補(bǔ)腎中藥溫腎強(qiáng)身散對(duì)去卵巢大鼠骨代謝和OPG/RANKL平衡的影響*

楊博文，顏春魯，王 鵬，馬正民，牛彥強(qiáng)

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，甘肅 蘭州730000； 3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

補(bǔ)腎中藥溫腎強(qiáng)身散對(duì)去卵巢大鼠骨代謝和OPG/RANKL平衡的影響*

楊博文1，顏春魯2，王 鵬1，馬正民1，牛彥強(qiáng)3

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，甘肅 蘭州730000； 3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

目的：觀察補(bǔ)腎中藥溫腎強(qiáng)身散對(duì)去勢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝和OPG/RANK/RANKL含量的影響，探討補(bǔ)腎中藥溫腎強(qiáng)身散治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。方法：將60只SPF級(jí)雌性SD大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組，戊酸雌二醇組，溫腎強(qiáng)身散高、中、低劑量組和假手術(shù)組。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠行雙側(cè)卵巢去除術(shù)，假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)處理。戊酸雌二醇組給予雌激素戊酸雌二醇片0.09 μg/g體質(zhì)量灌胃治療，假手術(shù)組和模型對(duì)照組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃，溫腎強(qiáng)身散高、中、低劑量組依次給予8，16，32 g/kg溫腎強(qiáng)身散溶液10 μL/g體質(zhì)量灌胃治療，1 d 1次，連續(xù)4周。觀察大鼠的一般狀況，記錄末次給藥體質(zhì)量；檢測血清骨鈣素(osteocalcin，BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)、護(hù)骨素(osteoprotegerin ，OPG)、核因子b受體激活劑(receptor activator of nuclear factor κB，RANK )和核因子b配體受體激活劑(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)含量；雙能X骨密度儀分析測定大鼠股骨骨密度(bone mineral density，BMD)；AG-IX生物力學(xué)萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)檢測斷裂載荷和定伸長-位移。結(jié)果：與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組和各干預(yù)組大鼠體質(zhì)量明顯升高，血清trACP、RANK和RANKL含量均明顯升高(P<0.05)；而模型對(duì)照組大鼠血清BGP和OPG明顯降低，BMD明顯減少，斷裂載荷和定伸長-位移明顯減少(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比，溫腎強(qiáng)身散各劑量組血清trACP、RANK和RANKL含量均降低，股骨的骨微觀參數(shù)BMD均得到了良好地修復(fù)，骨生物力學(xué)參數(shù)中斷裂載荷、定伸長-位移得到了明顯修復(fù)(P<0.05)；而溫腎強(qiáng)身散中、高劑量組血清BGP和OPG明顯升高(P<0.05)。結(jié)論：補(bǔ)腎中藥溫腎強(qiáng)身散能夠調(diào)控去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨代謝和股骨的生物力學(xué)性能，可能是通過OPG/RANK/RANKL調(diào)節(jié)軸實(shí)現(xiàn)的。

溫腎強(qiáng)身散/藥效學(xué)；骨質(zhì)疏松；骨代謝；OPG/RANK/RANKL；動(dòng)物；大鼠

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種起病隱匿，以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加、易于骨折的慢性代謝性骨病[1]。性激素分泌減少，鈣調(diào)節(jié)激素分泌失調(diào)，蛋白質(zhì)、鈣、磷、維生素、微量元素?cái)z入不足，戶外運(yùn)動(dòng)減少是導(dǎo)致中、老年人易患OP的重要原因[2-3]。如何防治骨質(zhì)疏松成為醫(yī)學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。本課題以SD雌性大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用去卵巢法建立骨質(zhì)疏松癥模型，通過檢測血清骨鈣素(osteocalcin，BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)、護(hù)骨素(osteoprotegerin ，OPG)、核因子b受體激活劑(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)、核因子b配體受體激活劑(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)含量，股骨骨密度(bone mineral density，BMD)，斷裂載荷和定伸長-位移變化，進(jìn)一步探討補(bǔ)腎中藥溫腎強(qiáng)身散在體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)SD雌性大鼠60只，體質(zhì)量(180±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

溫腎強(qiáng)身散由鐘乳石(精焙)、蛇床子、遠(yuǎn)志、鹿茸(細(xì)研如磨末)、肉蓯蓉、薯蕷、續(xù)斷(為末)組成。藥材由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，分別制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 8，16，32 g/kg 的溫腎強(qiáng)身散藥物提取液。戊酸雌二醇片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司產(chǎn)品，批號(hào)156A；青霉素，華北制藥股份有限公司，批號(hào)F6042103。水合氯醛，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品，批號(hào)20150105； Rat OPG ELISA Kit檢測試劑盒(批號(hào)E20151102B)、Rat RANK/RANKL ELISA Kit檢測試劑盒(批號(hào)E20151102B)、Rat trACP ELISA Kit檢測試劑盒(批號(hào)E20151102B)、Rat BGP ELISA Kit檢測試劑盒(批號(hào)E20151201A)，均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。iMark型自動(dòng)酶標(biāo)分析儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；FA2004N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；ZY12306型微量加樣器，德國艾本德產(chǎn)品；T6新悅-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司產(chǎn)品；雙能X骨密度儀，美國GE公司產(chǎn)品；AG-IX生物力學(xué)萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)，日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組、模型的建立與給藥

