人Müller細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)脂多糖刺激視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響△

章淑杰 張榮 張雪瑾 吳繼紅

·基礎(chǔ)研究·

人Müller細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)脂多糖刺激視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響△

章淑杰 張榮 張雪瑾 吳繼紅

目的研究人原代Müller細(xì)胞來(lái)源的外泌體(EXO)對(duì)脂多糖(LPS)刺激人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響。方法原代純化培養(yǎng)人Müller和RPE細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光鑒定RPE細(xì)胞，用試劑盒提取得到Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO并通過(guò)透射電鏡觀察和Western印跡法進(jìn)行鑒定。在無(wú)EXO培養(yǎng)基培養(yǎng)人RPE細(xì)胞后，分別采用100 ng/mL LPS刺激，不加或加入EXO(50 μg/mL)，以不含EXO和LPS培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照組，分別通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定和實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)研究RPE細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的變化。結(jié)果人Müller細(xì)胞來(lái)源的提取物經(jīng)透射電鏡觀察為圓形或半圓形囊泡，直徑為30～100 nm，表達(dá)EXO特有標(biāo)志物CD63和Flotillin-1。LPS組上清液中白介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的濃度分別為(333.89±41.51)、(404.67±13.88)、(1 557.11±317.08)、(466.78±39.34)μg/mL，EXO+LPS組分別為(214.11±18.14)、(318.12±34.73)、(1 170.37±244.15)、(319.73±41.39)μg/mL，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-1β：P<0.01；IL-6、IL-8：P<0.05；TNF-α：P<0.001)。與LPS組相比，EXO+LPS組的相關(guān)基因表達(dá)受到抑制，其中IL-1β基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-8、CCL20和TNF-α差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，CCL2與IL-6則組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論成功獲得Müller來(lái)源的EXO，其對(duì)LPS刺激RPE細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子具有一定的調(diào)節(jié)作用。(中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2017，17：323-327)

外泌體；視網(wǎng)膜色素上皮；炎癥因子

葡萄膜炎是一種自身免疫性和(或)自身炎癥反應(yīng)性疾病，是常見的眼科疾病[1-2]。視網(wǎng)膜局部炎癥及免疫反應(yīng)的失控與葡萄膜炎的發(fā)生互為因果、相互促進(jìn)，現(xiàn)在臨床上采用的諸多治療策略都旨在打破這一惡性循環(huán)。在其發(fā)病機(jī)制中，視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)的免疫穩(wěn)態(tài)維持作用損傷起到了重要作用[3-4]。近來(lái)研究[5-6]表明，葡萄膜炎是視網(wǎng)膜細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用的結(jié)果，Müller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜主要的膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)葡萄膜炎的免疫病理學(xué)和視網(wǎng)膜生理學(xué)功能的調(diào)節(jié)具有重要作用。

外泌體(exosomes, EXO)是Johnstone等[7]于1987年研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)被首次發(fā)現(xiàn)，其直徑為30～100 nm，密度為1.13～1.19 g/mL，是由脂質(zhì)雙分子層包裹的囊泡結(jié)構(gòu)。隨后發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞(B細(xì)胞、T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞等)都可以產(chǎn)生EXO，其廣泛存在于人體體液中[8-9]。根據(jù)細(xì)胞來(lái)源的不同，EXO有著不同的功能，其中包括免疫調(diào)節(jié)功能[10]。

