桃葉珊瑚苷對UVA致ESF—1細胞光老化保護作用的代謝組學研究

李雪　雷雪雪　徐紅丹

[摘要] 目的 采用高通量細胞代謝組學技術分析桃葉珊瑚苷干預光老化ESF-1細胞的效應機制和有效作用靶點。 方法 細胞UVA損傷模型法制備光老化細胞模型，給予低中高不同劑量的桃葉珊瑚苷DMEM培養(yǎng)液進行干預，通過檢測細胞所含總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）的活性和含量評價光老化ESF-1細胞模型的氧化損傷情況及桃葉珊瑚苷對模型的干預作用。在此基礎上基于高分辨質(zhì)譜技術對正常細胞、光老化細胞及桃葉珊瑚苷干預后的細胞進行高通量的代謝足跡分析。通過模式識別技術對海量的數(shù)據(jù)采取降維處理和多元統(tǒng)計分析。 結(jié)果 與空白組相比，模型組細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性明顯降低，MDA含量明顯升高（P < 0.01）；與模型組相比，給藥組能提高SOD、GSH-Px、CAT活性，降低MDA含量，其中中、高劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。光老化細胞代謝與空白組細胞存在顯著性差異，發(fā)生擾亂的代謝主要集中在花生四烯酸代謝、谷胱甘肽代謝。通過聚焦分析發(fā)現(xiàn)了6個核心的生物標志物，且這些小分子代謝產(chǎn)物在給予桃葉珊瑚苷干預后都發(fā)生了有效的回調(diào)。 結(jié)論 桃葉珊瑚苷對光老化有很好的治療作用，其作用機制可能與花生四烯酸代謝機制相關，本研究為早期預防和藥物研發(fā)提供了新思路和新方法。

[關鍵詞] 代謝組學；模式識別；桃葉珊瑚苷；光老化；生物標志物

[中圖分類號] R96 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（a）-0025-05

[Abstract] Objective To analyze the mechanism and effective target of aucubin intervene photoaging ESF-1 cells by high through-put cell metabolomics. Methods Cell photoaging model was established by UVA cell injury method， then given low medium and high dose aucubin DMEM medium for the intervention. The activities and contents of total superoxide dismutase （T-SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， catalase （CAT）， malondialdehyde （MDA） were detected for the evaluation of oxidative damage and aucubin treatment effect. Based on above analysis and high resolution mass spectrometry， the high throughput metabolic footprint analysis was conducted in the normal cells， photoaging ESF-1 cells and aucubin intervention cell. Massive metabolic data were analzyed with dimension reduction process and multivariate statistics by model discriminating technique. Results Compared with the blank group， the activities of SOD， GSH-Px， CAT significantly decreased and contents of MDA significantly increased in the model group （P < 0.01）. Compared with the model group， the activities of SOD， GSH-Px， CAT increased and contents of MDA decreased in the medication gorups， of which， in the medium and high doses medication groups the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. There were significant differences in the metabolism between the normal cells and the photoaging ESF-1 cells， and the disturbance of metabolism was mainly concentrated in arachidonic acid metabolism， glutathione metabolism. 6 core biomarkers were identified by focusing analysis， and these small molecular metabolites were callback after the administration of aucubin. Conclusion Aucubin has a favorable effect on photoaging， and the mechanism may be related to arachidonic acid metabolism. Besides， the present investigation provides new ideas and methods for early prevention and drug development.endprint

[Key words] Metabolomics； Pattern recognition； Aucubin； Photoaging； Biomarker

隨著環(huán)境的日益惡化及大氣層的破壞，輻射地球的紫外光（UV）照射強度越來越大，這致使其對皮膚組織的氧化損傷日益嚴重，并導致光老化等一系列皮膚問題[1-6]。目前，UV輻射對健康的危害已成為全球關注的重大環(huán)境與健康問題之一，從天然產(chǎn)物中提取有效成分對其進行干預也是防止光老化的熱點研究之一[7-17]。杜仲藥材為金縷梅亞綱、杜仲目、杜仲科、杜仲屬植物的干燥莖皮，在我國有2000余年的藥用歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品。相關研究表明，杜仲對由紫外照射的皮膚光老化有很好的保護作用。桃葉珊瑚苷作為杜仲有效成分，具有保肝、抗癌、解毒、抗氧化等功效。本研究基于高通量的代謝組學技術靶向性分析杜仲所含有效成分桃葉珊瑚苷對光老化ESF-1細胞干預作用，為闡明光老化代謝機制和桃葉珊瑚苷作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX Triple QuadTM3500（美國AB SCIEX公司），XPE105分析天平（瑞士梅特勒托利多），RT-9000半自動生化分析儀（美國雷杜公司），人皮膚成纖維細胞ESF-1（北京協(xié)和醫(yī)學院細胞資源中心），DMEM培養(yǎng)基，超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程公司），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程公司），過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程公司），丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程公司），桃葉珊瑚苷標準品（上海銳谷生物科技有限公司）。

1.2 給藥溶液配制

將桃葉珊瑚苷加入DMEM培養(yǎng)液中，配制成高（4×10-5 mol/L）、中（4×10-6 mol/L）、低（4×10-7 mol/L）3個濃度，調(diào)pH值為7.0，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

1.3 ESF-1細胞體外培養(yǎng)

ESF-1細胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的10%胎牛血清DMEM。取對數(shù)生長期細胞以胰酶消化，調(diào)整其密度為1×106個/mL接種于6孔板、5×104個/mL接種于96孔板。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞UVA損傷模型的建立 參考文獻[18]方法，空白組給予遮蔽處理。

