金雀異黃酮對三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡及EGFR/PI3K/Akt通路的影響

韋立群，李婉婷，李 通，徐成飛，唐雙意，甘嘉亮

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1. 藥學(xué)院、2. 第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科、3. 第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧 530021)

金雀異黃酮對三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡及EGFR/PI3K/Akt通路的影響

韋立群1，李婉婷1，李 通2，徐成飛2，唐雙意3，甘嘉亮2

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1. 藥學(xué)院、2. 第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科、3. 第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧 530021)

目的研究金雀異黃酮(genistein)誘導(dǎo)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡及其機制。方法MTT法觀察金雀異黃酮對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用；Hoechst 33258染色觀察金雀異黃酮對MDA-MB-231細胞核凋亡形態(tài)學(xué)的影響；qRT-PCR法觀察金雀異黃酮干預(yù)MDA-MB-231細胞36 h后，EGFR mRNA表達水平的變化；金雀異黃酮干預(yù)MDA-MB-231細胞36 h后，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3，EGFR、Akt、p-Akt蛋白的變化；Akt激活劑胰島素(insulin)、金雀異黃酮單獨及聯(lián)合胰島素干預(yù)乳腺癌MDA-MB-231細胞后，Western blot檢測Akt和p-Akt蛋白表達量的變化。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，金雀異黃酮呈時間濃度依賴性抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖；Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，金雀異黃酮干預(yù)乳腺癌MDA-MB-231細胞36 h后細胞核呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學(xué)改變；qRT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)金雀異黃酮干預(yù)MDA-MB-231細胞36 h后，EGFR的mRNA表達水平明顯下降(P<0.01)；Western blot結(jié)果顯示金雀異黃酮干預(yù)乳腺癌MDA-MB-231細胞36 h后，與對照組對比，Bcl-2、EGFR、Akt、p-Akt蛋白表達水平明顯下調(diào)(P<0.01)，Bax、caspase-3蛋白表達水平明顯上調(diào)(P<0.01)，Akt激活劑胰島素可以明顯激活p-Akt(P<0.01)，金雀異黃酮可以明顯下調(diào)被激活的p-Akt(P<0.01)。結(jié)論金雀異黃酮能抑制三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞生長并誘導(dǎo)其凋亡，其機制可能與抑制EGFR/PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

金雀異黃酮；三陰乳腺癌；凋亡；增殖；人表皮生長因子受體；EGFR/PI3K/Akt信號通路

三陰乳腺癌是指雌激素受體( estrogen receptor，ER) 、孕激素受體( progesterone receptor，PR) 和人表皮生長因子受體2( human epidermal growth factor receptor-2，HER2) 表達均為陰性的乳腺癌，具有強侵襲力、高風(fēng)險遠處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良等生物學(xué)特點，占所有乳腺癌的15%～23%[1-3]。治療上與非三陰乳腺癌相比，無法采用內(nèi)分泌治療和分子靶向治療等多種有效治療手段，可見三陰乳腺癌非手術(shù)治療手段單一。因此，臨床醫(yī)師期望有更多可選擇的手段來豐富三陰乳腺癌的治療。金雀異黃酮(genistein)又稱染料木素，主要來源于豆類食物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為 5，7，4′-三羥基異黃酮，與內(nèi)源性雌激素雌二醇結(jié)構(gòu)相似[4]，具有廣泛的生物活性。有研究報道，金雀異黃酮通過 p38MAPK通路促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[5]。成魁等[6]報道，金雀異黃酮具有一定的骨保護作用。在金雀異黃酮廣泛的生物活性中抗癌活性最為明顯，但其抗癌具體機制仍然不十分清楚。本課題擬用金雀異黃酮作用于高轉(zhuǎn)移三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231，了解其對增殖及凋亡的影響，并探討其可能機制，為開發(fā)植物雌激素抗癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑人乳腺癌細胞MDA-MB-231由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科馮振博課題組惠贈，該細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國康寧公司；金雀異黃酮、胰島素、噻唑藍( MTT)、結(jié)晶紫和熒光染料 Hoechst 33258 購自美國 Sigma 公司；胎牛血清購自澳大利亞 Excellbio 公司；RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen 公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；GAPDH、Bax、Bcl-2、EGFR抗體購自美國ABclonal 公司；Akt、p-Akt兔抗人多克隆抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司；0.25%胰酶、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液(強)、PMSF(100 nmol·L-1)、SDS PAGE凝膠配制試劑盒，購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)及藥品儲存液配制人乳腺癌細胞MDA-MB-231用含10%胎牛血清高糖DMEM，于37℃、5% CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。金雀異黃酮溶于DMSO配制成100 mmol·L-1儲存液，-20℃ 保存，實驗時用 10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度(DMSO終體積分數(shù)不能超過0.1%)。

