人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)動脈介入治療2型糖尿病Beagle犬的作用

董松　王鴻　雷蕾

[摘要] 目的 探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSCs）經(jīng)動脈介入植入對2型糖尿病Beagle犬的治療作用。 方法 將24只Beagle犬隨機(jī)分為UCMSCs治療組（治療組，n = 11），糖尿病模型對照組（模型組，n = 8）和正常對照組（正常組，n = 5）。治療組和模型組高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合靜脈注射四氧嘧啶建立2型糖尿病模型。治療組進(jìn)行胰島素聯(lián)合UCMSCs動脈介入治療，模型組僅接受胰島素治療，正常組不接受任何治療。熒光顯微鏡下觀察CM-Dil標(biāo)記的UCMSCs在組織中的分布，比較三組治療前后體質(zhì)量、血脂、空腹血糖、胰島素用量、C肽曲線下面積、胰島素分泌指數(shù)（HOMA-β），胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的變化。 結(jié)果 CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞主要分布在胰腺及腎臟內(nèi)。治療組在UCMSCs治療后第4周空腹血糖開始下降，胰島素用量減少，至治療后第12周，平均每日胰島素用量由治療前的（27.94±1.86）U降至（15.02±2.90）U。與模型組比較，治療組在治療后12周三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、HOMA-IR減低（P < 0.05），C肽曲線下面積、HOMA-β升高（P < 0.05）。 結(jié)論 UCMSCs經(jīng)動脈介入治療2型糖尿病犬，可最大限度地保證干細(xì)胞植入胰腺的數(shù)量，有效改善糖脂代謝紊亂，減少胰島素用量，恢復(fù)胰島β細(xì)胞功能，減輕胰島素抵抗。

[關(guān)鍵詞] 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；動脈介入；2型糖尿病；胰島功能；胰島素抵抗

[中圖分類號] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（a）-0016-05

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells （UCMSCs） transplanted into a dog model of type 2 diabetes mellitus （T2DM） via the arterial intervention. Methods 24 Beagle dogs were randomly divided into UCMSCs treatment group （treatment group， n = 11）， diabetic model control group （model group， n = 8） and normal control group （normal group， n = 5）. Dogs in treatment and model control group were fed on high fat diet and intravenously injected with alloxan to establish T2DM models. Treatment group accepted insulin therapy and UCMSCs transplantation via arterial intervention. Model group only received insulin therapy， and normal group did not receive any treatment. Distribution of UCMSCs traced by CM-Dil was observed under fluorescence microscope. In addition， the three groups were compared with body mass， blood fat， fasting plasma glucose， insulin dosage， Area under the curve of C-peptide， insulin secretion index （HOMA-β）， insulin resistance index （HOMA-IR） before and after therapy. Results The cells traced by CM-Dil mainly distributed in the pancreas and kidney. At 4 weeks after transplantation， fasting plasma glucose and insulin dosage were decreased gradually in treatment group ， up to 12 weeks average daily insulin dose was declined from （27.94±1.86） U to （15.02±2.90） U. Compared with the model group， at 12 weeks triglyceride， low density lipoprotein cholesterol， HOMA-IR decreased （P < 0.05）， under the curve of C-peptide， HOMA-β increased in treatment group （P < 0.05）. Conclusion The method of translation of UCMSCs by artery intervention not only maximum guarantee the stem cells quantity into the pancreas ， but also has great effects on reversing glucose and lipid metabolism disorder， recovering islet β cell function， decreasing insulin dosage， and relieving insulin resistance.endprint

[Key words] Umbilical cord mesenchymal stem cells； Arterial intervention； Type 2 diabetes mellitus； Islet function； Insulin resistance

