I型鴨甲型肝炎病毒VP0基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)

王安平，顧玲玲，王永娟，吳 雙，左偉勇，洪偉鳴，朱善元

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

I型鴨甲型肝炎病毒VP0基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)

王安平，顧玲玲，王永娟，吳 雙，左偉勇，洪偉鳴，朱善元

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

為在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)I型鴨甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus type-I, DHAV-I) SH株的結(jié)構(gòu)蛋白VP0，首先根據(jù)DHAV-I SH株VP0基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，RT-PCR方法擴(kuò)增出VP0基因，亞克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1，獲得重組質(zhì)粒pFB-VP0，將其轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)抗性和藍(lán)白斑篩選，獲得重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-VP0，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，獲得重組桿狀病毒rBac-VP0。Western-blot結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白相對(duì)分子量約為29 kD，間接免疫熒光結(jié)果顯示重組蛋白能與鴨抗全病毒陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。研究結(jié)果表明，DHAV-I SH株的結(jié)構(gòu)蛋白VP0在昆蟲細(xì)胞中獲得了成功表達(dá)，為VP0結(jié)構(gòu)蛋白的功能研究和基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

I型鴨甲型肝炎病毒；VP0基因；昆蟲細(xì)胞；表達(dá)

鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是一種由鴨甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus，DHAV)感染導(dǎo)致的急性和高度致死性傳染病，可引起21日齡以下的雛鴨發(fā)生急性肝炎，病死率高達(dá)100%，是嚴(yán)重危害中國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的疾病之一。DHAV包括經(jīng)典型(即中國(guó)原Ⅰ型鴨肝炎病毒)、中國(guó)臺(tái)灣新型、韓國(guó)新型3種亞型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，3個(gè)亞型之間存在明顯的差異，無(wú)交叉免疫性[1-3]，其中Ⅰ型鴨肝炎病毒(DHAV-I)為中國(guó)的主要流行血清型[4-6]。鴨甲型肝炎病毒屬于小RNA病毒科，病毒粒子無(wú)囊膜，呈二十面體對(duì)稱，核心為單股正鏈RNA，基因組大小約為7 690 nt，只編碼一個(gè)開放閱讀框，編碼的產(chǎn)物為多聚蛋白，多聚蛋白在翻譯過(guò)程中不斷被自身編碼的蛋白酶水解，分解成P1、P2 和P3 產(chǎn)物，P1、P2和P3 又進(jìn)一步分別分解為小片段蛋白，即VP0、VP1、VP3、2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D。VP0、VP1、VP3為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。其中，VP0蛋白位于病毒粒子表面，為其主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。目前，研究主要集中于結(jié)構(gòu)蛋白VP1的功能和免疫原性研究，而對(duì)VP0的研究卻很少[7]。本研究利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)DHAV-1 SH株的VP0基因，為VP0蛋白的功能研究、診斷試劑及亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1毒株、菌株和載體

DHAV-I SH毒株由中國(guó)科學(xué)研究院上海獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本室保存；Sf9細(xì)胞、桿狀病毒Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)(包括重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1、E.coliDH10Bac 受體菌)購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2工具酶和試劑

pfuDNA Polymerase、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI購(gòu)自Fermentas公司；轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Ⅱ Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM (Serum free medium) 購(gòu)自GBICO公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記的羊抗鴨IgG購(gòu)自KPL公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中登錄的DHAV-ISH株病毒基因組序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增VP0基因，為便于基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建，在VP0引物的上下游5′端分別引入BamH I和XhoI酶切位點(diǎn)。通用引物M13F/M13R參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)設(shè)計(jì)，引物均由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為：VP0-F:5′-CGAGGATCCACCATGGATACTCTTACTAAAAAC-′3(下劃線為BamH I酶切位點(diǎn))，VP3-R: 5′-GTACTCGAGTTACTGATTGTCAAATGGTCGGGG-′3(下劃線為XhoI酶切位點(diǎn))。通用引物序列為：M13-F: 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-

′3，M13-R: 5′-CAGGAAACAGCTATGAC-′3。

1.4DHAV-I的增殖與病毒RNA的提取

取10倍稀釋的原代病毒0.2 mL接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，于37 ℃孵化箱孵化。選擇48～72 h之內(nèi)死亡的雞胚，置于4 ℃過(guò)夜，收集尿囊液。按Trizol法抽提尿囊液總RNA，操作參照說(shuō)明書。

1.5DHAV-IVP0基因的擴(kuò)增

以提取的總RNA為模板，根據(jù)Invitrogen公司的RT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，反應(yīng)程序設(shè)定為：25 ℃，10 min；42 ℃，90 min；70 ℃，10 min。 以擴(kuò)增的cDNA為模板，再進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增VP3基因。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性3 min，95 ℃變性 30 s，52 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 1.5min，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFB-VP0的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，按膠回收試劑盒說(shuō)明書回收目的基因，經(jīng)BamH I和XhoI酶切后，與經(jīng)同樣酶切的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1連接。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和重組子的篩選參照常規(guī)方法進(jìn)行[8]。重組子用BamH I 和XhoI雙酶切鑒定正確后送由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，鑒定正確的克隆命名為pFB-VP0。