將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型對(duì)照組，戊酸雌二醇組，溫腎強(qiáng)身散高、中、低劑量組6組，每組10只。除假手術(shù)組外，其他各組參照文獻(xiàn)[4-6]方法造模：以40 g/L水合氯醛(3 μg/g)腹腔注射麻醉大鼠；取俯臥位，備皮，消毒手術(shù)區(qū)皮膚；沿背部后正中線作1個(gè)1.0～1.5 cm的縱形切口，找到卵巢，沿子宮角處結(jié)扎并切除卵巢，逐層縫合傷口。假手術(shù)組大鼠只切除卵巢周圍脂肪組織。術(shù)后給予青霉素抗感染，注意保溫。造模成功后7 d給予藥物干預(yù)，戊酸雌二醇組給予雌激素戊酸雌二醇片0.09 μg/g體質(zhì)量灌胃，假手術(shù)組和模型對(duì)照組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃，溫腎強(qiáng)身散高、中、低劑量組依次給予8，16，32 g/kg溫腎強(qiáng)身散溶液10 μL/g灌胃，每日1次，連續(xù)4周。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 動(dòng)物一般狀況

每天觀察大鼠精神狀態(tài)，毛發(fā)，活動(dòng)，飲食飲水，大、小便等,并在末次給藥24 h后記錄各組大鼠體質(zhì)量。

1.4.2 血清BGP、trACP、OPG、RANK、RANKL含量

末次給藥后，腹主動(dòng)脈采血，靜置2～3 h，1 500 r/min離心10 min，分離血清。檢測各組血清骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)(BPG、trACP)、OPG/RANK/RANKL調(diào)節(jié)系統(tǒng)指標(biāo)(OPG、RANK、RANKL)含量，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 骨密度

采血結(jié)束后，以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉各組動(dòng)物，四肢展開平置于雙能X 線吸收測量儀平臺(tái)上，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中小動(dòng)物軟件測定右股骨BMD。

1.4.4 斷裂載荷和定伸長-位移

處死大鼠后取出完整股骨，將其右側(cè)股骨送至蘭州軍區(qū)總醫(yī)院，用AG-IX生物力學(xué)萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)檢測斷裂載荷和定伸長-位移。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組及各藥物組大鼠皮毛欠光滑，其他一般狀況如精神狀態(tài)，活動(dòng)，飲食飲水，大、小便情況均未見明顯異常。與模型對(duì)照組對(duì)比，戊酸雌二醇組及溫腎強(qiáng)身散3個(gè)劑量組大鼠精神狀態(tài)，活動(dòng)，飲食飲水，大、小便情況均無差異。與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組及各藥物組大鼠體質(zhì)量升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組對(duì)比，溫腎強(qiáng)身散3個(gè)劑量組和戊酸雌二醇組體質(zhì)量降低，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠末次給藥后體質(zhì)量對(duì)比響

注：與假手術(shù)組對(duì)比，**P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P>0.05。

2.2 各組大鼠血清BGP、trACP含量對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠血清BGP含量降低，trACP含量升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，溫腎強(qiáng)身散中、高劑量組和戊酸雌二醇組血清BGP含量均升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；溫腎強(qiáng)身散3個(gè)劑量組和戊酸雌二醇組血清trACP含量均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清BGP 、trACP 含量對(duì)比

注：與假手術(shù)組對(duì)比，**P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.05。

2.3 各組OPG、RANK、RANKL含量對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠血清OPG含量降低，RANKL和RANK含量均升高, 差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，溫腎強(qiáng)身散中、高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠血清OPG含量升高，溫腎強(qiáng)身散3個(gè)劑量組和戊酸雌二醇組大鼠血清RANKL和RANK含量均降低, 差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表 3。

表3 各組OPG、RANK、RANKL含量對(duì)比

注：與假手術(shù)組對(duì)比，**P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.05。

2.4 各組BMD對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠BMD降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，溫腎強(qiáng)身散各劑量組和戊酸雌二醇組BMD均升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠BMD對(duì)比

注：與假手術(shù)組對(duì)比，**P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.05。

2.5 各組斷裂載荷、定伸長-位移參數(shù)對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)斷裂載荷、定伸長-位移指標(biāo)均明顯下降(P<0.05)；溫腎強(qiáng)身散各劑量組和戊酸雌二醇組可明顯改善去卵巢大鼠斷裂載荷、定伸長-位移參數(shù)(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠斷裂載荷、定伸長-位移參數(shù)對(duì)比

