腺苷酸環(huán)化酶抑制劑和激動劑在脂多糖誘導的急性肺損傷中的作用

汪雪峰，陳 鋒，宋順德，章哲文，湯慧芳

(1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 310005；2. 浙江大學醫(yī)學院，浙江 杭州 310058)

腺苷酸環(huán)化酶抑制劑和激動劑在脂多糖誘導的急性肺損傷中的作用

汪雪峰1，陳 鋒1，宋順德2，章哲文2，湯慧芳2

(1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 310005；2. 浙江大學醫(yī)學院，浙江 杭州 310058)

目的探討腺苷酸環(huán)化酶抑制劑(SQ22536)和激動劑(Forskolin)在脂多糖(LPS)誘導的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)中的作用。方法ICR小鼠隨機分為生理鹽水組(N組)、模型組(L組)、地塞米松組(D組)、SQ22536組(SQ組)和Forskolin組(F組)，氣道內滴入LPS制備ALI模型。6 h后觀察肺組織病理改變，測定肺泡灌洗液(BALF)中白細胞、中性粒細胞和白蛋白含量，檢測肺組織中髓過氧化物酶(MPO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和cAMP含量。結果Forskolin可明顯改善肺組織病理變化，降低BALF中白細胞、中性粒細胞和蛋白含量， MPO活性和TNF-α含量明顯降低，cAMP含量升高；SQ22536與M組相比差異均無顯著性。結論Forskolin對ALI的保護機制可能與升高cAMP水平、抑制中性粒細胞黏附和趨化及降低TNF-α等相關炎癥因子含量有關。

急性肺損傷；內毒素；腺苷酸環(huán)化酶抑制劑；腺苷酸環(huán)化酶激動劑；腫瘤壞死因子；環(huán)磷酸腺苷

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是心源性以外的各種肺內外致病因素導致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭，目前認為是由多種效應細胞如中性粒細胞、肺泡巨噬細胞和肺泡毛細血管內皮細胞等的活化，及其釋放的細胞因子和多種炎癥介質在肺內形成的網(wǎng)絡作用所致[1]。探索新的減輕ALI的藥物是ALI防治研究的活躍領域。環(huán)磷酸腺苷(cyclic AMP, cAMP)是細胞內的第二信使，cAMP對細胞代謝的調節(jié)是通過調節(jié)酶的活性來實現(xiàn)的，從而影響細胞、組織、器官的功能改變，本實驗旨在探討腺苷酸環(huán)化酶抑制劑和激動劑對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的小鼠急性肺損傷中的影響，并初步探討其可能作用機制，為臨床治療ALI提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1動物ICR小鼠，♂，體質量19～21 g，清潔級，浙江大學醫(yī)學院實驗中心提供，合格證號：(SCXK2013-0016)。所有操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》。實驗環(huán)境：恒溫(22±2)℃，濕度60%～70%，自由飲水和進食。

1.2試劑與儀器LPS(Escherichia coli LPS O55:B5，L2880 )；SQ22536(Sigma,S153 )；Forskolin(Tocris, No:1099)；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒(南京建成生物技術有限公司，A044)；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購自R&D Systems(R&D Systems, Mineapolis, MN,USA，DY410，DY401，DY406)；蛋白測定試劑盒(Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA，500-0120)；cAMP ELISA 試劑盒 (R&D Systems, Mineapolis, MN, 128 USA)。GF-1型控時調速式高速分散器：江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠；ELX800UV型酶標儀：美國Bio-Tek 儀器公司；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司。

2 方法

2.1模型制備及給藥應用氣道內滴入LPS的方法制備小鼠ALI模型，將小鼠隨機分為生理鹽水對照組、模型組、地塞米松組(DXM 5 mg·kg-1)、腺苷酸環(huán)化酶抑制劑組(SQ組 3.2 mg·kg-1)和腺苷酸環(huán)化酶激動劑組(F組 6.6 mg·kg-1)，每組12只。小鼠按280 mg·kg-1腹腔注射100 g·L-1水合氯醛麻醉，鈍性分離氣管，除生理鹽水組外，其余各組小鼠氣道內滴入LPS(2 mg·kg-1)，生理鹽水組給予等體積生理鹽水。10 min后給藥組分別一次性腹腔注射相應劑量藥物，生理鹽水組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水。37℃放置，6 h后處死，左肺行支氣管肺泡灌洗，右肺收集保存。