1.3MTT實驗取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，以4×103/孔 接種于96孔板，培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)上清液，加入配制好的終濃度為0、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1的金雀異黃酮，每孔200 μL，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、36、48 h，每孔加入20 μL 5 g·L-1的MTT，孵育4 h后將孔里的液體吸出，加入150 μL的DMSO，于震蕩器上避光震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶，在490 nm處用酶標(biāo)儀測定各孔的吸光值(OD值)。細胞存活抑制率/%=(正常對照組A490 nm-給藥組A490 nm)/正常對照組A490 nm×100%。

1.4Hoechst33258染色實驗將對數(shù)期生長的MDA-MB-231細胞接種到內(nèi)嵌有經(jīng)過無菌處理的蓋玻片的6孔板上，待細胞長至80%時，棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度金雀異黃酮(0、25、50、100 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗3遍，加入多聚甲醛固定15 min后棄去，用PBS洗3遍；再用Hoechst 33258工作液室溫避光染色20 min，棄去工作液，用 PBS洗3遍，再用抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.5qRT-PCR實驗將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞長至80%時，棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度金雀異黃酮(0、25、50、100 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗3遍，用RNA提取試劑盒(Axygen)提取MDA-MB-231細胞總RNA，用核酸檢測儀測總RNA 的含量和純度，用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg 總RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。用EGFR基因特異性引物進行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)，按說明書操作。反應(yīng)步驟: 95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCT表示基因的相對表達量。EGFR引物序列：上游為5′-CCTGGTCTGGAAGTACGCAG-3′，下游為5′-CGATGGACGGGATCTTAGGC-3′，內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游為5′-GTCTTCACCACCATGGAGAAG-3′，下游為5′-GTTGTCATGGATGACCTTGGC-3′。

1.6Westernblot實驗將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞長至80%時，棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度金雀異黃酮(0、25、50、100 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗3遍，加入細胞裂解液(RIPA ∶PMSF ∶Cocktail=100 ∶1 ∶2)冰上裂解30 min，12 000 r·min-1離心20 min，用BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣蛋白緩存液，置于沸水中高溫變性8 min，取100 μg蛋白質(zhì)，經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，室溫下5% BSA封閉 40 min，一抗冰上孵育過夜，二抗室溫孵育 60 min，最后用雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜并采集圖像。每組實驗重復(fù) 3 次。

2 結(jié)果

2.1MTT法觀察金雀異黃酮對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響如Tab 1結(jié)果顯示，隨著金雀異黃酮濃度和時間的增加，對細胞存活的抑制作用逐漸增強。24、36、48 h 的 IC50值分別為(74.93± 1.35)、(63.82 ± 1.76)、(55.44±0.15)μmol·L-1。

2.2Hoechst33258染色觀察金雀異黃酮對MDA-MB-231細胞凋亡的影響Fig 1染色結(jié)果顯示，細胞對照組中為正常細胞，形態(tài)呈圓形，淡藍色，細胞核被Hoechst著色；而經(jīng)金雀異黃酮處理后的細胞，細胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征，可見早期凋亡細胞，細胞核染色質(zhì)凝聚、固縮成明亮的月牙狀、啞鈴狀或不規(guī)則圓形、橢圓形亮藍白色亮光。隨著藥物濃度的增加，凋亡率明顯增高(P<0.01)，見Fig 2，表明 金雀異黃酮對 MDA-MB-231細胞凋亡有一定的誘導(dǎo)作用并且有濃度依賴性。

Tab 1 Effect of different concentrations ofgenistein on viability of MDA-MB-231 cells (±s，n=3)

**P<0.01vscontrol

Fig 1 Effect of genistein on morphologyin MDA-MB-231 cells(×200)

A: Control group; B:25 μmol·L-1genistein; C: 50 μmol·L-1genistein; D:100 μmol·L-1genistein

2.3qRT-PCR法觀察金雀異黃酮對MDA-MB-231細胞EGFRmRNA表達的影響如Fig 3所示，不同濃度的金雀異黃酮(0、25、50、100 μmol·L-1)作用MDA-MB-231細胞36 h，與對照組相比，隨著金雀異黃酮濃度升高，EGFR mRNA 表達量逐漸下降，并呈現(xiàn)量效趨勢(P<0. 01)。提示金雀異黃酮誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡可能和下調(diào)EGFR相關(guān)。

