AML1/ETO陽性急性髓系白血病分子生物學(xué)特性的分析

梁楚嘉　李俊勛

[摘要] 目的 分析AML1/ETO陽性急性髓系白血病AML患者的分子生物學(xué)和臨床特性，探討治療策略。方法 方便選取該院于2011年12月—2016年12月收治的55例AML1/ETO陽性的AML患者的臨床特征、形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、以及治療、生存情況進(jìn)行分析總結(jié)。結(jié)果 55例AML1/ETO陽性的AML患者中，白細(xì)胞大于10×109/L的30例（55%），髓外浸潤9例（16%）；14例表達(dá)CD19（25%），31例表達(dá)CD56（56%）；46例患者進(jìn)行了誘導(dǎo)化療，首次化療CR率為71.7%，二次化療CR率94.2%，6例死亡；55例骨髓片均有異常中性中幼粒細(xì)胞；骨髓中異常中性中幼粒細(xì)胞比例（30.567±17.33）%大于原始粒細(xì)胞，而外周血中則原始粒細(xì)胞比例（16.10±13.35）%高于異常中性中幼粒細(xì)胞比例。結(jié)論 AML1/ETO陽性AML患者易并發(fā)高危因素，明確影響預(yù)后的因素，對指導(dǎo)臨床治療和改善AML1/ETO陽性AML患者的生存有重要的意義。

[關(guān)鍵詞] AML1/ETO陽性AML；形態(tài)學(xué)特征；預(yù)后因素

[中圖分類號] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）07（a）-0016-04

Analysis of AML1/ETO Positive Acute Myeloid Leukemia Molecular Biological Characteristics

LIANG Chu-jia， LI Jun-xun

First Affiliated Hospital of Zhongshan University， Guangzhou， Guangdong Province， 510080 China

[Abstract] Objective To analyze the AML1/ETO positive acute myeloid leukemia molecular biological characteristics and study the treatment strategies. Methods Convenient selection 55 cases of AML patients with positive AML1/ETO admitted and treated in our hospital from December 2011 to December 2016 were selected and the clinical features， morphology and immunology， treatment and survival situations were analyzed and summarized. Results Of 55 cases， there were 30 cases whose leukocyte was more than 10×109/L （55%）， 9 cases with extramedullary infiltration （16%）， 14 cases with CD19 expression （25%） and 31 cases with CD56 expression （56%）， and 46 cases underwent the induced chemotherapy， and the first chemotherapy CR rate and second chemotherapy CR rate were respectively 71.7% and 94.2%， and 6 cases died， and there were abnormal neutrophilic granulocytes in 55 cases of bone marrow smears， and the ratio of abnormal neutrophilic granulocytes in bones was （30.567±17.33）%， which was bigger than that of myeloblast， and the ratio of myeloblast ratio in the peripheral blood was （16.10±13.35）%， which was higher than that of abnormal neutrophilic granulocytes. Conclusion The AML patients with positive AML1/ETO are easy to be complicated by high-risk factors， and we should clear the prognosis influence factors， and it is of important significance to guiding the clinical treatment and improving the survival situation of them.

[Key words] AML patients with positive AML1/ETO； Morphological characteristics； Prognosis factors

AML1/ETO陽性是AML常見的融合基因，AML-M2（FAB分型）在臨床上最為常見，其發(fā)病原因主要是由于t（8；21）（q22；q22）累及8號染色體上的ETO基因和21號染色體上的AML1基因易位導(dǎo)致AML1/ETO病變發(fā)生[1]。文獻(xiàn)普遍描述伴有AML1/ETO陽性的AML預(yù)后良好，但影響AML1/ETO預(yù)后的因素較多，除髓外侵犯、附加核型異常等因素影響外，臨床通過研究發(fā)現(xiàn)，分子生物學(xué)異常也是導(dǎo)致該疾病發(fā)生的高危因素。該文方便選取中山一院在2011年12月—2016年12月期間收治的55例AML1/ETO陽性的AML患者為研究對象，并通過分析其臨床特征，探究AML1/ETO陽性急性髓系白血病疾病的分子生物學(xué)和臨床特性，并探討治療策略，現(xiàn)報道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取中山一院初診AML1/ETO陽性的AML患者共67例為研究對象，回顧性分析患者的臨床資料，其中12例資料不全，余55例納入統(tǒng)計。55例中男性37例，女性18例，年齡中位數(shù)31（3～77）歲。55例中按FAB分型49例為M2（89.1%），3例M5b（5.5%），M1，MDS，M4a各1例（1.8%）。