2.2支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數(shù)和分類造模6 h后將小鼠麻醉，股動脈放血處死，結扎右肺后，暴露氣管行氣管插管，用PBS液1.5 mL分3次進行支氣管肺泡灌洗，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)回收率達90%，冰浴保存，取部分BALF混勻后細胞計數(shù)，進行總白細胞(WBC)計數(shù)，剩余BALF于4℃，250×g離心10 min，取細胞沉淀涂片，晾干后吉姆薩染色，進行細胞分類計數(shù)，包括巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞，離心后取上清留取上清液，儲存于-80℃。

2.3支氣管肺泡灌洗液中相關細胞因子和蛋白含量測定采用雙抗體夾心ELISA法，按照試劑盒說明書要求，測定BALF中TNF-α、IL-6和 IL-1β相關細胞因子，利用Bio-Rad蛋白測定試劑盒測定BALF中總蛋白含量。

2.4肺組織中MPO活性及cAMP含量的測定準確稱取右肺下葉組織，按試劑盒要求用生理鹽水制備成100 g·L-1的組織勻漿，4℃、12 000×g離心10 min，收集上清，利用cAMP ELISA 試劑盒，按步驟測定組織勻漿里的cAMP含量，MPO活性測定采用酶學動力方法測定。

2.5肺組織病理學檢查左肺下葉于福爾馬林中固定24 h，固定后進行脫水、透明、石蠟包埋后切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，高倍顯微鏡觀察肺水腫及炎癥細胞浸潤，觀察肺組織病理學改變。

2.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。各組數(shù)據(jù)先行方差齊性檢驗，樣本均數(shù)比較采用方差分析和Dunnettt檢驗。

3 結果

3.1SQ22536和Forskolin對ALI小鼠肺泡灌洗液中白細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)和蛋白含量的影響小鼠氣道內滴入LPS 6 h后，與生理鹽水對照組(N組)相比，模型組(L組)BALF中白細胞總數(shù)和中性粒細胞百分數(shù)增多(P<0.01)，給予SQ22536(SQ組)和Forskolin(F組)處理后，F(xiàn)組可降低LPS引起的白細胞總數(shù)增高和中性粒細胞百分數(shù)(P<0.01)，作用強度與地塞米松相當，而SQ組對LPS引起的白細胞數(shù)和中性粒細胞增多無明顯影響(P>0.05)； LPS組小鼠BALF中的蛋白含量較N組明顯升高(P<0.01)，給予Forskolin和DXM處理后，可使BALF中的蛋白含量降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義(Tab 1)。

3.2SQ22536和Forskolin對ALI小鼠肺組織病理變化的影響光鏡下見生理鹽水對照組肺組織結構清晰，肺泡腔及支氣管腔未見炎癥細胞及滲出物。模型組可見點、片狀出血，大量中性粒細胞浸潤，肺泡間隙邊緣有輕度的透明膜存在，顯示明顯的炎癥和輕度的肺水腫現(xiàn)象，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔變窄。Forskolin組及地塞米松組上述病理變化明顯改善，SQ組無明顯改善(Fig 1)。

Tab 1 Influence of SQ22536 and forskolinon WBC count, neutrophil count and albumin levelin BALF of LPS-challenged mice(±s，n=8～12)

N:Normal saline; L: LPS; D: LPS+Dexamethason; F:LPS+Forskolin; SQ: LPS+SQ22536.#P<0.05,##P<0.01vsLPS alone;**P<0.01vsN alone

3.3SQ22536和Forskolin對ALI小鼠MPO、TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響模型組小鼠肺組織中MPO活性較生理鹽水對照組明顯升高(P<0.01)，給藥處理后，F(xiàn)組中MPO活性明顯降低(P<0.05)，而D組和SQ組有所降低，但差異無顯著性(P>0.05)；與N相比，M組BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均明顯升高(P<0.01)，地塞米松能明顯降低三者的含量，F(xiàn)orskolin能明顯降低TNF-α的含量(P<0.01)，對IL-1β和IL-6的影響不明顯(P>0.05)，而SQ22536則對三者均無明顯影響(P>0.05)。見Tab 2。