2.4金雀異黃酮對MDA-MB-231細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響如Fig 4所示，與對照組相比，金雀異黃酮作用36 h，Bcl-2蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01)，Bax蛋白表達明顯升高(P<0.01)，caspase-3蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.01)。提示金雀異黃酮對促凋亡蛋白具有明顯的誘導(dǎo)作用。

Fig 2 Effect of MDA-MB-231 cells treated bydifferent concentrations of genistein on cell apoptosis

**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

Fig 3 Effect of genistein on MDA-MB-231 cellEGFR mRNA expression

**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1).

2.5金雀異黃酮對MDA-MB-231細胞EGFR/PI3K/Akt通路蛋白的影響如Fig 5所示，與對照組相比，金雀異黃酮呈濃度依賴性抑制 EGFR、Akt、p-Akt蛋白的表達(P<0.01)。如Fig 6所示，與對照組相比，胰島素(100 μg·L-1)可以激活上調(diào)p-Akt蛋白表達水平(P<0.01)，在胰島素基礎(chǔ)上加入金雀異黃酮(100 μmol·L-1)，可明顯降低 Akt和p-Akt蛋白的表達強度(P<0.01)，提示金雀異黃酮可以抑制EGFR/PI3K/Akt信號通路。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的癌癥，2017年美國新發(fā)病例約為252 710例；在中國大陸，2015年新發(fā)病例達268 600例，可見世界范圍內(nèi)女性乳腺癌呈逐年上升趨勢[7-8]。三陰乳腺癌是乳腺癌的一種特殊亞型，由于它對目前常用的成熟的內(nèi)分泌治療及針對HER2基因的分子靶向治療均無效，其主要非手術(shù)治療方法為全身化療，但全身化療常有不同程度的毒副作用，導(dǎo)致部分患者無法耐受或無法完成整個治療周期。中醫(yī)中藥治療癌癥早有相關(guān)記載，無論是與化療藥合用還是單獨用藥，都具有減輕化療藥毒副作用、提高生活質(zhì)量、治療兼顧整體與個體化等優(yōu)勢[9-11]。

Fig 4 Effect of genistein on expression of apoptosis relatedproteins in MDA-MB-231 cells by Western blot

**P<0.01vscontrol(0 μmol·L-1)

Fig 5 Effect of genistein on expression of EGFR, Akt, p-Akt proteins in MDA-MB-231 cells by Western blot

**P<0.01vscontrol (0 μmol·L-1)

Fig 6 Effect of genistein on expression of Akt, p-Akt proteinsin MDA-MB-231 cells by Western blot

**P<0.01vscontrol

細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡，是指在自身或外界因素作用下，由細胞自身基因調(diào)控的一種主動的、有序性細胞死亡形式[12]。在腫瘤治療中，誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡是許多化療藥物發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的重要機制之一。線粒體凋亡通路是主要的途徑，Bax 是 Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，細胞受到損傷時，大量的細胞內(nèi)信號引起前凋亡蛋白 Bax 的活化，Bax 轉(zhuǎn)位到線粒體表面，增加線粒體通透性，導(dǎo)致細胞色素 C 外漏，從而激活線粒體細胞凋亡途徑，形成凋亡小體[13]。我們研究結(jié)果顯示，金雀異黃酮可明顯抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞增殖，誘導(dǎo)細胞大量發(fā)生凋亡，明顯下調(diào)凋亡蛋白Bcl-2和上調(diào)Bax、caspase-3蛋白的表達水平，提示金雀異黃酮具有很強抗腫瘤生物活性，與文獻報道一致[14-15]。研究顯示，磷酯酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)是細胞生長、代謝、凋亡等生物學(xué)行為的重要調(diào)節(jié)通路，有越來越多證據(jù)表明PI3K/Akt參與許多惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16-17]。因此，抑制PI3K/Akt通路即可以抑制腫瘤的生長或發(fā)展。在我們的研究中，金雀異黃酮可以明顯抑制Akt、p-Akt蛋白表達水平，使用其激活劑胰島素(100 μg·L-1)盡管可以激活上調(diào)p-Akt蛋白表達水平，但加入金雀異黃酮(100 μmol·L-1)后，又會明顯降低 Akt和p-Akt蛋白的表達強度，提示金雀異黃酮可以明顯抑制PI3K/Akt通路的信號傳導(dǎo)。