目前廣泛使用的內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis, EIU)動(dòng)物模型與細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞因子等因素相關(guān), 具有炎癥發(fā)生速度快、病程短、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性和穩(wěn)定性較好、易于觀察等特點(diǎn), 是一種研究葡萄膜炎發(fā)病機(jī)制及其預(yù)防、治療等的較好動(dòng)物模型, 受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[11]?；诖四Ｐ脱芯康囊恍┟庖忒煼ㄒ呀?jīng)用于臨床葡萄膜炎治療。此次研究中，我們采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激RPE細(xì)胞模擬EIU模型，提取并鑒定人Müller細(xì)胞分泌的EXO，但其是否對(duì)RPE細(xì)胞的免疫穩(wěn)態(tài)具有一定的調(diào)節(jié)作用還不清楚。本研究主要探討人Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO對(duì)LPS刺激RPE細(xì)胞模擬EIU模型中RPE細(xì)胞分泌炎癥因子的影響，以期找到對(duì)其免疫學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用，為葡萄膜炎治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco，美國(guó))、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；Gibco，美國(guó))、胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))、D-Hanks液(Gibco，美國(guó))、BCA法蛋白測(cè)定試劑盒(海門碧云天，中國(guó))、ExoQuick-TCEXO提取試劑盒(SBI，美國(guó))、兔抗-CD63(Abcam，美國(guó))、兔抗-Flotillin-1(Abcam，美國(guó))、鼠抗-actin(Abcam，美國(guó))、鼠抗-RPE65(Novus Biologicals，美國(guó))、羊抗兔二抗和驢抗鼠二抗(Abcam，美國(guó))、熒光二抗(Invitrogen，美國(guó))、hoechst33258(Invitrogen，美國(guó))、ECL發(fā)光液(Thermo，美國(guó))、LPS(E.coli，O111:B3)(Sigma-Aldrich，美國(guó))、白細(xì)胞介素1β (interleukin-1β, IL-1β)、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)試劑盒(eBioscience，美國(guó))、實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcriptional polymerase chain reaction, RT-PCR)引物由生工合成(表1)、0.22 μm過(guò)濾器(Millpore，德國(guó))、H-7650透射電子顯微鏡(Hitachi，日本)、化學(xué)發(fā)光成像分析儀(Kodak，美國(guó))、SP8共聚焦熒光顯微鏡(Leika，德國(guó))、Synergy H1全自動(dòng)微孔板檢測(cè)儀(Biotek，美國(guó))、ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 原代RPE細(xì)胞純化培養(yǎng) 取本院眼庫(kù)的捐獻(xiàn)眼球，用剪刀在角鞏膜緣后5 mm開始，環(huán)形去除虹膜和晶狀體，剪除眼球前節(jié)；然后把眼球的視神經(jīng)提起，使得眼前節(jié)向下；將玻璃體從環(huán)口中脫下，用鑷子反復(fù)夾去玻璃體，整個(gè)玻璃體連同基底部視網(wǎng)膜會(huì)同時(shí)脫下來(lái)，將松動(dòng)的視網(wǎng)膜從視神經(jīng)根部剪除干凈。RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜(RPE面置上)平鋪于D-Hanks液，表面滴加0.25%胰蛋白酶，37 ℃繼續(xù)消化30 min；隨后用含血清的DMEM-F12培養(yǎng)液終止，經(jīng)移液器輕輕吹打，使RPE細(xì)胞脫落，離心細(xì)胞懸液(1 000轉(zhuǎn)/min，5 min)，棄去上清液。以2.5×104/mL密度接種于培養(yǎng)瓶。隨后顯微鏡下觀察RPE原代細(xì)胞，其為大小不一、內(nèi)含較多色素顆粒的圓形細(xì)胞。原代細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后3 d，增殖速度明顯加快，至4～5 d即可基本融合。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)色素顆粒則隨傳代次數(shù)增多而逐漸減少。

1.2.2 原代RPE細(xì)胞鑒定 取2～3代培養(yǎng)人RPE細(xì)胞，按照5×103/mL接種于提前放置2 cm×2 cm載玻片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3～5 d，取出載玻片進(jìn)行免疫熒光鑒定。先用4%冷的多聚甲醛固定10 min后，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)洗3遍。隨后用0.2%Triton X-100通透10 min，PBS洗3遍。采用與二抗相同宿主的血清封閉30 min，PBS洗3遍。一抗4℃濕盒內(nèi)過(guò)夜，PBS洗3遍。二抗置室溫2 h(避光)，PBS洗3遍。最好用4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI)染核3 min，PBS洗3遍后，封片直接照熒光。

1.2.3 人Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO提取 傳代生長(zhǎng)的人Müller細(xì)胞，長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底板面積的60%左右，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次；加入新的無(wú)血清DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，收集條件培養(yǎng)基10 mL，離心棄沉淀物后，使用22 μm 微孔濾膜(Millipore)過(guò)濾2次。用ExoQuick-TC(SBI)試劑盒法從人Müller細(xì)胞培養(yǎng)上清液分離出EXO，并用透射電鏡觀察其形態(tài)特征。

1.2.4 EXO鑒定 將抽提到的EXO，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，隨后通過(guò)Western印跡法進(jìn)行EXO特異性抗原分子CD63和Flotillin-1鑒定。

1.2.5 人原代 RPE細(xì)胞的培養(yǎng)及處理 取人原代RPE細(xì)胞，以含1.5 g/L 碳酸氫鈉、15% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d傳代1次。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3代細(xì)胞隨機(jī)分3組：空白對(duì)照組(培養(yǎng)基中不含LPS)，LPS組(培養(yǎng)基中含LPS 100 ng/mL)和EXO+LPS組(培養(yǎng)基中含LPS 100 ng/mL、EXO 50 μg/mL)。各實(shí)驗(yàn)組以去EXO血清培養(yǎng)RPE細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞上清液，ELISA檢測(cè)炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α蛋白濃度。收集細(xì)胞，抽提mRNA，反轉(zhuǎn)錄后通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)IL-1β、IL-8、CCL2、CCL20、 IL-6、TNF-α和GAPDH基因表達(dá)變化。

