasound intensity of all images was measured by software.And the differences in the intensity among groups were compared to summarize the ability of FR-PTX-PNPCA to image the tumor in vivo.Results There was hardly any fluorescence in tumors area in the saline group and non-targeted group after the injection，in contrast，obvious red fluorescence was observed in targeted group.In ultrasound imaging experiment，there was no significant difference in intensity among three group before the irradiation of therapeutic ultrasound.However，after the irradiation，the intensity in targeted group was（383.65±32.05）U，which was significantly higher than that in saline group and non-targeted group［（86.78±7.74）U，（81.86±11.98）U］in contrast mode，there were difference（all P<0.01），and there were significant difference intraditional mode（all P<0.05）.Conclusion Intravenous injection of FR-PTX-PNPCA can target to the xenograft tumor of nude mice and significantly enhance the ultrasound imaging.It provides a promising and multi-functional molecular probe for the precise medical care of the tumor.

Targeted；Drug loaded；Nanoparticle；Phase transition；Imaging；Nude mouse

R-332

A

2017－05－08）

國家自然基金青年基金項目（81401433，81401427）；四川省衛(wèi)計委課題（130417）

610031 成都市第三人民醫(yī)院超聲科（葉鳴、翟蓓、劉瑩、陳昶宇、周洋）；南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院超聲科（李奧）

周洋，Email：hansenzy＠126．com