不同處理條件對馬鈴薯糖蛋白Patatin構(gòu)象的影響研究

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(1.哈爾濱商業(yè)大學旅游與烹飪學院,黑龍江 哈爾濱150000;2.黑龍江出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心,黑龍江 哈爾濱 150001;3.哈爾濱商業(yè)大學旅游與烹飪學院,黑龍江 哈爾濱150000;4.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江 哈爾濱150030)

不同處理條件對馬鈴薯糖蛋白Patatin構(gòu)象的影響研究

孫瑩1,魏冬旭2,姚春艷3,江連洲4

(1.哈爾濱商業(yè)大學旅游與烹飪學院,黑龍江 哈爾濱150000;2.黑龍江出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心,黑龍江 哈爾濱 150001;3.哈爾濱商業(yè)大學旅游與烹飪學院,黑龍江 哈爾濱150000;4.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江 哈爾濱150030)

運用熒光和圓二色光譜手段研究了不同物理和化學條件處理后,馬鈴薯糖蛋白Patatin二級和三級結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明:當pH4～5時,Patatin的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。當pH6～9時,Patatin的二級結(jié)構(gòu)以β-折疊為主;隨著pH增加,熒光強度下降,最大發(fā)射波長藍移,并且pH對Patatin結(jié)構(gòu)的影響是可逆的;在溫度為20～60 ℃時,Patatin的二級結(jié)構(gòu)以β-折疊結(jié)構(gòu)為主,當溫度達到80 ℃時,Patatin的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主;隨著溫度升高,熒光強度下降,最大發(fā)射波長紅移;當Patatin處于不同濃度的DTT環(huán)境時熒光強度下降,當Patatin處于不同濃度的尿素環(huán)境時熒光強度增加,出現(xiàn)紅移。在變性劑存在條件下,無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)逐漸取代β-折疊結(jié)構(gòu)成為含量最多的構(gòu)型。

Patatin,空間構(gòu)象,熒光光譜,圓二色光譜

Patatin占馬鈴薯塊莖中可溶性蛋白的40%左右[1-2],是一種具有多種生理功能的天然糖蛋白,如抗氧化和抗腫瘤增殖活性,所以引起了研究者的廣泛興趣[3-5]。在一定環(huán)境下,蛋白質(zhì)會因為帶電基團的定位及基團間的靜電作用,發(fā)生構(gòu)象變化,從而使其功能性質(zhì)發(fā)生變化。Kelly[6]等研究表明尿素和鹽酸胍可以引起蛋白質(zhì)折疊展開。然而不同處理條件對馬鈴薯糖蛋白Patatin結(jié)構(gòu)的影響還不十分清楚。

熒光光譜技術(shù)是觀測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化動力學過程的一種重要工具[7-8]。蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要是由Trp和Tyr殘基所發(fā)射[9]。熒光強度和最大吸收波長的改變反應(yīng)了色氨酸殘基的變化程度和所處的微環(huán)境的變化。蛋白質(zhì)變性的過程就是其內(nèi)部的疏水性氨基酸逐漸向外暴露的過程,所以可以借助于疏水性較強的色氨酸或酪氨酸殘基的微環(huán)境變化來預(yù)測蛋白質(zhì)表面疏水性的變化以對其變性過程進行動態(tài)研究[10-11]。蛋白質(zhì)是鏈狀生物大分子,通過氨基酸分子構(gòu)成,天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子通常不以長鏈分子的狀態(tài)存在,而是長鏈分子折疊后形成的具有一定規(guī)律的三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象代表蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),有四種空間結(jié)構(gòu),分為α-螺旋,β-折疊,β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲[12-13]。蛋白質(zhì)的圓二色性是由其酰胺鍵(肽鍵)的相互作用引起的,可在190～250 nm的紫外區(qū)段來測量蛋白質(zhì)的圓二色譜。不同的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),引起不同的酰胺鍵的相互作用,產(chǎn)生不同的圓二色光譜特征[13]。目前由于圓二色譜具有信息量大,干擾小,結(jié)果更直觀等特點,已經(jīng)成為測定生物大分子結(jié)構(gòu)的有力手段。

本研究利用熒光光譜和圓二色譜分析馬鈴薯糖蛋白Patatin在不同pH、溫度、尿素和DDT誘導(dǎo)下二級和三級結(jié)構(gòu)的變化,旨在準確地表征蛋白質(zhì)構(gòu)象,為今后研究馬鈴薯蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

馬鈴薯汁水 內(nèi)蒙古華歐淀粉廠;Con A-Sepharose 4B和Q-Sepharose Fast Flow 美國GE Healthcare公司;鹽酸胍、尿素和DDT Sigma公司,其他所用化學藥品為分析純。