2型糖尿?。═2DM）的病理生理基礎(chǔ)是胰島β細(xì)胞功能缺陷和胰島素抵抗，通過干細(xì)胞治療實(shí)現(xiàn)胰島再生，從根本上挽救和恢復(fù)胰島功能，減輕胰島素抵抗，成為探索治療T2DM新方法的焦點(diǎn)。近年來，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSCs）成為治療糖尿病的重要細(xì)胞來源，其應(yīng)用于糖尿病治療尚處于探索階段，Beagle犬作為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動物，具有遺傳性狀穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，本研究首次將UCMSCs經(jīng)動脈介入的方式植入2型糖尿病Beagle犬模型體內(nèi)，觀察干細(xì)胞在體內(nèi)各器官的分布，探討UCMSCs治療對糖代謝、脂代謝、胰島β細(xì)胞功能和胰島素抵抗的作用，為UCMSCs治療T2DM的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 18～20個月健康成年雄性Beagle犬24只，體重（15.0±0.9）kg，由北京芳元緣養(yǎng)殖場提供，動物合格證號：SCXK（京）2009-0014。

1.1.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 由北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室制備并提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 將實(shí)驗(yàn)犬隨機(jī)分為UCMSCs治療組（治療組，n = 11），糖尿病模型對照組（模型組，n = 8）和正常對照組（正常組，n = 5）。

1.2.2 2型糖尿病 beagle犬模型的建立 采用SPF級飼養(yǎng)，治療組和模型組高脂飼料喂養(yǎng)4周（20%蛋白質(zhì)、27%碳水化合物、53%脂肪），然后犬禁食12 h，自由飲水，取新鮮配制的四氧嘧啶溶液（200 g/L）以50 mg/kg經(jīng)犬下肢淺靜脈注射，48 h后監(jiān)測隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L至少2次表明造模成功。正常組僅給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)4周（27%蛋白質(zhì)、38%碳水化合物、35%脂肪）。

1.2.3 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備和流式鑒定[1] 在GMP標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，采用UltraCultureTM培養(yǎng)基用直接貼壁法進(jìn)行UCMSCs的擴(kuò)增培養(yǎng)。取培養(yǎng)的第3代細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，PBS液洗滌2次后重懸細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為1×109/L。取出上述細(xì)胞懸液100 μL加入檢測管中，分別加入流式單抗CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-APC、CD73-PE、CD34-PE及同型對照抗體IgG1-FITC、IgG1-PE，常溫避光靜置30 min，PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測其表型。

1.2.4 CM-Dil標(biāo)記人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 將CM-Dil溶于二甲基亞砜（DMSO）中配制成1 g/L的保存液，再稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/L工作液。取細(xì)胞懸液（1×109/L）每毫升加5 μL CM-Dil工作液，37℃孵育5 min后，4℃冰箱放置15 min，PBS洗滌2次，生理鹽水重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010/L。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)犬的治療方法 治療組和模型組實(shí)驗(yàn)犬每日給予胰島素皮下注射治療，定時監(jiān)測血糖，根據(jù)血糖變化調(diào)整并記錄胰島素用量。血糖控制目標(biāo)值：空腹血糖≤7.0 mmol/L，餐后2小時血糖≤10.0 mmol/L。胰島素治療2周后治療組犬進(jìn)行UCMSCs的動脈介入植入，從犬的右側(cè)股動脈穿刺，將動脈導(dǎo)管插入供應(yīng)胰腺的動脈分支，數(shù)字剪影血管造影證實(shí)后，經(jīng)導(dǎo)管注入CM-Dil標(biāo)記的細(xì)胞懸液10 mL。模型組及對照組僅在同等條件下注入10 mL生理鹽水。

1.2.6 觀察指標(biāo) UCMSCs植入前24 h及植入后12周，各組犬分別稱重，并抽取空腹靜脈血檢測血糖、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。并以50%葡萄糖1.75 g/kg灌胃，分別于0、0.5、1、2、3 h抽取靜脈血，采用羅氏Cobas e411電化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行C肽檢測，計算C肽曲線下面積、HOMA-β、HOMA-IR。計算方法：C肽曲線下面積=0.25C0 min+0.5C30 min+0.75C60 min+C120 min+0.5C180 min；HOMA-β=270×FCP/0.333/（FPG-3.5）；HOMA-IR=1.5+FPG×FCP/（2.8×0.333）（FPG：空腹血糖；FCP：空腹C肽）。