1.2.6 ELISA檢測(cè)炎癥因子的蛋白 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α蛋白濃度。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中均使用去熱源的耗材。

1.2.7 RT-PCR方法檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá) 按照Takara試劑盒說(shuō)明書，收集細(xì)胞，抽提mRNA，反轉(zhuǎn)錄后通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)IL-1β、IL-8、CCL2、CCL20、IL-6、TNF-a和GAPDH等基因表達(dá)變化。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中均使用去熱源的耗材(引物序列見表1)。

表1 用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)的引物序列

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，RT-PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt的計(jì)算方式進(jìn)行運(yùn)算，所有數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 人原代RPE細(xì)胞鑒定結(jié)果 人原代RPE細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志性蛋白R(shí)PE-65(圖1)。

圖1. 人原代RPE細(xì)胞免疫熒光結(jié)果 純化得到的P3代人RPE細(xì)胞表達(dá)特異性標(biāo)志物RPE-65(×400)

2.2 EXO形態(tài)特征 透射電鏡下，人原代Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO呈圓形或者橢圓形，直徑為30～100 nm，具有囊泡樣特征(圖2)。

2.3 EXO標(biāo)志物CD63以及Flotillin-1蛋白表達(dá)情況 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人原代Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO表達(dá)CD63以及Flotillin-1蛋白，而新鮮培養(yǎng)基中(即空白對(duì)照組)不表達(dá)(圖3)。

2.4 人Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO對(duì)RPE細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 各實(shí)驗(yàn)組上清液檢測(cè)結(jié)果顯示：LPS組上清液中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的濃度為(333.89±41.51)、(404.67±13.88)、(1 557.11±317.08)、(466.78±39.34)μg/mL，EXO+LPS組為(214.11±18.14)、(318.12±34.73)、(1 170.37±244.15)、(319.73±41.39)μg/mL，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-1β：P<0.01；IL-6、IL-8：P<0.05；TNF-α：P<0.001)。與LPS組相比，EXO+LPS組產(chǎn)生的炎癥因子明顯下調(diào)，表明人Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO對(duì)LPS刺激的RPE細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子具有一定的抑制作用，可以減少炎性因子的產(chǎn)生(圖4)。

圖2. 透射電鏡觀察：EXO形態(tài)為典型的圓形或橢圓形，直徑為30～100 nm

圖3. 人原代Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO表達(dá)CD63以及Flotillin-1蛋白

圖4. EXO作用于經(jīng)LPS刺激的人RPE細(xì)胞24 h后，上清液中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的濃度變化 組間相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001

2.5 人Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO對(duì)RPE細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平的影響 各實(shí)驗(yàn)組抽提mRNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，應(yīng)用生工合成引物(表1)，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)分析結(jié)果顯示：與LPS組相比，EXO+LPS組的相關(guān)基因表達(dá)受到抑制，其中IL-1β基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-8、CCL20和TNF-a差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，CCL2與IL-6則組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明人Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO對(duì)LPS刺激RPE細(xì)胞的活化和基因表達(dá)具有一定的抑制作用，同時(shí)對(duì)活化指標(biāo)CCL2、CCL20的表達(dá)也有一定的調(diào)節(jié)作用(圖5)。

圖5. EXO作用于經(jīng)LPS刺激的人RPE細(xì)胞24 h后相關(guān)基因的表達(dá)變化 組間相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討論

在葡萄膜炎發(fā)病機(jī)制中，視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞以及相互免疫應(yīng)答在其中起到一定的作用，RPE細(xì)胞為視網(wǎng)膜10層結(jié)構(gòu)中的最外層，具有視細(xì)胞外節(jié)的吞噬和消化，脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜屏障及營(yíng)養(yǎng)、代謝產(chǎn)物的輸送，黑色素的合成及過(guò)氧化脂質(zhì)的生成、泵與黏著作用，維生素A的代謝，自我維持等多種生理功能。RPE細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，包括IL-1、IL-6、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)、核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)因子1(RFT-1)、纖維蛋白相關(guān)抗原(FRa)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、TNF-α、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)等，在RPE細(xì)胞參與的多種疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。此外，RPE細(xì)胞具有重要的免疫學(xué)表型和功能，例如表達(dá)Toll樣受體、補(bǔ)體成分、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子，能誘導(dǎo)表達(dá)HLA-Ⅱ類抗原，并且還能產(chǎn)生許多促炎性的細(xì)胞因子。在視網(wǎng)膜炎病理進(jìn)程中，RPE細(xì)胞的激活損傷起到了重要作用[13-15]。視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜中的主要膠質(zhì)細(xì)胞，在整個(gè)葡萄膜炎的免疫病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。我們的研究旨在進(jìn)一步探討Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO對(duì)LPS刺激RPE細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響，著眼Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO對(duì)RPE的激活以及分泌炎癥相關(guān)因子的能力研究。經(jīng)過(guò)人原代RPE細(xì)胞的純化培養(yǎng)和鑒定，我們采用第3代RPE細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且通過(guò)免疫熒光發(fā)現(xiàn)3代之內(nèi)的RPE細(xì)胞均呈RPE-65陽(yáng)性。