注：與假手術(shù)組對(duì)比，**P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.05。

3 討 論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由于絕經(jīng)期婦女卵巢功能的退化造成機(jī)體雌激素水平下降而導(dǎo)致的一種骨代謝失衡病，屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨痹”等范疇。中醫(yī)臨床根據(jù)骨質(zhì)疏松的病因病機(jī)，依據(jù)辨證論治將其分為腎陰虛、腎陽虛、脾胃虛弱、氣虛血瘀等型，治法多以補(bǔ)腎、健脾、活血等為主，以補(bǔ)腎中藥多用[7]。敦煌醫(yī)方溫腎強(qiáng)身散有溫補(bǔ)腎陽、填精補(bǔ)髓的作用。方中以鹿茸為君藥，可溫腎陽，益精血，強(qiáng)筋骨；肉蓯蓉溫腎助陽，補(bǔ)益精血，與鹿茸配伍，不但能溫補(bǔ)腎陽，又能填精補(bǔ)髓，此正如《難經(jīng)》所謂“損其腎者，補(bǔ)其精”之意；蛇床子、鐘乳石皆能溫腎助陽，與鹿茸、肉蓯蓉合用，加強(qiáng)溫補(bǔ)腎陽之功；佐以遠(yuǎn)志交通心腎，寧心安神；薯芋既能培補(bǔ)后天、助氣血陰陽化生，又能益腎澀精、防止腎精耗散，同時(shí)又培補(bǔ)后天，交通心腎；續(xù)斷補(bǔ)肝腎，續(xù)筋骨，調(diào)血脈，可助薯芋氣血化生之功。諸藥合用，重在溫補(bǔ)腎陽，兼能填精益髓。

有研究認(rèn)為：骨吸收大于骨形成，骨代謝失衡是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要原因[8]。骨組織的骨量、結(jié)構(gòu)、形狀及內(nèi)在的生物力學(xué)性能等指標(biāo)是判定骨質(zhì)疏松骨性能的重要指標(biāo)[9]。BMD的測定是目前公認(rèn)的診斷骨質(zhì)疏松中骨量丟失的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展進(jìn)程中，反映骨吸收與骨形成平衡狀況的骨代謝生化指標(biāo)會(huì)隨之發(fā)生變化。BGP是骨形成的生化指標(biāo)[11]。trACP反映骨吸收程度，是目前鑒別骨量丟失、診斷骨質(zhì)疏松的可靠指標(biāo)[12]。已有相關(guān)研究[13-15]證實(shí)：中藥對(duì)調(diào)節(jié)骨代謝和骨量具有良好效果。本研究結(jié)果也顯示：溫腎強(qiáng)身散能夠提高骨質(zhì)疏松模型大鼠的BGP含量、BMD、斷裂載荷和定伸長-位移。表明：溫腎強(qiáng)身散對(duì)骨質(zhì)疏松具有良好的治療效果。

OPG/RANK/RANKL是一個(gè)能影響破骨細(xì)胞生成、分化、成熟和調(diào)節(jié)骨重建的樞軸旁分泌系統(tǒng)。近年研究[16-17]發(fā)現(xiàn)：OPG作為腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，與其配體OPGL結(jié)合后，可阻止RANKL與OPGL的結(jié)合，使RANKL活化受阻，不能發(fā)揮破骨作用。李晶等[18]研究發(fā)現(xiàn)：淫羊藿總黃酮能促進(jìn)去勢大鼠骨組織OPG mRNA表達(dá)的表達(dá)，使RANKL活化受阻，有效抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟，減少破骨細(xì)胞的增殖及骨吸收，從而對(duì)骨質(zhì)疏松起到治療的作用。本研究也證實(shí)：溫腎強(qiáng)身散各劑量組能夠有效降低骨質(zhì)疏松大鼠血清RANK和RANKL的含量，中、高劑量組的溫腎強(qiáng)身散能有效升高骨質(zhì)疏松大鼠OPG的含量。說明：溫腎強(qiáng)身散通過上調(diào)成骨細(xì)胞OPG 的表達(dá)、下調(diào)RANKL和RANK的表達(dá)來減少破骨細(xì)胞的生成、抑制破骨細(xì)胞的活化、降低破骨細(xì)胞的骨吸收功能來防治骨質(zhì)疏松癥。

綜上所述，溫腎強(qiáng)身散可能是通過OPG/RANK/RANKL調(diào)節(jié)軸實(shí)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松骨代謝的調(diào)控作用來達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的。

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1001-6910(2017)09-0061-04

R681.1

:B

2017-06-29；

2017-08-03

(編輯 陶 珠)

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.09.26

顏春魯，副教授， yanchl1979@126.com

甘肅省高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目(2015A-097)；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)研究與教學(xué)改革項(xiàng)目(ZH-201606)；甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究重大實(shí)驗(yàn)室開放基金(FZYK15-16-7)