1.2.7 CM-Dil熒光示蹤觀察干細(xì)胞分布 UCMSCs植入后4周，治療組處死3只實(shí)驗(yàn)犬，迅速取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺等組織，進(jìn)行連續(xù)冰凍切片，用含DAPI的抗淬滅劑封固，標(biāo)染各組織細(xì)胞核。3～5 min后熒光顯微鏡下觀察CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞在各器官中的分布。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCMSCs的鑒定結(jié)果

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，干細(xì)胞表面CD44（99.86%）、CD73（99.80%）、CD105（99.8%）呈高表達(dá)，CD34（0.20%）、CD45（0.79%）呈低表達(dá)，符合UCMSCs表面標(biāo)志表達(dá)。

2.2 CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞在各器官的分布情況

熒光顯微鏡下觀察可見治療組CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞主要分布在胰腺及腎臟內(nèi)，在心臟、肝臟、脾臟、肺臟中也可見少量分布。見圖1。endprint

2.3 UCMSCs治療前后體質(zhì)量和血脂的變化

與正常組相比，治療前模型組和治療組體質(zhì)量增加，TG、TC、LDL-C升高，HDL-C降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），而模型組和治療組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。與治療前相比，治療后模型組TG減低（P < 0.05），治療組TG、TC、LDL-C均有減低（P < 0.05）。與模型組相比，治療組在治療后TG、LDL-C下降更明顯（P < 0.05）。見表1。

2.4 UCMSCs治療前后空腹血糖及胰島素用量的變化

模型組和治療組Beagle犬經(jīng)胰島素治療后血糖均明顯下降，治療組在UCMSCs治療后第4周出現(xiàn)空腹血糖明顯低于目標(biāo)值，每日胰島素用量逐漸減少。模型組空腹血糖在偏高水平波動，胰島素用量變化不明顯。至UCMSCs治療后第12周，治療組每日胰島素用量已由治療前的（27.94±1.86）U降至（15.02±2.90）U，其每日胰島素用量與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2～3。

2.5 UCMSCs治療前后胰島β細(xì)胞功能和胰島素抵抗的變化

與正常組相比，治療前模型組和治療組C肽曲線下面積、HOMA-β明顯減低，HOMA-IR升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），而模型組和治療組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。與治療前相比，治療組在治療后C肽曲線下面積、HOMA-β明顯改善，HOMA-IR明顯減低（P < 0.05），但三者均未恢復(fù)到正常組水平（P < 0.05）。與模型組相比，治療組在治療后C肽曲線下面積、HOMA-β明顯升高，HOMA-IR減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

3 討論

近年來，應(yīng)用干細(xì)胞技術(shù)重建功能型胰島β細(xì)胞總量，挽救和恢復(fù)胰島β細(xì)胞功能，減輕胰島素抵抗，有望從根本上解決T2DM的病理生理缺陷和代謝紊亂，防止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。研究[2-4]發(fā)現(xiàn)UCMSCs是存在于臍帶華通膠、血管及其周圍組織中的多能干細(xì)胞，其來源豐富，易于分離純化，低免疫原性，分化增殖能力強(qiáng)，不存在倫理學(xué)問題，目前已成為干細(xì)胞治療糖尿病研究的重要細(xì)胞來源。本研究中對所分離純化的細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定結(jié)果顯示，UCMSCs表面標(biāo)志（CD44、CD73、CD105）呈高表達(dá)，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志（CD34、CD45）呈低表達(dá)，符合UCMSCs特征，證實(shí)應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)研究的是均一的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

