沉默?；o酶A—膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1基因?qū)θ饲傲邢侔┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響

陳心　徐細(xì)明　甘園園

[摘要] 目的 觀察ACAT1在人前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖和侵襲遷移中的作用。 方法 體外培養(yǎng)人前列腺癌PC-3細(xì)胞，通過脂質(zhì)體HiperFect將ACAT1 siRNA轉(zhuǎn)染至人前列腺癌PC-3細(xì)胞中沉默?；o酶A-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1（ACAT1）基因的表達(dá)，Real-time PCR驗(yàn)證沉默的效果。利用CFSE染色法分別檢測加入無血清1640培養(yǎng)基的空白對照組、加入陰性-siRNA-HiperFect復(fù)合物的陰性對照組和加入ACAT1 siRNA-HiperFect復(fù)合物的ACAT1組人前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖率，比較ACAT1基因沉默前后細(xì)胞增殖的變化。利用Transwell小室法檢測ACAT1基因沉默前后人前列腺癌PC-3細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。 結(jié)果 與空白對照組和陰性對照組比較，ACAT1 siRNA組轉(zhuǎn)染48 h ACAT1 mRNA表達(dá)水平最低（P < 0.05）。與陰性對照組和空白對照組比較，ACAT1 siRNA組細(xì)胞增殖率下降，侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)中穿膜細(xì)胞數(shù)減少，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。陰性對照組與空白對照組比較，細(xì)胞增殖率、侵襲和遷移能力無變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 ACAT1基因干擾能抑制PC-3細(xì)胞的增殖，減弱侵襲遷移能力，為探尋前列腺癌發(fā)病機(jī)制和治療提供新的思路和手段。

[關(guān)鍵詞] 前列腺癌；?；o酶A-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1；小干擾RNA；生物學(xué)行為

[中圖分類號(hào)] R734 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）08（a）-0004-05

[Abstract] Objective To observe the effect of ACAT1 on human prostate cancer cells proliferation， invasion and migration. Methods Human prostate cancer cells （PC-3 cells） were cultured， then the expression of ACAT1 gene in PC-3 cells were interfered using Hiperfect transfection reagent， the expression of ACAT1 gene before and after transfection was detected by Real-time PCR. The proliferation rates of PC-3 cells in the blank control group （serum-free 1640 medium added）， the negative control group （negative-siRNA-HiperFect complex added） and the ACAT1 group （ACAT1 siRNA-HiperFect complex added） were analyzed by CFSE staining. The changes of cell proliferation before and after ACAT1 gene silencing were compared. Transwell assays were used to evaluate the effect of ACAT1 gene interfering on cells migration and invasion. Results Compared with the blank control group and the negative control group respectively， ACAT1 mRNA expression level reached the lowest level after 48 hours in the ACAT1 siRNA group （P < 0.05）. In the ACAT1 siRNA group， compared with the blank control group and the negative control group， proliferation rate of PC-3 cell decreased， the numbers of invasive cell and migration cell reduced， the differences were statistically significant （P < 0.01）. Compared between the blank control group and the negative control group， the differences in proliferation rate， invasion and migration ability of human prostate cancer PC-3 cells had no statistically significant （P > 0.05）. Conclusion ACAT1 siRNA reduces proliferation， migration and invasion of PC-3 cells， which maybe provide a new idea and strategy for pathogenesis and treatment of prostate cancer.

[Key words] Prostate cancer； Acyl coenzyme A cholesterol acyltransferase 1； Small interference RNA； Biology behaviorsendprint

前列腺癌是嚴(yán)重威脅男性健康的常見惡性腫瘤之一。在歐美發(fā)達(dá)國家，前列腺癌的死亡率僅次于肺癌[1]。在我國，雖然前列腺癌的發(fā)病率明顯低于美國，但是隨著國民生活水平的不斷提高，我國的前列腺癌發(fā)病率也在不斷提高[2]。大部分前列腺癌進(jìn)展緩慢，然而仍有部分患者因發(fā)展為侵襲性前列腺癌而死亡。因而，探尋前列腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療手段對于延長前列腺癌患者的生存時(shí)間和提高患者的生活質(zhì)量都十分重要。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，亞洲男性移民至歐美國家后，其罹患前列腺癌的概率大大升高，提示前列腺癌的發(fā)生與西方的飲食方式密切相關(guān)。在西方國家的大規(guī)模流行病學(xué)研究也證實(shí)了，大量動(dòng)物脂肪的攝入以及膽固醇代謝異常與前列腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[3-5]。體內(nèi)的動(dòng)物模型進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高脂飲食引起的高膽固醇血癥能促進(jìn)前列腺癌的轉(zhuǎn)移[6]。