1.7重組桿狀病毒穿梭載體的制備

參考Invitrogen公司的Bac-to-Bac Baculovirus Expression System使用說(shuō)明，將鑒定正確的重組質(zhì)粒pFB-VP0轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有Kan+(50 mg·L-1)/Gen+(7 mg·L-1)/Tet+(10 mg·L-1)/X-Gal(100 mg·L-1)/IPTG(40 mg·L-1)的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，直至藍(lán)白斑出現(xiàn)。隨機(jī)挑取白色菌落，分別接種于5 mL含有Kan+(50 mg·L-1)/Gen+(7 mg·L-1)/Tet+(10 mg·L-1)的LB培養(yǎng)基，37 ℃，250 r·min-1搖床培養(yǎng)過(guò)夜，堿裂法提取重組桿粒DNA。用引物M13F /M13R進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)后，72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得的陽(yáng)性重組轉(zhuǎn)座子命名為rBacmid-VP0。

1.8重組桿狀病毒rBac-VP的制備

將rBacmid-VP0和野生型Bacmid DNA參照Cellfectin II Reagent轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Sf9昆蟲細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后每隔12 h觀察一次細(xì)胞，直至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變。收集上清液，500 g 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌管中，此即為P1代rBac-VP0，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。將P1代rBac-VP0按MOI為0.1感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Sf9細(xì)胞，直至約72 h后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，收集上清即為P2代重組病毒，按此方法將病毒傳至P3代。

1.9重組蛋白的間接免疫熒光鑒定

將P3代rBac-VP0及不含目的基因的野生型桿狀病毒分別按MOI為1、5、10接種24孔板中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞，以鴨抗全病毒血清為一抗，以FITC標(biāo)記的羊抗鴨IgG為二抗，按常規(guī)方法進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)[9]。

1.10重組蛋白的Western-blot分析

將P3代rBac-VP0及不含目的基因的野生型桿狀病毒分別按MOI為1、5、10接種24孔板中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞，分別在感染后24 h、48 h、72 h收集細(xì)胞沉淀，PBS洗滌一次，于沉淀中加入5×loading buffer煮沸3 min后，取15 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析，以未接種病毒的細(xì)胞沉淀作為陰性對(duì)照。樣品電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印PVDF膜，以VP0單抗作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠作為二抗，按常規(guī)方法進(jìn)行Western-blot反應(yīng)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1VP0基因的擴(kuò)增

以VP0-F和VP0-R為上、下游引物擴(kuò)增VP0基因，產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可見大約780 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

M: DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: VP0基因擴(kuò)增產(chǎn)物。 M: 1 kb DNA ladder; 1: PCR products of VP0 genes.

2.2重組轉(zhuǎn)座載體pFB-VP0的構(gòu)建與鑒定

VP0基因回收后用BamH I和XhoI酶切，與經(jīng)同樣酶切的pFastBac1連接，獲得重組子。經(jīng)BamH I和XhoI酶切出約4 800 bp和780 bp的2條帶(圖2)，與預(yù)期相符，且DNA測(cè)序證明VP0基因克隆正確且無(wú)突變。

M: DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: pFB-VP0的BamH I+Xho I酶切鑒定 M: 1 kb DNA ladder; 1: digestion of pFB-VP0 by BamH I and Xho I

2.3重組桿狀病毒穿梭載體的鑒定

以M13F/M13R為引物對(duì)重組桿粒進(jìn)行PCR鑒定，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在約3 200 bp處有一特異性條帶，與預(yù)期片段大小相符(圖3)，表明VP0基因轉(zhuǎn)座成功。

M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: 重組桿粒rBacmid-VP0為模板。 M: 1 kb DNA ladder; 1: PCR products of rBacmid-VP0.

2.4重組桿狀病毒的收獲及感染細(xì)胞的病變

rBacmid-VP0轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Sf9細(xì)胞，5 d后可見明顯的細(xì)胞病變現(xiàn)象：細(xì)胞生長(zhǎng)停止，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒，細(xì)胞變大，有些細(xì)胞腫大而破碎，而未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞未出現(xiàn)此現(xiàn)象(圖4)。

圖4 正常Sf9細(xì)胞(A)和轉(zhuǎn)染rBacmid-VP0 5 d后的Sf9細(xì)胞(B)(×400)Fig.4 Normal Sf9 cells(A) and Sf9 cells transfected with rBacmid-VP0 after 5 d(B)( ×400)

2.5重組蛋白的間接免疫熒光檢測(cè)

為檢測(cè)重組蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)情況，將P3代rBac-VP0感染24孔板中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞，以鴨抗全病毒血清為一抗，進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示在rBac-VP0感染的Sf9細(xì)胞中出現(xiàn)特異性熒光，而野生型桿狀病毒感染組則未出現(xiàn)特異熒光(圖5)。

A: 感染重組病毒的Sf9昆蟲細(xì)胞; B: 正常Sf9昆蟲細(xì)胞。 A: Sf9 insect cells infected with recombinant virus; B: normal Sf9 insect cells.