目前干細(xì)胞治療糖尿病的基礎(chǔ)研究大多數(shù)選擇嚙齒類動物模型，將干細(xì)胞通過靜脈、腎被膜下、胰腺被膜下、肝實(shí)質(zhì)內(nèi)注射等方式植入糖尿病動物模型體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)胰腺被膜下植入效果優(yōu)于其他途徑[5-6]，但對大型動物模型的干細(xì)胞最佳植入途徑研究罕見，王麗梅等[7]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)動脈介入植入糖尿病犬體內(nèi)，較好地保證了植入細(xì)胞大量集中定居在胰腺局部。本研究中，首次選擇了T2DM Beagl犬模型，其更能接近人體生理狀態(tài)，將UCMSCs經(jīng)動脈導(dǎo)管靶向植入供應(yīng)胰腺的動脈分支內(nèi)，該方法操作簡單、安全、創(chuàng)傷小，CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞主要分布在胰腺和腎臟內(nèi)，有效提高了植入細(xì)胞在胰腺局部的濃度，從而促進(jìn)UCMSCs在胰腺微環(huán)境中發(fā)揮各種作用，是值得臨床推廣的干細(xì)胞植入方式。在犬糖尿病模型體內(nèi)，胰腺組織受四氧嘧啶作用后短時間內(nèi)大量破壞，受損組織高表達(dá)SDF-1等多種趨化因子，促進(jìn)植入干細(xì)胞向胰腺進(jìn)一步歸巢。但由于在造模過程中四氧嘧啶對糖尿病犬可能造成一定的腎臟損傷，趨化作用使腎臟也出現(xiàn)了較多干細(xì)胞分布，這可能與生理狀態(tài)下干細(xì)胞在2型糖尿病患者體內(nèi)的分布存在差異。

大量研究[8-11]顯示HCMSCs具有強(qiáng)的增殖和分化能力，可在體外誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞，這種胰島樣細(xì)胞對血糖刺激敏感，能夠分泌胰島素，還能表達(dá)多種胰島細(xì)胞基因。經(jīng)HCMSCs治療的T2DM大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白明顯下降，空腹C肽和β細(xì)胞數(shù)量增加[12]。間充質(zhì)干細(xì)胞輸注還可能通過促進(jìn)內(nèi)源性胰島β細(xì)胞增殖[13-15]、調(diào)節(jié)胰島微環(huán)境[16]、免疫調(diào)節(jié)[17-18]等作用改善高血糖，恢復(fù)胰島功能。在本研究中接受UCMSCs治療的糖尿病犬在植入后第4周血糖開始逐漸下降，外源性胰島素用量也相應(yīng)逐漸減少。至植入后第12周每日平均胰島素用量減至治療前的53.76%，C肽曲線下面積、HOMA-β明顯改善，再次表明將UCMSCs經(jīng)動脈介入的方法治療T2DM可以有效減低血糖，逆轉(zhuǎn)胰島β細(xì)胞功能。

研究發(fā)現(xiàn)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植至T2DM大鼠體內(nèi)，可通過增加組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）的表達(dá)和增強(qiáng)胰島素受體底物1（IRS-1）和Akt（蛋白激酶B）磷酸化，促進(jìn)胰島受體與胰島素的結(jié)合，減輕了胰島素抵抗[19-20]。UCMSCs治療對T2DM胰島素抵抗作用的研究較少，李麗等[21]通過靜脈輸注HCMSCs逆轉(zhuǎn)了糖尿病模型大鼠的高血糖，改善體質(zhì)量，空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)顯著下降。本研究中與模型組相比，UCMSCs治療后12周TG、LDL-C明顯下降，HOMA-IR明顯降低，進(jìn)一步提示UCMSCs治療有效改善了2型糖尿病犬的脂代謝紊亂，同時減輕了胰島素抵抗，從而促進(jìn)糖代謝紊亂的恢復(fù)。

綜上所述，將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)動脈介入移植入糖尿病犬胰腺內(nèi)，不僅最大限度地保證干細(xì)胞植入胰腺局部的數(shù)量，還可以有效改善糖尿病犬的高血糖、高血脂狀態(tài)，減少胰島素用量，恢復(fù)胰島β細(xì)胞功能，減輕胰島素抵抗，具有很好的臨床應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2017-02-07 本文編輯：蘇 暢）endprint