1.2 分析方法

1.2.1 形態(tài)染色體分析法 從患者骼前或髂后上棘抽取約0.2 mL骨髓液進(jìn)行涂片制成樣本（涂5～8張），并分析其細(xì)胞化學(xué)及形態(tài)學(xué)染色，然后采用抗凝管抽取1 mL肝素用于FISH融合基因檢查，1～2 mL用于流式分型。按FAB分類骨髓細(xì)胞形態(tài)， 細(xì)胞化學(xué)染色包括：過氧化物酶染色（P0X）、堿性磷酸酶（NAP）、特異性酯酶染色（CE）、非特異性酯酶染色（NAE）及氟化鈉（NaF）抑制試驗(yàn)、丁酸萘酚酯酶染色（NBE）。

回顧分析每例病例骨髓片異常中性中幼粒和原始細(xì)胞比例（200個有核細(xì)胞）；分析100個異常中性中幼粒細(xì)胞，報告多核仁（大于3個），有空泡，粗顆粒（顆粒比比可見細(xì)顆粒大2～3倍），核折疊，有偽足及胞漿中含Auer小體的異常中性中幼粒細(xì)胞比例；報告外周血片原始粒細(xì)胞和異常中性中幼粒細(xì)胞比例。

1.2.2 免疫分型檢測法 按照中山一院流式細(xì)胞室常規(guī)采用活細(xì)胞間接熒光標(biāo)記稱之為免疫分型檢測法，細(xì)胞檢測采用美國BD公司生產(chǎn)的6色流式細(xì)胞儀（機(jī)型為BD FACSCanto II）進(jìn)行檢測。

1.2.3 融合基因檢測法 利用AML1/ETO探針（光譜綠色直接標(biāo)記AML1，光譜橘紅直接標(biāo)記ETO）取患者肝素抗凝骨髓2～3 mL，并作離心處理，轉(zhuǎn)速為2 500 r/min，持續(xù)8 min后加0.075MKCI溶液5～10 mL放置30 min；再取1 mL甲醇：冰乙酸-3∶1制成的固定液吹打混勻和離心1 800 r/min，同樣持續(xù)8 min去上清液；最后取6 mL固定液去上清液，所有工序重復(fù)3次。將所得的液體進(jìn)行涂片制成樣本，并依次放入到濃度為70%、85%、100%乙醇或2XSCC（pH=7.0）中浸泡，2 min后取出樣本并作脫水處理，再利用18×18蓋玻片將樣本封片并膠封，膠封后為使樣本變性需將其放置在75°C的熱臺上烘烤，烘烤后再放入37°C培育箱進(jìn)行培育雜交，培育過程一般為12 h，培育雜交完成后去除蓋玻片，并將樣本放入到72°C0.4Xssc/NP-40（pH=7.0）溶液中浸泡2 min，或放入濃度為0.05%的Tween-20溶液（pH=7.0）中浸泡30 s，最后取出晾干加蓋玻片，放置在10 uL DAP lantifad的暗視野熒光顯微鏡觀察細(xì)胞分子狀態(tài)。

檢測結(jié)果判斷：雜交信號檢查采用配有DAPI/TRITC/FITC三色激發(fā)塊的O-lympusBX51熒光顯微鏡，照相采用Olympus PM30顯微照相機(jī)進(jìn)行，每個樣本觀察500個間期細(xì)胞。若熒光顯微鏡出現(xiàn)2橘紅2綠色分散熒光信號則說明細(xì)胞間期正常，若出現(xiàn)2黃色1橘紅1綠色信號則表明細(xì)胞呈AML1/ETO陽性。

1.2.4 隨訪 根據(jù)患者的門診及住院病例資料對患者進(jìn)行隨訪，隨訪日期從患者確診之日起算，隨訪結(jié)束時間為2016年12月31日，若在此期間患者出現(xiàn)死亡，則隨訪結(jié)束時間為患者死亡日期。隨訪期間應(yīng)詳細(xì)記錄患者的臨床特征和改善情況。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析所得數(shù)據(jù)。用 Kaplan-Meier方法分析患者生存期。采用 Cox回歸法分析多因素并找出對患者總體生存生存期有顯著影響的相關(guān)危險因素。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