?；o酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase，ACAT）是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上一種催化游離膽固醇與長鏈脂肪酸連接形成膽固醇酯的酶。ACAT有兩種形式同工酶：ACAT1和ACAT2。ACAT1在人體內(nèi)廣泛分布，內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腎臟、淋巴結(jié)以及前列腺上均有分布，而ACAT2則主要分布于小腸細(xì)胞和肝細(xì)胞上。有研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織較正常組織ACAT1表達(dá)明顯升高[7]。本研究通過RNA干擾技術(shù)觀察ACAT1基因干擾對人前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力的影響，闡明ACAT1在前列腺癌的發(fā)病機(jī)制中的作用，尋求可能的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清（美國Sigma公司），1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），ACAT1 siRNA和RNA提取試劑盒（美國Qiagen公司）， M-MLV cDNA合成試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（美國Invitrogen公司），CFSE細(xì)胞增殖試劑盒（賽默飛世爾科技公司），transwell小室（美國Corning公司），Matrigel膠（美國BD公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3購自武漢大學(xué)生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，細(xì)胞貼壁生長于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

PC-3細(xì)胞按5×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板，加入siRNA-HiperFect復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)分為三組，空白對照組加入無血清1640培養(yǎng)基；陰性對照組加入陰性-siRNA-HiperFect復(fù)合物；ACAT1組加入ACAT1 siRNA-HiperFect復(fù)合物。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24、48、72 h后分別收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

采用RNA提取試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，cDNA的制備使用M-MLV cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。SYBR Green Ⅰ熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。采用管家基因β-actin作為內(nèi)參，引物由美國Invitrogen公司合成，引物序列見表1。ACAT1反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃，10 min；94℃，30 s，55℃，1 min，72℃，2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃，延伸10 min。用β-actin作內(nèi)參照，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，10 min；95℃，30 s，57℃，1 min，72℃，2 min，共35循環(huán)；最后72℃，延伸10 min。在延伸的過程中搜集熒光信號(hào)，于每次擴(kuò)增的同時(shí)設(shè)置無cDNA的陰性對照。擴(kuò)增結(jié)果采用FTC2000熒光PCR儀自帶的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析程序?qū)Y(jié)果Ct值進(jìn)行分析，然后計(jì)算得出基因表達(dá)的倍數(shù)改變2-ΔΔCt，即ΔΔCt 陰性對照組=（CtACAT1- Ctβ-actin）陰性對照組-（CtACAT1- Ctβ-actin）空白對照組；ΔΔCt ACAT1組=（CtACAT1- Ctβ-actin） ACAT1組-（CtACAT1- Ctβ-actin）空白對照組。

1.5 CFSE標(biāo)記法檢測細(xì)胞的增殖能力

收集對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，加入CFSE至終濃度為5 μmol/L，置37℃培養(yǎng)箱，溫育10 min；然后加入等體積胎牛血清中和，離心；加入PBS洗滌2次，收集細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖狀況，F(xiàn)lowJo V10進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell體外實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

將Matrigel膠與無血清培養(yǎng)即按1∶3均勻地鋪在8 μm PCF細(xì)胞小室膜上，放入37℃培養(yǎng)箱中，孵育4～5 h使其凝結(jié)成膠狀。各組細(xì)胞用無血清1640培養(yǎng)基洗3次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至 5×105個(gè)/mL，transwell上層小室中加入200 μL細(xì)胞懸液（1×105個(gè)/孔）。24孔板的小室下層中加入500 μL含20%FBS的細(xì)胞上清。37℃培養(yǎng)箱中，孵育48 h。取出transwell小室，小心擦去小室底層膜和未穿膜的細(xì)胞，PBS沖洗小室膜3次，甲醛固定30 min，取出控干，加入結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡（400×）下計(jì)數(shù)上、下、左、右和中間5個(gè)視野的腫瘤細(xì)胞數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell體外實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

方法同“1.6”項(xiàng)下侵襲實(shí)驗(yàn)，不同在于上室中不鋪Matrigel基底膜。各組細(xì)胞用無血清1640培養(yǎng)基洗3次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/mL，transwell上層小室中加入200 μL細(xì)胞懸液（1×105 個(gè)/孔）。24孔板的小室下層中加入500 μL含20%FBS的細(xì)胞上清。37℃培養(yǎng)箱中，孵育48 h。取出transwell小室，小心擦去小室底層膜和未穿膜的細(xì)胞，PBS沖洗小室膜3次，甲醛固定30 min，取出控干，加入結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡（400×）下計(jì)數(shù)上、下、左、右和中間5個(gè)視野的腫瘤細(xì)胞數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。endprint

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后ACAT1 mRNA的表達(dá)

