天山假狼毒根的化學(xué)成分研究

趙丹　吳桐宇　關(guān)永強(qiáng)　馬國(guó)需　張晶　石磊嶺

[摘要] 采用柱色譜方法對(duì)天山假狼毒Stelleropsis tianschanica根的95%乙醇提取物進(jìn)行分離純化，利用波譜技術(shù)對(duì)分得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。從天山假狼毒中分離得到了17個(gè)化合物，分別鑒定為5′甲氧基落葉松脂醇（1）、松脂素（2）、雙白瑞香素（3）、acutissimalignan B（4）、（+）開環(huán)異落葉松樹脂酚（5）、（+）表松脂酚（6）、7甲氧基西瑞香素（7）、thero8S7methoxysyringylglycerol（8）、1Omethylguaiacylglycerol（9）、2R22′阿魏酸酯2，3二羥基丙基酯（10）、vesiculosin（11）、4β，5βHguai9，7（11）dien12，8olide1α，8αdiol（12）、（-）nortrachelogenin（13）、4α，5βHguai9，7（11）dien12，8olide1α，8αdiol（14）、羅漢松脂素（15）、落葉松樹脂素（16）和異落葉松樹脂醇（17）。其中化合物1～13為首次從該屬植物中分離得到。采用免疫熒光檢測(cè)技術(shù)化合物3，7，10～14對(duì)孤兒核受體TR3的激活作用進(jìn)行了考察，結(jié)果表明在50 μmol·L-1下， 化合物10的TR3激活率高達(dá)76.38%，化合物3，7，11～14的能力較弱，均在50.0%左右。

[關(guān)鍵詞] 天山假狼毒； 化學(xué)成分； 松脂素； 雙白瑞香素； TR3

Chemical constituents from roots of Stelleropsis tianschanica

ZHAO Dan1，2， WU Tongyu3， GUAN Yongqiang2， MA Guoxu2， ZHANG Jing1*， SHI Leiling2*

（1. College of Chinese Medicine Material， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；

2. XinJiang Institute of Chinese and Ethnic Medicine， Urumqi 830002， China；

3. Center of Research and Development on Life Sciences and Environment Sciences， Harbin University of

Commerce， Harbin 150076， China）

[Abstract] The constituents from 95% ethanol extract of the roots of Stelleropsis tianschanica were purified by column chromatography techniques， leading to the isolation of 17 compounds. Their structures were elucidated by spectroscopic dataas 5′methoxy lariciresinol（1）， pinoresinol（2）， daphnoretin（3）， acutissimalignan B（4），（+）secoisolariciresinol（5），（+）epipinoresinol（6）， 7methyidaphnoretin（7）， thero8S7methoxysyringylglycerol（8）， 1Omethylguaiacylglycerol（9）， 2R22′ferulic acid ester2，3dihydroxypropyl ester（10）， vesiculosin（11）， 4β，5βHguai9，7（11）dien12，8olide1α，8αdiol（12），（-）nortrachelogenin（13）， 4α，5βHguai9，7（11）dien12，8olide1α，8αdiol（14）， matairesinol（15）， lariciresinol（16）and isolariciresinol（17）. Among them， compounds 113 wereobtained for the first time fromthe genus Stelleropsis. Compounds 3， 7， 1014 were tested for their activation of orphan nuclear receptor TR3 with the immunofluorescence technology in 50 μmol·L-1. The results showed that compound 10 displayed moderate activity with the activity ratio of 76.38%， and the others were only about 50.0%.

[Key words] Stelleropsis tianschanica； chemical constituents； pinoresinol； daphnoretin； TR3