55例患者初診時有37例表現(xiàn)為乏力、面色蒼白等貧血癥狀，9例有基礎(chǔ)疾病，4例為體檢發(fā)現(xiàn)，5例有出血癥狀。30例WBC>10×109（55%），25例<10×109（45%），41例LDH升高（75%），18例AST升高（30%），17例ALT升高（30%）。出現(xiàn)發(fā)熱癥狀28例，出現(xiàn)鼻牙齦皮膚黏膜等出血現(xiàn)象13例，3例患者出現(xiàn)肝脾淋巴結(jié)腫大，髓外浸潤9例（16%），包括綠色肉瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病的4例（7%），9例未化療，化療的46例中，首次化療CR率為71.7%，二次化療CR率94.2%，低于文獻(xiàn)報道。6例死亡。

2.2 形態(tài)學(xué)特征

2.2.1 原始數(shù)據(jù) 55例患者中，有47例患者骨髓有Auer小體出現(xiàn)（85%），7例未發(fā)現(xiàn)Auer小體，該次統(tǒng)計中，除MDS外，其它類型白血病均有Ruer出現(xiàn)；異常中性中幼粒細(xì)胞在形態(tài)上可出現(xiàn)數(shù)量不等的粗顆粒，空泡和偽足，表現(xiàn)出典型的核幼質(zhì)老現(xiàn)象。見表1。

2.2.2 形態(tài)學(xué)特性分析 所有AML1/ETO陽性急性髓系白血病中均可找到異常中性中幼粒細(xì)胞（1%～71%），AML1/ETO陽性率明顯高于異常中性中幼粒細(xì)胞（表2）；AML1/ETO比例與含粗顆粒異常中性中幼粒比例之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），AML1/ETO融合基因百分比越高，含粗顆粒的異常中幼粒的比例越高；AML1/ETO比例與骨髓異常中性粒細(xì)胞比例呈正相關(guān)（r=0.79， P=0.015）；AML1/ETO的表達(dá)與年齡呈負(fù)相關(guān)（P=0.006）；外周血中，原始粒細(xì)胞比例大于異常中性中幼粒比例（P=0.002），而骨髓中異常中性中幼粒比例大于原始粒細(xì)胞比例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.026 8）；外周血PLT的量與HGB的量呈正相關(guān)（P=0.001）。

外周血原粒，HGB和PLT之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；骨髓中原始粒細(xì)胞比例、含粗顆粒中性中幼粒細(xì)胞比例、有偽足中性中幼粒比例、含空泡的中性中幼粒細(xì)胞比例之間無顯著相關(guān)；AML1/ETO比例與上述各指標(biāo)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。endprint

2.3 免疫表型

2.3.1 免疫表型的表達(dá) 常見的免疫表型：55例表達(dá)CD117、MPO，53例表達(dá)CD34，50例表達(dá)CD33和CD13，31例表達(dá)CD56，14例表達(dá)CD19，34例表達(dá)CD15，10例共表達(dá)CD19，CD56。少見表型：2例表達(dá)CD10，3例表達(dá)CD22，1例表達(dá)CD71，4例表達(dá)CD7，1例表達(dá)CD64，1例表達(dá)CD79a，1例表達(dá)CD2，2例表達(dá)CD14。

2.3.2 免疫表型的相關(guān)性 CD15的表達(dá)與CD117，CD34，AML1/ETO的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=0.76、0.68、0.71，P=0.001、0.030、0.011），CD117與CD34，AML1/ETO的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.72、0.69，P=0.0001，0.001）；CD117的表達(dá)與骨髓中原始粒細(xì)胞比例的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.76，P=0.006）。