ACAT1 siRNA組PC-3細(xì)胞ACAT1 mRNA表達(dá)較空白對照組和陰性對照組明顯下降，24、48、72 h ACAT1 mRNA的表達(dá)分別為空白組的0.78、0.45、0.56倍，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），而空白對照組與陰性對照組ACAT1 mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。ACAT1 siRNA組中48 h與24 h轉(zhuǎn)染比較，ACAT1 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），但是72 h與48 h比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，采用48 h轉(zhuǎn)染。見表2。

2.2 ACAT1 siRNA對PC-3細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染ACAT1 siRNA后，PC-3細(xì)胞增殖率為（12.4±1.6）%，與空白對照組[（23.3%±2.1）%]和陰性對照組[（19.4%±1.6）%]比較下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；空白對照組與陰性對照組比較，細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），說明利用ACAT1 siRNA轉(zhuǎn)染沉默ACAT1基因的表達(dá)能抑制PC-3細(xì)胞的增殖。

2.3 ACAT1 siRNA對PC-3細(xì)胞侵襲和遷移的影響

如圖1、2所示，ACAT1 siRNA轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞后，與空白對照組和陰性對照組比較，PC-3細(xì)胞侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)量減少，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；空白對照組與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；說明抑制ACAT1基因的表達(dá)會(huì)降低PC-3細(xì)胞侵襲和遷移的能力。

3 討論

膽固醇是人體不可或缺的重要物質(zhì)，它不僅是細(xì)胞膜的重要組成成分，而且是合成維生素、甾體激素和膽汁酸的原料。研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇代謝的異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長或凋亡基因變化，從而刺激腫瘤發(fā)生發(fā)展[8]。關(guān)于膽固醇和前列腺癌關(guān)系的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇水平較低的患者進(jìn)展為高分級(jí)前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)較低，而體內(nèi)膽固醇含量高的患者更易罹患前列腺癌[9-10]。高膽固醇血癥是患高侵襲性前列腺癌的危險(xiǎn)因素[11]。膽固醇的含量不僅與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究還發(fā)現(xiàn)前列腺癌導(dǎo)致的死亡率與膽固醇含量也同樣相關(guān)[12]。利用他汀類的降脂藥可以降低高級(jí)別高侵襲性前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)展為激素抵抗性前列腺癌的過程中，膽固醇代謝發(fā)生了一系列的變化，作為雄激素合成原料的游離膽固醇增多，促使膽固醇入胞的酶和膽固醇合成的酶也都發(fā)生了改變[14]。人體內(nèi)膽固醇的來源有兩種，依賴于從外源性食物中攝取的外源性膽固醇和依賴于體內(nèi)合成方式產(chǎn)生的內(nèi)源性膽固醇。內(nèi)源性膽固醇始于一系列酶介導(dǎo)的乙酰輔酶A的酶促反應(yīng)，游離的膽固醇經(jīng)由ACAT催化形成膽固醇酯儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，大量的膽固醇酯蓄積在前列腺癌中既可以作為雄激素的原料儲(chǔ)備，又可以減少過高的游離膽固醇對細(xì)胞的毒性[14]。因而，前列腺癌的進(jìn)展可能與雄激素合成的上游和旁路信號(hào)途徑密切相關(guān)[15]，包括膽固醇的代謝、脂肪酸的合成和膽固醇酯的堆積。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)，ACAT作為膽固醇代謝過程中的關(guān)鍵酶，與膽固醇代謝相關(guān)疾病密切相關(guān)，其不僅與阿爾茲海默病、冠狀動(dòng)脈硬化的發(fā)病相關(guān)，還與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[16-17]。在人急性淋巴白血病細(xì)胞的增殖過程中膽固醇酯必不可少，而ACAT抑制劑會(huì)明顯抑制人急性淋巴白血病細(xì)胞的增殖[18]。在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌、腎透明細(xì)胞癌和胰腺癌等一系列的惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)ACAT活性增加，而ACAT1抑制劑能顯著降低惡性腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[19-20]。然而ACAT1在前列腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用國內(nèi)外較少研究。

本課題以人前列腺癌PC-3細(xì)胞為研究對象，利用ACAT1 siRNA抑制前列腺癌細(xì)胞中ACAT1基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACAT1 siRNA干擾ACAT1基因表達(dá)后會(huì)，導(dǎo)致PC-3細(xì)胞增殖能力下降，侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低，考慮ACAT1在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，為未來治療前列腺癌提供了新的思路。前列腺癌作為發(fā)病率、死亡率迅猛上升的常見惡性腫瘤，不僅給患者帶來了巨大痛苦，也給其家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。未來將進(jìn)一步深入研究膽固醇酯合成、花生四烯酸以及游離膽固醇水平在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以期通過靶向膽固醇的代謝，為前列腺癌尋找到新的治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-04-21 本文編輯：程 銘）endprint