中藥狼毒類藥材始載于神農(nóng)本草經(jīng)，其后歷代本草均有記載，其性味苦平，有逐水祛痰，破疾殺蟲之功效[1]，主治水腫腹脹，痰、食、蟲積，心腹疼痛，慢性氣管炎，咳嗽氣喘，淋結(jié)、皮膚、骨、附睪等結(jié)核，疥癬，痔縷等癥[26]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)狼毒進(jìn)行過一些化學(xué)成分的研究，主要報(bào)道的化合物有木脂素類、香豆素類、酚類等[79]。臨床上使用的狼毒科屬十分混亂，偽品較多，正品為瑞香狼毒[1011]。天山假狼毒Stelleropsis tianschanica作為狼毒的偽品一直在新疆地區(qū)使用，該植物屬于瑞香科假狼毒屬Stelleropsis，生于海拔1 700～2 000 m的山坡草地，在我國(guó)分布于新疆昭蘇縣境內(nèi)，國(guó)外吉爾吉斯斯坦也有分布[12]，然而有關(guān)該植物的化學(xué)成分及藥理方面的研究報(bào)道尚屬空白。針對(duì)這一現(xiàn)狀，本課題組選取天山假狼毒為研究對(duì)象，采用系統(tǒng)溶劑提取法提取，對(duì)天山假狼毒根二氯甲烷提取部位的化學(xué)成分進(jìn)行了分離研究，從中分離得到了17個(gè)化合物，分別鑒定為5′甲氧基落葉松脂醇（1），松脂素（2），雙白瑞香素（3），acutissimalignan B（4），（+）開環(huán)異落葉松樹脂酚（5），（+）表松脂酚（6），7甲氧基西瑞香素（7），thero8S7methoxysyringylglycerol（8），1Omethylguaiacylglycerol（9），2R22′阿魏酸酯2，3二羥基丙基酯（10），vesiculosin（11），4β，5β Hguai9，7（11）dien12，8olide1α，8αdiol（12），（-）nortrachelogenin（13），4α，5βHguai9，7（11）dien12，8olide1α，8αdiol（14），羅漢松脂素（15），落葉松樹脂素（16）和異落葉松樹脂醇（17），其中化合物1～13首次從該屬植物中分離得到。為了進(jìn)一步全面深入了解其有效成分，本實(shí)驗(yàn)研究了6個(gè)化合物對(duì)孤兒核受體TR3的激活作用，結(jié)果顯示，化合物10對(duì)孤兒核受體TR3的激活率最強(qiáng)，達(dá)到76.38%。endprint

1 材料

BrukerAvance Ⅲ 600型核磁共振波譜儀，賽默飛世（Thermofisher）LTQObitrap XL液質(zhì)聯(lián)用儀，柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司），柱色譜薄層色譜用硅膠GF254。HW40C凝膠（Toyopearl公司）MCI（日本三菱化學(xué)公司），常規(guī)試劑均為分析純。

天山假狼毒采于新疆昭蘇縣，經(jīng)新疆中藥民族藥研究所賈曉光研究員鑒定為天山假狼毒S. tianschanica的根。

2 提取分離

取天山假狼毒根部10 kg，陰干，粉粹，用10倍量95%乙醇加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，回收溶劑，濃縮后得總浸膏2 189 g?？偨嘤盟稚⒑?，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，萃取液減壓濃縮至干。最終得到石油醚部位浸膏108 g、氯仿部位浸膏455 g、乙酸乙酯部位浸膏347 g、正丁醇部位浸膏276 g。取氯仿部位455 g經(jīng)硅膠（100～200目）柱色譜，氯仿甲醇（1∶0～0∶1）梯度洗脫得到10個(gè)流分Fr.1～Fr.10。