1.4.2 實驗分組 細胞隨機分為空白組、模型組、給藥組?？瞻捉M細胞給予DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；模型組和給藥組細胞給予DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，按照“1.4.1”項下方法進行模型制備，且給藥組給予含不同濃度（4×10-5、4×10-6、4×10-7 mol/L）桃葉珊瑚苷的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.3 氧化損傷指標檢測 給藥24 h后收集6孔板中各組細胞，用冷PBS清洗2次，超聲破碎，嚴格按試劑盒說明流程檢測細胞所含總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）的活性及含量。

1.4.4 細胞提取 取對數(shù)期生長細胞，棄培養(yǎng)基，以生理鹽水清洗細胞3遍，液氮淬滅后加入1.5 mL的甲醇-水（4∶1，v/v）溶液，細胞刮刀取下細胞，并置入1.5 mL離心管中渦旋，超聲破碎細胞。細胞破碎后4℃ 4000 r/min離心15 min。取上清液氮氣吹干，100 μL 0.1%甲酸復溶。

1.4.5 分析條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）（Waters集團公司，美國）；流動相分別為0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液；柱溫40℃；流速0.4 mL/min；進樣量為2 μL；色譜梯度為0～10 min，50%B～60%B、10～13 min，60%～65%B、13～15 min，65%～99%B。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI），ESI+模式毛細管電壓設定為3.0 kV，錐孔電壓為30 V；ESI-模式毛細管電壓設定為3.0 kV，錐孔電壓為30 V。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理及生物標志物鑒定 原始數(shù)據(jù)通過代謝組學最新權威數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)XCMS進行數(shù)據(jù)預處理，對色譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行峰對齊、歸一化等基礎性處理后，導入SIMCA-13用于模式識別運算，結(jié)合VIP值篩選對分組貢獻率大的內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物。最終通過Metline、HMDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫進行檢索和比對以鑒定生物標志物。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 桃葉珊瑚苷對ESF-1細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響

UVA照射及不同劑量桃葉珊瑚苷對ESF-1細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響見表1。與空白組相比，模型組細胞中SOD、GSH-Px、CAT活性明顯降低，MDA含量明顯升高（P < 0.01）；與模型組相比，給藥組能提高SOD、GSH-Px、CAT活性，降低MDA含量，其中中、高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。

2.2 代謝組學研究

主成分分析得分圖顯示，空白組、模型組和高、中、低給藥組的組內(nèi)聚類良好，組間分離明顯（圖1）?？瞻捉M和模型組組間分離明顯，證明兩組細胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物具有極大差異，可能由光老化因素誘導產(chǎn)生。發(fā)生擾亂的代謝主要集中在花生四烯酸代謝、谷胱甘肽代謝。不同劑量給藥組處于空白組和模型組之間，證明藥物的干預對光老化細胞有很好的回調(diào)作用。endprint

采用正交偏最小二乘判別分析篩選空白組和模型組組間對分組具有顯著性貢獻的小分子代謝產(chǎn)物作為潛在生物標志物（圖2～3）。選取重要變量投影值>3，進一步通過相關數(shù)據(jù)庫檢索進行比對，鑒定了6個光老化潛在生物標志物，根據(jù)細胞代謝所涉及的生物學信息構(gòu)建光老化ESF-1細胞的代謝網(wǎng)絡（圖4）。

3 討論

隨著環(huán)境污染問題的日益嚴重，紫外光輻射等問題日益加劇，這其中光老化是嚴重影響生活質(zhì)量的重要因素之一。單純從皮膚表面增白角度入手難以達到根治，中藥因多成分多靶點協(xié)同起效、副作用小等優(yōu)勢在治療慢性病或調(diào)解亞健康狀態(tài)方面有很好的效果。近年來應用杜仲干預由紫外線誘導的皮膚光老化效果明顯，且國內(nèi)外研究表明花生四烯酸代謝與光老化密切相關[19-21]。目前已知白三烯（LTB4）是參與光老化過程中的重要炎癥介質(zhì)[22]，其經(jīng)5-LOX代謝后產(chǎn)生花生四烯酸，即為花生四烯酸產(chǎn)生的限速酶。皮膚角質(zhì)層細胞由于缺乏5-LOX，不能單獨產(chǎn)生LTB4。本實驗發(fā)現(xiàn)，紫外線可能作為誘導5-LOX增加的因素，使LTB4升高，導致花生四烯酸含量代謝異常。

谷胱甘肽代謝為本次發(fā)現(xiàn)的重要通路之一，結(jié)合GSH-Px試劑盒活性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光老化細胞內(nèi)的還原性谷胱甘肽酶活性不高，這可能與紫外光輻射后胞內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷有關[23-30]。大量的還原態(tài)代謝酶用于修復氧化性損傷，故活性降低，細胞代謝組學研究與試劑盒結(jié)果相一致，推斷上述代謝機制發(fā)生與光老化密切相關。

代謝組學作為系統(tǒng)生物學的重要分支，因其具有的整體性、動態(tài)性與中醫(yī)藥理論相一致，近年來在解讀中醫(yī)藥癥候理論和方劑配伍作用方面有較為廣泛的應用。本研究首次依托細胞代謝組學技術針對性研究紫外線誘導的光老化ESF-1細胞的發(fā)病機制，以期為光老化藥物作用靶點研究和相關產(chǎn)品的基礎研究奠定實驗基礎。

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（收稿日期：2017-05-02 本文編輯：程 銘）endprint