人表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)家族主要由EGFR、HER2、HER3 和 HER4等4個不同的受體酪氨酸激酶組成，是一種大分子跨膜糖蛋白。乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞盡管不表達ER、PR、HER2等受體，但有EGFR表達[18]。現(xiàn)已證實，在人類多種惡性腫瘤組織和腫瘤細胞株中，存在著 EGFR表達和功能的異常[19]。一旦EGFR過度表達，下游信號傳導(dǎo)增強，細胞增殖就會處于失控狀態(tài)，從而導(dǎo)致細胞癌變。因此，EGFR被認為是抗腫瘤藥物的分子靶點之一。我們的研究顯示，金雀異黃酮明顯下調(diào)乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞基因和蛋白水平的EGFR表達，說明金雀異黃酮是可以抑制EGFR表達的，而PI3K/Akt是EGFR跨膜傳遞信號的其中一條下游通路，故我們推測EGFR/PI3K/Akt是金雀異黃酮發(fā)揮抗腫瘤作用的可能機制之一。事實上，在其他腫瘤治療中，EGFR/PI3K/Akt已證實是抗腫瘤作用的機制之一[20-21]。

綜上所述，本研究顯示金雀異黃酮可誘導(dǎo)三陰乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡，其機制可能與抑制EGFR/PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，為開發(fā)金雀異黃酮治療乳腺癌提供實驗和理論參考。

(致謝：本實驗于廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心完成，感謝實驗室老師和同學(xué)的指導(dǎo)和幫助！)

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EffectsofgenisteinonapoptosisandEGFR/PI3K/Aktsignaltransductionpathwayintriple-negativebreastcancerMDA-MB-231cells

WEI Li-qun1, LI Wan-ting1, LI Tong2, XU Cheng-fei2,TANG Shuang-yi3, GAN Jia-liang2

(1.SchoolofPharmaceuticalScience; 2.DeptofColorectalandAnalSurgery,FirstAffiliatedHospital; 3.DeptofPharmacy,FirstAffiliatedHospital,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

AimTo investigate the effect of genistein on apoptosis in triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells and the underlying mechanisms.MethodsMTT assay was used to detect the inhibition rate on breast cancer MDA-MB-231 cells of genistein. Hoechst 33258 staining was applied to determine the effect of genistein on morphology of MDA-MB-231 cells. qRT-PCR was employed to detect the mRNA expression of EGFR in MDA-MB-231 cells. Western blot was utilized to determine the expression of Bcl-2, Bax, caspase-3, EGFR, Akt, and p-Akt. The expressions of Akt and p-Akt proteins in breast cancer MDA-MB-231 cells were detected after treated with Akt activator insulin, genistein and in combination with insulin.ResultsGenistein inhibited the viability of breast cancer MDA-MB-231 cells in a time-dependent manner. The results of Hoechst 33258 staining showed a typical apoptotic morphological changes of MDA-MB-231 cells after treatment of genistein for 36 h. qRT-PCR showed that the mRNA expression of EGFR in MDA-MB-231 cells decreased after treated with genistein for 36 h. The expression levels of Bcl-2, EGFR, Akt, p-Akt, ERK, p-ERK were significantly down-regulated(P<0.01) compared with control. While, the expression of Bax, caspase-3 was significantly up-regulated (P<0.01). It was observed that p-Akt was significantly activated after the treatment of Akt activator insulin (P<0.01), however, significantly down-regulated (P<0.01) when treated with genistein.ConclusionGenistein could inhibit the growth of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells and induce apoptosis, which probably involves regulating EGFR/PI3K/Akt signaling pathway.

genistein; triple-negative breast cancer; apoptosis; proliferation; epidermal growth factor receptor; EGFR/PI3K/Akt signaling pathway

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.010

A

：1001-1978(2017)10-1376-06

R284.1；R329.24；R329.25；R392.11；R737.9；R977.1

時間：2017-9-5 9:25 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.020.html

2017-04-25,

2017-07-28

廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目(No YCSW2017110)；廣西高校科學(xué)技術(shù)研究項目(No 2013ZD015)

韋立群(1992-)，女，碩士生，研究方向：臨床藥理學(xué)的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:wwllqq1992@163.com； 唐雙意(1975-)，女，碩士，副主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：臨床藥理學(xué)的基礎(chǔ)與臨床，通訊作者，E-mail: tshy369@sina.com； 甘嘉亮(1972-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)與臨床，通訊作者，E-mail: gjl259@126.com