Fr.1（5.0 g）進(jìn)行硅膠柱色譜分離得到4個(gè)組分Fr.11～Fr.14。Fr.12（55mg）經(jīng)HPLC半制備色譜分離（YMCPack ODSA，10 mm×250 mm，5 μm，60%甲醇）得到化合物1（2.3 mg），2（3.5 mg）。Fr.2（4.2 g）用反相材料Lichroprep Rp18（40～63 μm）柱色譜分離，薄層色譜檢測(cè)，合并相似洗脫液得到5個(gè)組分Fr.21～Fr.25。Fr.21（0.1 g）經(jīng)HPLC半制備色譜分離（YMCPack ODSA，10 mm×250 mm，5 μm，75%甲醇）得到化合物3（3.8 mg），4（2.9 mg）。Fr.23（80.0 mg），經(jīng)HPLC半制備色譜分離（YMCPack ODSA，10 mm×250 mm，5 μm，53%甲醇）得到化合物5（3.4 mg），6（4.7 mg）。Fr.3（4.5 g）先后經(jīng)HW40C凝膠柱色譜分離，得到3個(gè)組分Fr.31～Fr.33。Fr.32（0.4 g）經(jīng)HPLC半制備色譜分離（YMCPack ODSA，10 mm×250 mm，5 μm，80%甲醇）得到化合物7（4.1 mg），8（3.6 mg），9（2.3 mg）。Fr.4（10.0 g）經(jīng)硅膠（300～400目）柱色譜，得到5個(gè)組分Fr.41～Fr.45。Fr.42（0.2 g）析出得到化合物10（15 mg），F(xiàn)r.43（0.15 g）經(jīng)HPLC半制備色譜分離（YMCPack ODSA，10 mm×250 mm，5 μm，80%甲醇）得到化合物11（4.2 mg），12（2.2 mg），13（3.6 mg），14（3.9 mg）。Fr.45（72.0 mg）經(jīng)HPLC半制備色譜分離（YMCPack ODSA，10 mm×250 mm，5 μm，45%甲醇），得到化合物15（2.6 mg），16（3.5 mg）。Fr.5（0.3 g）經(jīng)MCI中壓柱色譜，得到5個(gè)組分Fr.51～Fr.55。Fr.53（92.0 mg）經(jīng)HPLC半制備色譜分離（YMCPack ODSA，10 mm×250 mm，5 μm，84%甲醇）得到化合物17（2.4 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無定形粉末，ESIMS m/z 413[M+Na]+。1HNMR（DMSOd6，600 MHz）δ：6.74（1H，s，H2），6.67（1H，d，J=8.4 Hz，H5），6.57（1H，d，J=8.4 Hz，H6），6.52（2H，s，H2′，6′），4.65（1H，dd，J=11.4，6.0 Hz，H7′），3.88（1H，m，H9a）， 3.74（3H，s，3OCH3），3.73（6H，s，3′，5′OCH3），3.68（1H，m，H9′a），3.56（1H，m，H9b），3.47（1H，m，H9′b）。13CNMR（DMSOd6，150 MHz）δ：32.1（C7），42.0（C8），52.4（C8′），55.5（3′，5′OCH3），55.9（3OCH3），58.7（C9′），71.8（C9），81.9（C7′），103.1（C2′，6′），112.7（C2），115.4（C5），120.6（C6），131.7（C1），134.4（C4′），134.7（C1′），144.6（C4），147.1（C3），147.4（C3′，5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對(duì)比，鑒定化合物1為5′甲氧基落葉松脂醇。

4 化合物對(duì)孤兒核受體TR3的激活作用的研究

4.1 化合物對(duì)TR3激活活性測(cè)定 報(bào)告基因分析（reporter gene assay）：293T細(xì)胞鋪48孔板貼壁生長(zhǎng)24 h后，利用PEI轉(zhuǎn)染，PG5 50 ng/孔，pBindTR3LBD 50 ng/孔。轉(zhuǎn)染24 h后加藥，每個(gè)處理做3個(gè)復(fù)孔。加藥12 h后，收樣。用預(yù)冷1×PBS洗3次，每孔加60 μL裂解液，冰上裂解30 min。取30 μL裂解液用試劑盒測(cè)luciferase，renilla吸光度。對(duì)luciferase（熒光素酶）與renilla（海腎熒光素酶）吸光度比值作圖，報(bào)告基因分析用于檢測(cè)藥物對(duì)TR3的轉(zhuǎn)錄激活活性。實(shí)驗(yàn)以TPA（phorobol ester 12Otetradecanoyl13phorbol acetate，十四烷酰佛波醋酸酯）作為陽(yáng)性對(duì)照。

4.2 化合物對(duì)TR3的激活作用 實(shí)驗(yàn)以10 μmol·L-1濃度的TPA為陽(yáng)性對(duì)照，考察6個(gè)化合物對(duì)孤兒核受體TR3的激活作用，結(jié)果表明待測(cè)化合物在50 μmol·L-1濃度下，化合物10對(duì)核受體TR3的激活作用較強(qiáng)，達(dá)到76.38%，化合物3，7，10～14的能力較弱，均為50.0%左右，見表1。endprint

5 討論

本研究報(bào)道了從天山假狼毒根的二氯甲烷部位分離得到的17個(gè)化合物，其中13個(gè)化合物為首次從天山假狼毒植物中分離得到。本實(shí)驗(yàn)測(cè)試了其中6個(gè)化合物對(duì)孤兒核受體TR3的激活作用，結(jié)果表明化合物10有較強(qiáng)的激活核受體TR3促進(jìn)細(xì)胞凋亡的潛能，該類化合物可能為天山假狼毒促進(jìn)細(xì)胞凋亡活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開發(fā)利用天山假狼毒提供了科學(xué)依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]endprint