AKTA層析系統(tǒng) 美國GE公司;Jasco-810圓二色光譜儀日本 JASCO公司;F-4500型熒光分光光度計 日本日立公司。

1.2實驗方法

1.2.1 糖蛋白Patatin的制備 以馬鈴薯汁水為原料,采用MWCO 200 kDa超濾膜進行過濾。將超濾截留液干燥后得到的馬鈴薯濃縮蛋白粉進行色譜分離。稱取三份200 mg超濾濃縮蛋白粉分別用pH7的5 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解。10000 r/min離心30 min后取上清液上離子交換Q-Sepharose Fast Flow(1.6 cm×25 cm)柱,用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(溶解樣品時的pH)平衡,收集離子交換穿透峰,再用平衡液沖洗5個柱體積,然后用含1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)B液洗脫。100% B液直接洗脫。收集離子交換洗脫峰。將離子交換洗脫峰濃縮后,上Con A-Sepharose 4B(2.6 cm× 20 cm)柱。用含1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡,用1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡5個柱體積后,改用含0～100 mmol/Lα-甲基-D-葡萄糖苷和1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)C液洗脫。流速為1.5 mL/min。在280 nm下檢測吸光度。收集親和層析洗脫峰,5000 Da超濾離心管離心10 min,干燥后存于-20 ℃冰箱中備用[14]。

1.2.2 熒光光譜測定 參照Rahma等[15]人方法,略作修改。采用F-4500型熒光分光光度計測定Patatin的三級結(jié)構(gòu)變化。激發(fā)波長為295 nm,發(fā)射光檢測范圍為300～400 nm,掃描速度為1200 nm/min,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm,掃描5次。數(shù)據(jù)分析軟件采用FL Solutions 2.0。

1.2.3 圓二色光譜測定 參照李雪琴等[16]人方法,稍作修改。采用遠紫外區(qū)域圓二色光譜研究不同pH對蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響。配制一定濃度的蛋白溶液,室溫下將樣品放置1 h。采用Jasco-810圓二色光譜儀在190～250 nm之間掃描,分辨率1 nm,空白為樣品所處的緩沖液,實驗值為5次掃描的均值。蛋白二級結(jié)構(gòu)組成估算軟件為Jasco。

1.2.4 不同pH對Patatin構(gòu)象的影響 將Patatin分別用pH4、pH5、pH6、pH7、pH8和pH9的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液溶解,用相應(yīng)的緩沖液調(diào)節(jié)pH到精確的值,保證蛋白質(zhì)的濃度為1 mg/mL,取樣測定不同pH對熒光光譜和圓二色光譜的影響。然后從不同pH的樣品體系中取樣,小心調(diào)節(jié)pH為7.0,進行熒光光譜檢測。

1.2.5 不同溫度對Patatin構(gòu)象的影響 將Patatin用pH7.0,0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液溶解在離心管中,保證蛋白質(zhì)的濃度為1 mg/mL,然后將離心管分別在20、40、60、80、100 ℃水浴中加熱30 min后迅速放入冰浴中冷卻。取樣測定不同溫度對熒光光譜和圓二色光譜的影響。

1.2.6 不同變性劑對Patatin構(gòu)象的影響 將Patatin分別用0、2、4、6、8 mol/L尿素(pH7.0,1 mol/L Tris-HCl)和0、2、4、6、8 mmol/L DTT(pH7.0,1 mol/L Tris-HCl)溶液溶解,靜置2 h后取樣測定尿素和DTT對Patatin熒光光譜的影響。并用6 mol/L尿素和2 mmol/L DTT溶解Patatin,靜置2 h后,取樣用于圓二色譜的檢測。

1.3數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復(fù)三次,實驗結(jié)果用平均數(shù)±SD表示。采用SPSS 12.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理,采用Origin8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1不同pH對Patatin構(gòu)象的影響

由圖1可知,在pH4和pH5的酸性環(huán)境下,Trp熒光強度最高,且在pH4 和pH5時的熒光圖譜差別很小。隨著pH的升高,Trp的熒光強度逐漸減弱,在pH9時,幾乎看不到明顯的峰型。實驗測得Trp的最大發(fā)射波長為355 nm,說明在pH4～9范圍內(nèi)Patatin中的Trp殘基較大程度上位于疏水的環(huán)境中。當pH再次調(diào)為7.0時,不同pH環(huán)境中Trp的熒光強度近似一致(圖1)。說明pH引起的側(cè)鏈氨基酸殘基微環(huán)境的變化可能是可逆的,但是pH本身也會造成熒光強度的變化[17]。