Tab 2 Influence of SQ22536 and forskolin onMPO activity in lungs and TNF-α, IL-1β,IL-6 level in BALF of LPS-challenged mice(±s,n=8～12)

N:Normal saline; L: LPS; D: LPS+Dexamethason; F:LPS+Forskolin; SQ: LPS+SQ22536.#P<0.05,##P<0.01vsLPS alone;**P<0.01vsN alone

3.4SQ22536和Forskolin對ALI小鼠cAMP含量的影響L組與N組相比，肺組織cAMP含量明顯降低(P<0.01)，與模型組相比，地塞米松和Forskolin能明顯升高肺組織中cAMP含量(P<0.01)，SQ22536 LPS性小鼠肺組織中cAMP含量無明顯影響(P>0.05)，見Fig 2。

4 討論

革蘭陰性菌所致敗血癥是引起ALI并最終導致患者死亡的重要原因之一，LPS是革蘭陰性菌的主要致病成分[2]。ALI發(fā)病機制復雜，目前尚未完全闡明[3]。有研究表明，中性粒細胞在肺內黏附、聚集和激活是ALI發(fā)病的重要病理基礎，而中性粒細胞通過“呼吸爆發(fā)”釋放多種炎癥介質、蛋白酶和氧自由基等對ALI發(fā)生起重要作用。大量實驗表明，在ALI發(fā)生發(fā)展過程中，肺組織局部產(chǎn)生大量促炎因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、巨噬細胞炎性蛋白lα等[4]，它們之間形成的復雜細胞因子網(wǎng)絡互相激活和互相作用，使炎癥反應級聯(lián)放大。TNF-α可誘導循環(huán)中性粒細胞黏附于血管內皮，促進中性粒細胞遷移并浸入支氣管肺泡腔，使其激活和脫顆粒，產(chǎn)生氧自由基，釋放顆粒酶，包括MPO[5]。MPO是一種中性粒細胞釋放的蛋白酶，MPO活性可反映中性粒細胞浸潤，與TNF-α的變化趨勢相似，與肺部炎癥密切相關。臨床觀察和動物研究均發(fā)現(xiàn)，升高細胞內的cAMP水平，能明顯改善肺水腫等各種病理情況[6-7]，在急性肺損傷，有研究表明cAMP在各種動物模型中都有保護作用，如大腸桿菌引起的急性肺損傷豬損傷[8-9]、魚精蛋白誘導的大鼠離體肺急性損傷[10]、內毒素致大鼠肺損傷[11]等。

Fig 1 Effect of SQ22536 and forskolin on lung histopathological changes of LPS-induced acute lung injury mice(HE staining, ×400)

N:Normal saline; L: LPS; D: LPS+Dexamethason; F:LPS+Forskolin; SQ: LPS+SQ22536.

Fig 2 Effects of SQ22536 and forskolin oncAMP concentration in lung histopathologiealchanges of LPS-induced acute lung injury mice(±s,n=8～12)

N:Normal saline; L: LPS; D: LPS+Dexamethason; F:LPS+Forskolin; SQ: LPS+SQ22536.##P<0.01vsLPS alone;**P<0.01vsN alone

SQ22536是腺苷酸環(huán)化酶的抑制劑，可在完整人類血小板中抑制PGE-1刺激cAMP水平升高。Forskolin存在于各種干細胞類型中，是一種普遍存在的真核細胞腺苷酸環(huán)化酶(AC)激活劑，在細胞生理學研究中，通常用來提高cAMP水平。本研究表明，給小鼠氣道滴入LPS制備ALI模型，病理檢查結果顯示，模型組小鼠肺組織水腫和出血，有大量炎癥細胞浸潤，表明造模成功。Forskolin可明顯減少LPS引起的小鼠BALF中的蛋白漏出以及肺組織中白細胞和中性粒細胞的浸潤，降低肺組織中MPO活性和TNF-α炎癥因子的含量，但對IL-6和IL-1β相關細胞因子無明顯影響，F(xiàn)orskolin同時也能明顯升高肺組織中cAMP含量，而SQ22536在LPS性急性肺損傷小鼠中無明顯作用。本實驗證明，F(xiàn)orskolin能減輕LPS性肺組織損傷，抑制LPS誘導的肺水腫、蛋白滲出，減少相關炎癥因子釋放，具有抗LPS急性肺損傷的保護作用。