相關(guān)研究報(bào)道，EXO可攜帶多種微小RNA及蛋白活性因子在細(xì)胞間穩(wěn)定存在并傳遞信息，對(duì)疾病的生理、病理過(guò)程發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[16]，越來(lái)越多的研究表明EXO具有調(diào)控炎癥的作用；但是有關(guān)EXO影響RPE細(xì)胞活化以及分泌炎癥因子的研究目前暫未見報(bào)道。我們的研究結(jié)果顯示，成功獲取的Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO作用于LPS刺激的RPE細(xì)胞24 h后，可以顯著抑制IL-1β、 IL-6、IL-8和TNF-α蛋白的分泌，與LPS組相比，EXO+LPS組產(chǎn)生的炎癥因子明顯減少。與LPS組相比，EXO+LPS組的炎癥和RPE細(xì)胞活化相關(guān)的基因表達(dá)均受到一定的抑制，表明人Müller細(xì)胞來(lái)源的EXO對(duì)LPS刺激RPE細(xì)胞的炎癥和細(xì)胞活化基因表達(dá)具有一定的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于為臨床干擾視網(wǎng)膜炎癥病理生理過(guò)程中，炎性細(xì)胞因子分泌失調(diào)的研究提供新的線索。在我們的后續(xù)研究中，將進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制。

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EffectofexosomesderivedfromhumanMüllercellsonsecretionofinflammatoryfactorsfromretinalpigmentepitheliumcellsinducedbylipopolysaccharide

ZHANGShu-jie,ZHANGRong,ZHANGXue-jin,WUJi-hong.

EyeInstitute,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

WU Ji-hong, Email: jihongwu@fudan.edu.cn

ObjectiveTo study the effect of exosomes(EXO) derived from primary human Müller cells on lipopolysaccharide (LPS) stimulating human retinal pigment epithelium (RPE) cells to produce inflammatory factors.MethodsExosomes extracted from primarily cultured and purified Müller cells by kit were observed by transmission electron microscopy (TEM) and appraised by Western blot. Human primary RPE cells were identified by using immunofluorescence(IF). Human RPE cells were cultured with or without EXO (50 μg/mL) after LPS(100 ng/mL) stimulation, without EXO and LPS as the control group. Inflammatory cytokines produced by RPE cells were detected by using enzyme-linked immunosorbent assay and real-time polymerase chain reaction.ResultsCircular or semicircular vesicles were observed by TEM, and the diameters were 30～100 nm. The specific markers CD63 and Flotillin-1 were detected in the EXO. The concentrations of interleukin-1β (IL-1β), IL-6、IL-8 and tumor necrosis factor-α(TNF-α) in the supernatant of LPS group [(333.89±41.51), (404.67±13.88), (1 557.11±317.08), (466.78±39.34) pg/mL] and EXO+LPS group [(214.11±18.14), (318.12±34.73), (1 170.37±244.15), (319.73±41.39) pg/mL] were compared and the differences were significant respectively (IL-1β:P<0.01; IL-6, IL-8:P<0.05; TNF-α:P<0.001). Compared with LPS group, the related gene expression was inhibited in EXO+LPS group. IL-1β gene differentially expressed significantly (P<0.05), IL-8, CCL20 and TNF-α genes were significantly different (P<0.001), while CCL2 and IL-6 genes were not significantly different between the two groups (P>0.05).ConclusionsEXO were derived from Müller cells successfully. EXO from Müller cells has effect on LPS stimulating RPE cells to produce inflammatory factors. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:323-327)

Exosomes; Retinal pigment epithelium; Inflammatory factors

△國(guó)家自然科學(xué)基金(81200675,81470624)

2016-12-22)

(本文編輯 諸靜英)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科研究院 上海視覺(jué)損傷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 衛(wèi)生部近視眼重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200031

吳繼紅(Email: jihongwu@fudan.edu.cn)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.05.004