2.6重組蛋白的Western-blot分析

為鑒定重組蛋白的大小，將P3代rBac-VP0感染后的細(xì)胞沉淀進(jìn)行western-blot分析，以VP0單抗為一抗。結(jié)果顯示在相對(duì)分子量約為29 kD處出現(xiàn)了特異性條帶，相對(duì)分子量與目的蛋白相同，而野生型桿狀病毒感染則未出現(xiàn)特異條帶(圖6)。

M: 蛋白質(zhì)marker；1：感染野生型桿狀病毒的細(xì)胞裂 解液；2：感染rBac-VP3的細(xì)胞裂解液。 M: Protein molecular weigh Marker; 1: Sf9 insect cells lysate infected with wild type baculovirus; 2: Sf9 insect cells lysate infected with rBac-VP3.

3 討論

鴨甲型肝炎病毒為無(wú)囊膜的二十面體對(duì)稱的RNA病毒，其衣殼由VP0、VP1和VP3 3種結(jié)構(gòu)蛋白組成，VP1作為其主要的保護(hù)性抗原蛋白，對(duì)于其功能的相關(guān)研究較多，而相關(guān)VP0的研究報(bào)道則較少。不同DHAV血清型之間VP1基因變化較大，而VP0則相對(duì)保守[11-12]。根據(jù)親緣關(guān)系最近的人雙?？虏《镜难芯浚茰y(cè)DHAV-1結(jié)構(gòu)蛋白VP0上可能存在保守的B細(xì)胞表位，可產(chǎn)生中和抗體[13]。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為一種體外基因表達(dá)系統(tǒng)，不但克服了大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)不能對(duì)重組蛋白進(jìn)行翻譯后加工的缺陷，而且也克服了動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)操作復(fù)雜、成本高等弊端，已成為外源基因表達(dá)的主要候選系統(tǒng)。本研究選擇利用Bac-to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)來(lái)表達(dá)DHAV-I VP0蛋白，Western-blot結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白大小正確，間接免疫熒光結(jié)果說(shuō)明重組蛋白能與陽(yáng)性鴨抗全病毒血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的VP0蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白有時(shí)需要對(duì)外源基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)接近1.0時(shí)，蛋白表達(dá)水平較高，GC含量平均在30%～70%之間，蛋白能夠進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄和翻譯，許多研究者通過(guò)優(yōu)化密碼子實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的高效表達(dá)[14]。本試驗(yàn)中在用SDS-PAGE對(duì)外源蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)，與對(duì)照組相比，未能觀察到明顯的差異條帶，而Western-blot分析時(shí)則出現(xiàn)了特異性的差異條帶，說(shuō)明重組蛋白的表達(dá)量不高，為提高重組蛋白的表達(dá)水平，以后將對(duì)VP0基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，以提高VP0的表達(dá)量，促進(jìn)其進(jìn)一步應(yīng)用。

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(責(zé)任編輯：蔣國(guó)良)

ExpressionofVP0genesofduckhepatitisAvirustype-Iininsectcells

WANG Anping, GU Lingling, WANG Yongjuan, WU Shuang, ZUO Weiyong, HONG Weiming, ZHU Shanyuan

(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Jiangsu Key Laboratory for High-Tech Research and Development of Veterinary Biopharmaceuticals, Taizhou 225300， China)

In order to express the structural protein VP0 of duck hepatitis A virus type-I (DHAV-I) in insect cells, one pair of specific primers were designed according to the published genome sequences of DHAV-I to amplifyVP0 genes by PCR, the amplified fragment was cloned into Baculovirus expression vector pFastBac1. The recombinant vector pFB-VP0 was transformed into DH10BacE.coli, and the positive recombinant bacmid rBacmid-VP0 was screened according to the resistant and the blue-white plague screening. The recombinant bacmid rBacmid-VP0 was transfected into the Sf9 insect cells by liposome. Once the cytopathic effect was found, the rBac-VP0 was aquired. The result of Western blot showed that the molecular weight of the recombinant proteins was about 29 kD. Indirect immunofluorescence analysis showed that the recombinant proteins could be recognized by the positive anti-virus serum. These results suggest that the structural proteins VP0 of DHAV-I have been expressed successfully in insect cells, which can lay the foundation of function study on VP0 protein.

duck hepatitis A virus type-I;VP0 gene; insect cells; expression

S834

：A

2016-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302096)；江蘇省農(nóng)業(yè)支撐項(xiàng)目(BE2013415)；江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(NY-009)

王安平(1980-)，女，江蘇泰州人，副教授，博士，主要從事獸用生物制藥的研究。

朱善元(1968-)，男，江蘇泰州人，教授，博士。

1000-2340(2017)03-0365-05