圖1 不同pH條件下Patatin溶液pH調(diào)整為7時的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of Patatin recorded at pH adjusted to pH7

pH對Patatin二級結(jié)構(gòu)含量的影響如圖2所示。當pH<6時,β-折疊結(jié)構(gòu)的含量隨著pH的增加而迅速增加,在pH6時達到最大;當pH>7時,再提高pH對β-折疊結(jié)構(gòu)的含量影響不大;α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量隨著pH的升高逐漸下降;無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量逐漸增加;β-轉(zhuǎn)角在pH7時最低,在pH7兩側(cè)輕微增加;在pH4和pH5條件下,α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量相近,為主要的二級結(jié)構(gòu)類型;在pH6～9范圍內(nèi),Patatin的二級結(jié)構(gòu)以β-折疊為主,α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)次之。蛋白質(zhì)分子中α-螺旋和β-折疊的穩(wěn)定性主要取決于分子內(nèi)部的氫鍵。溶液pH的變化造成蛋白分子的內(nèi)部氫鍵發(fā)生改變,致使二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[18-19]。結(jié)合熒光光譜分析結(jié)果可知,在pH4和pH5條件下的Patatin結(jié)構(gòu)相似;pH6～9條件下的Patatin結(jié)構(gòu)相似。

圖2 不同pH對Patatin二級結(jié)構(gòu)含量的影響Fig.2 Effect of pH on secondary structure content of Patatin

2.2不同溫度對Patatin構(gòu)象的影響

圖3是不同溫度對Patatin熒光光譜的影響。由圖可知,溫度在20 ℃和40 ℃時,Trp熒光強度變化很小,兩者的峰型相同,最大發(fā)射峰波長相近。在60 ℃時,Trp的熒光強度與20 ℃和40 ℃時相差不大,但是最大發(fā)射波長發(fā)生了輕微紅移。在80 ℃和100 ℃高溫條件下,Trp熒光強度顯著下降,并且發(fā)生顯著紅移。溫度升高,分子間的碰撞加劇,分子內(nèi)的振動增強,蛋白質(zhì)分子中不同部位的弱鍵逐漸被破壞,Trp殘基向極性環(huán)境轉(zhuǎn)移程度增加。溫度升高導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)逐步松散,產(chǎn)生紅移[20]。在不同溫度下蛋白質(zhì)分子處于不同的變性態(tài)能量發(fā)生轉(zhuǎn)移,另外,在高溫下分子聚集,Patatin構(gòu)象發(fā)生一定程度的變化,導(dǎo)致熒光猝滅[21]。因此,Patatin內(nèi)源熒光強度都是隨著溫度升高逐步降低的。

圖3 不同加熱溫度條件下Patatin熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of Patatin recorded at different temperature

圖4 不同溫度對Patatin二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of temperature on secondary structure content of Patatin

當Patatin所處體系的溫度低于40 ℃時,α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲的含量比例變化不大,說明在此范圍內(nèi)Patatin的結(jié)構(gòu)變化不顯著。當溫度繼續(xù)升高時,α-螺旋含量迅速下降,無規(guī)則卷曲含量迅速增加。當溫度達到80 ℃時,無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占主導(dǎo)地位。田素燕[22]采用遠紫外圓二色譜法研究了細胞紅蛋白的環(huán)境溫度對細胞紅蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響,溫度達到368 K,它仍保持有20%的α-螺旋結(jié)構(gòu),說明該蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性。本研究中,Patatin在80 ℃時(353 K)時α-螺旋含量仍然保持在10%以上,在高溫下Patatin仍然具有一定量的二級結(jié)構(gòu),說明Patatin也是一種高熱穩(wěn)定性蛋白。

2.3不同變性劑對Patatin構(gòu)象的影響

Patatin經(jīng)過0、2、4、6、8 mol/L尿素處理后,熒光光譜的變化如圖5所示,在激發(fā)波長295 nm條件下,未經(jīng)過變性劑處理的Patatin最大發(fā)射波長為341 nm,經(jīng)過2、4、6、8 mol/L尿素處理后,Patatin最大發(fā)射波長發(fā)生紅移,分別紅移了1、4、5、7 nm。熒光強度從527.6增加為683.9、657.9、805.2和819.2。

圖5 尿素對Patatin熒光光譜的影響Fig.5 Effect of urea on fluorescence spectra of Patatin

尿素能夠破壞Patatin分子中的氫鍵,尿素常被用于蛋白質(zhì)的解離和亞基的分離,在8 mol/L尿素作用下,大多數(shù)蛋白質(zhì)由折疊態(tài)變成完全伸展的狀態(tài),尿素通過破壞氫鍵而使蛋白質(zhì)從有序變?yōu)闊o序,發(fā)生去折疊現(xiàn)象。隨著濃度的增加,熒光強度增加,說明尿素不僅破壞了疏水相互作用,還能促進使Patatin分子中的色氨酸殘基部分暴露在極性環(huán)境中,處于蛋白質(zhì)分子的表面或者部分位于蛋白質(zhì)分子表面,從而引起熒光強度和最大發(fā)射波長的改變,使Patatin構(gòu)象發(fā)生變化,從而使熒光強度增加。