3 討論

過去人們都認(rèn)為急性髓系白血病呈AML1/ETO陽性說明患者預(yù)后良好[2-3]，但是隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床檢測技術(shù)有了明顯提升，臨床發(fā)現(xiàn)AML1/ETO陽性急性髓系白血病患者的生存周期和治愈率并不高，且其預(yù)后效果不理想，有學(xué)者[4]指出各種族具有不同的藥物耐受性，且白血病細(xì)胞在不同種族之間存在生物學(xué)多樣性的差異等因素有關(guān)。該文對55例患者的隨訪資料進(jìn)行形態(tài)學(xué)特性分析，分析其生物學(xué)特性（包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病、肝酶學(xué)、外周血白細(xì)胞計數(shù)、免疫表型、髓外白血病）、并采用統(tǒng)計學(xué)分析其治療相關(guān)因素（獲得完全緩解時間）等影響AML1/ETO陽性急性髓系白血病患者生存期的因素。研究顯示AML1/ETO陽性急性髓系白血病患者具有一些特異性的形態(tài)學(xué)特征，其影響AML1/ETO陽性急性髓系白血病患者預(yù)后的因素[5]主要有①治療前生物學(xué)特征， 如患者的初診時中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病、白細(xì)胞計數(shù)、免疫表型等；②治療后的相關(guān)預(yù)后措施以及預(yù)后緩解所需的時間。

按FAB分型標(biāo)準(zhǔn)，按“明顯的核漿發(fā)育不平衡， 核的發(fā)育落后于胞質(zhì)， 胞質(zhì)中易見空泡， 分化差者核的凹陷處有少許中性顆粒， 分化良好者胞質(zhì)中充滿中性顆粒，有核仁”，劃人“異常中幼粒細(xì)胞”細(xì)胞形態(tài)[6]，該研究亦可見到不同程度的偽足，有85%的AML中出現(xiàn)不同程度的Ruer小體，表現(xiàn)出典型的核幼質(zhì)老現(xiàn)象，結(jié)合該次有髓外免疫表型的出現(xiàn)，如淋系的CD2、CD7、CD19、CD10、CD79a等，這種核漿發(fā)育不平衡現(xiàn)象實(shí)際是胞核，胞質(zhì)的多種蛋白形成紊亂造成的，如代表細(xì)胞發(fā)育階段的蛋白形成紊亂：代表干/祖細(xì)胞的蛋白和代表較分化細(xì)胞的蛋白共存（CD34和CD33），代表T和B細(xì)胞共存（CD56和CD19），代表不同細(xì)胞系列的蛋白共存（CD33和CD19共存）等，同時在同一細(xì)胞出現(xiàn)的系列蛋白又不能共同表達(dá)，造成了這種蛋白紊亂的現(xiàn)象[7]，亦有文獻(xiàn)認(rèn)為[8-9]，AML1/ETO與這種蛋白紊亂的現(xiàn)象有聯(lián)系。

該研究中發(fā)現(xiàn)在AML1/ETO陽性AML患者的骨髓片均可找到不同程度異常中幼粒細(xì)胞，而且AML1/ETO的表達(dá)與異常中性中幼粒細(xì)胞的量呈正相關(guān)，說明在AML1/ETO陽性AML中均可發(fā)現(xiàn)異常中性中幼粒細(xì)胞，但兩者的陽性率不同，AML1/ETO陽性率明顯高于異常中性中幼粒細(xì)胞，表明基因水平的異常比細(xì)胞水平出現(xiàn)的更早、更廣泛。另外，該次研究發(fā)現(xiàn)患者年齡越小，AML1/ETO表達(dá)的量越大，這在文獻(xiàn)中并無報道。研究發(fā)現(xiàn)，在AML1/ETO陽性AML患者的骨髓片中，異常中性中幼粒細(xì)胞比例大于原始粒細(xì)胞的比例，而在血片中，原始粒細(xì)胞的比例大于異常中性中幼粒細(xì)胞的比例的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在以往的文獻(xiàn)報道中也并未發(fā)現(xiàn)。

獲得完全緩解時間是利于預(yù)后的因素，55例患者中9例未化療，化療的46例中，首次化療CR率為71.7%，二次化療CR率94.2%，略低相關(guān)文獻(xiàn)報道96.7%[10]，可能與這表明在接受誘導(dǎo)緩解治療方案及種族間耐受性有關(guān)；多因素表明，獲得完全緩解的時間越長，患者的生存期就越長，患者的長期生存率越高。

綜上所述，AML1/ETO陽性AML形態(tài)學(xué)特征、臨床特征、生物學(xué)特性需從伴融合基因進(jìn)行分析，伴融合基因?qū)颊叩纳婢哂兄匾挠绊?，并且其為進(jìn)行分析為AML的預(yù)后評估提供了新的依據(jù)，指導(dǎo)臨床的治療，使更多患者獲得長期生存。

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（收稿日期：2017-04-07）endprint