Forskolin的抗LPS急性肺損傷的保護作用研究甚少，保護機制尚不清楚。中性粒細胞在肺內大量浸潤是ALI的重要發(fā)病環(huán)節(jié)[12]，而TNF-α作為早期炎性因子在ALI 中具有啟動和介導炎癥反應的重要作用[13-14]，TNF-α能激活巨噬細胞和中性粒細胞，促進中性粒細胞的滲出、吞噬、呼吸爆發(fā)和氧自由基得釋放[15]。本研究中Forskolin可有效抑制LPS所致BALF白細胞計數(shù)的增多，降低肺組織內MPO活性，抑制BALF中TNF-α水平升高，升高肺組織中cAMP含量。因此，筆者推測，F(xiàn)orskolin減輕LPS引起的急性肺損傷的機制可能與升高cAMP含量、抑制TNF-α的產(chǎn)生，進而減輕中性粒細胞的肺部浸潤及炎癥因子的釋放有關。因此，腺苷酸環(huán)化酶激動劑在治療ALI方面具有研究開發(fā)價值。

(致謝：本實驗是在浙江大學醫(yī)學院藥理實驗室完成，感謝對本研究提供指導和幫助的老師和同學，特別感謝浙江大學藥理實驗室和動物中心為本研究提供的良好實驗環(huán)境！)

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Effectofadenylatecyclaseantagonistsandagonistinacutelunginjuryinducedbylipopolysaccharide

WANG Xue-feng1, CHEN Feng1, SONG Shun-de2, ZHANG Zhe-wen2, TANG Hui-fang2

(1.PharmacyDept,theSecondAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310005,China;2.SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

AimTo explore the effect of adenylate cyclase(AC) antagonists SQ22536 and agonist forskolin on acute lung injury induced by lipopolysaccharide.MethodsICR mice were randomly divided into normal saline control group(N group), model group(group L), dexamethasone group(group D),AC antagonists s(group SQ) and AC agonist group(group F). The ALI mouse model was induced by instilling intratracheally with LPS(2 mg·kg-1), and 6 h later, the lung tissue and alveolar lavage fluid(BALF) were harvested, pathological changes in lung were observed, white blood cell and neutrophil, albumin content in BALF and myeloperoxidase(MPO) activity of lung tissue homogenate were determined, and tumor necrosis factor α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β), interleukin 6(IL-6) and cAMP content in lung homogenates were detected by ELISA.ResultsCompared with normal saline group, a large number of neutrophils infiltrated around the pulmonary vessel and airway 6 h after LPS intratracheal instillation in model group. White blood cells and neutrophils and protein content increased in BALF; MPO activity and cAMP levels increased in lung tissues. In the lung tissue TNF-α and IL-6, IL-1β content increased, compared with model group. Forskolin could improve the pathological changes of lung tissue, reduce the total number of leukocytes, number of neutrophils and protein content in BALF, and reduce MPO activity and TNF-α content in lung tissue, at the same time it increased the cAMP content; SQ22536 had no significant effect when compared with model group.ConclusionAC agonists have protective effects on LPS-induced acute lung injury in mice, and the mechanism may be related to elevating cAMP levels, inhibiting neutrophil adhesion and chemotaxis and reducing inflammatory factor levels.

acute lung injury; endotoxin; adenylate cyclase inhibitor; adenylate cyclase agonist; tumor necrosis factor; cAMP

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.016

A

：1001-1978(2017)10-1410-05

R-332；R322.35；R392.12；R563.1；R977.3

時間：2017-9-5 9:26 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.032.html

2017-05-29,

2017-07-13

國家自然科學基金資助項目(No 81202980)

汪雪峰(1984-)，女，碩士，主管藥師 ，研究方向：抗炎免疫藥理學與呼吸藥理學，E-mail: wxfeng360@sina.com； 湯慧芳(1973-)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：抗炎免疫藥理學與呼吸藥理學，通訊作者，E-mail: tanghuifang@zju.edu.cn