DTT處理對Patatin其熒光光譜的影響如圖6所示。在激發(fā)波長295 nm時,不同濃度的DTT并沒有引起最大發(fā)射波長的改變,但隨著DTT濃度的增加,熒光強度下降。當DTT濃度為2、4、6、8 mmol/L時,熒光強度與未經(jīng)過DTT處理的溶液相比,分別下降23.1%,40.7%,45.2%和49.5%。蛋白質(zhì)內(nèi)部的二硫鍵的數(shù)量影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,DTT主要作用于蛋白質(zhì)的二硫鍵,使整個蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變成一種松散的狀態(tài),色氨酸殘基移動向其分子表面,使其構(gòu)象發(fā)生變化,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)從有序變?yōu)闊o序,色氨酸殘基暴露在極性環(huán)境中,從而引起熒光強度的下降[23-24]。

圖6 DTT對Patatin熒光光譜的影響Fig.6 Effect of DTT on fluorescence spectra of patatin

圖7 變性劑對Patatin二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effect of DTT and urea on secondary structure content of Patatin

考察變性劑對二級結(jié)構(gòu)含量的影響時,選擇6 mol/L尿素和2 mmol/L DTT處理Patatin,并與未經(jīng)過變性劑處理的Patatin相比較。由圖7可知,Patatin經(jīng)6 mol/L尿素和2 mmol/L DTT 處理后α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量大幅度下降,無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增加,無規(guī)則卷曲含量接近50%,表明經(jīng)過6 mol/L尿素和2 mmol/L DTT處理后Patatin幾乎完全失去二級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加松散無序,蛋白質(zhì)發(fā)生變性。α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角穩(wěn)定性主要取決于分子內(nèi)部氫鍵,當?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)過變性劑處理后由于它們能與水分子或者蛋白質(zhì)分子中游離氨基和羧基形成氫鍵,造成分子內(nèi)部氫鍵發(fā)生改變,從而對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)造成巨大破壞[13,22,25]。

3 結(jié)論

采用熒光分光光譜和圓二色光譜兩種測試手段,檢測了馬鈴薯糖蛋白Patatin在不同外界條件處理下的二級和三級結(jié)構(gòu),研究表明:pH會對糖蛋白Patatin的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,但影響是可逆的,在pH4和pH5條件下,α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量相近,為主要的二級結(jié)構(gòu)類型;在pH6～9范圍內(nèi),Patatin的二級結(jié)構(gòu)以β-折疊為主;隨著溫度的升高,蛋白質(zhì)分子中不同部位的弱鍵逐漸被破壞,當溫度達到80 ℃時,主要為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu);在變性劑尿素和DDT的處理下,Patatin的二級結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生顯著變化,特別是尿素對二級結(jié)構(gòu)的影響更加明顯。

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EffectofdifferenttreatmentconditionsontheconformationchangesofPatatin

SUNYing1,WEIDong-xu2,YAOChun-yan3,JIANGLian-zhou4

(1.College of Tourism and Culinary Science,Harbin University of Commerce,Harbin 150000,China;2.Technical Centre of Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine,Harbin 150001,China;3.College of Economics,Harbin University of Commerce,Harbin 150000,China;4.Food College of the Northeast Agriculture University,Harbin 150000,China)

In this study,the tertiary and secondary structures of Patatin under different physico-chemical treatments were investigated by fluorescence and circular dichrosim. Patatin was rich inα-helix at pH4～5,but theα-helix was gradually instead by theβ-sheet at pH6～9. With the increasing pH,the strength of fluorescence became apparently lower. A blue shift in the maximum emission wavelength was observed,and the effect of pH on struction was reversible. Patatin was rich inβ-sheet from 20 ℃ to 60 ℃. When the temperature reached to 80 ℃,the random coil content reached to maximum. With the increasing temperature,the fluorescence intensity decreased signifcantly. A red shift in the maximum emission wavelength was observed and the fluorescence intensity decreased in Patatin treated by DTT but increased by urea. A red shift in the maximum emission wavelength was observed，and theβ-sheet gradually instead by the random coil under the condition of DTT and urea.

Patatin;structure characteristic;fluorescence;circular dichrosim

2016-12-27

孫瑩(1982-)，女，博士，講師，研究方向：植物蛋白質(zhì)的功能性，E-mail:sunying625@163.com。

黑龍江省自然科學基金項目(C2015067)；哈爾濱商業(yè)大學青年創(chuàng)新人才項目(2016QN060)。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)17-0080-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.016