響應(yīng)面法優(yōu)化干蟾皮的提取工藝△

趙旭，汪坤，王楠斐

(河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

·中藥工業(yè)·

響應(yīng)面法優(yōu)化干蟾皮的提取工藝△

趙旭*，汪坤，王楠斐

(河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

目的：優(yōu)選干蟾皮的提取工藝條件。方法：采用回流提取法提取干蟾皮，以華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的總量為考察指標(biāo)，運(yùn)用響應(yīng)面法的設(shè)計(jì)，考察乙醇濃度、液料比、提取時間對提取工藝的影響。結(jié)果：優(yōu)化的提取工藝條件為乙醇濃度為88.64%，液料比為12∶1，提取時間為1.49 h，在該優(yōu)化條件下，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的總量為2.24 mg。結(jié)論：該優(yōu)化工藝簡便、預(yù)測性良好，可以為干蟾皮的開發(fā)提供參考。

干蟾皮；響應(yīng)面法；華蟾酥毒基；酯蟾毒配基

干蟾皮為蟾蜍科動物中華蟾蜍BufogargarizansCantor的干燥皮，具有清熱解毒、利水消腫的功能，適用于癰疽腫毒、疳積腹脹、瘰疬腫瘤等癥[1]。近年來干蟾皮用于多種癌癥或配合化療，可以減輕癌性疼痛，改善血常規(guī)，作用顯著。

研究表明，干蟾皮中主要含有蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物及蟾毒色胺類及甾醇類，生理活性物質(zhì)主要是蟾蜍毒素及水解產(chǎn)物蟾毒配基[2]。目前干蟾皮的主要提取方法有超聲提取法[3]、加熱回流提取法[4]、室溫浸漬法等，提取工藝的設(shè)計(jì)主要為單因素試驗(yàn)法和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法[5]。響應(yīng)面試驗(yàn)法是目前中藥制劑生產(chǎn)工藝研究常用的方法之一，尤其適宜多指標(biāo)、復(fù)雜成分提取工藝的優(yōu)選[6-7]。本研究運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選干蟾皮加熱回流提取工藝，為開發(fā)利用干蟾皮提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient-1260高效液相色譜儀；AE240型十萬分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

干蟾皮購于亳州藥材市場，經(jīng)河南省中醫(yī)院黃小敏副主任中藥師鑒定為蟾蜍科動物中華蟾蜍BufogargarizansCantor的干燥皮。華蟾酥毒基對照品、酯蟾毒配基對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110803-200605，110718-201108)；乙腈、甲醇為色譜純；水為娃哈哈飲用純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 華蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量測定方法

2.1.1 色譜條件 AgilentTC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.5%磷酸二氫鉀溶液(50∶50)；檢測波長為293 nm；柱溫為40 ℃；流速為1 mL·min-1。理論塔板數(shù)以華蟾酥毒基計(jì)算>2000。標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液色譜圖如圖1。

注：A.標(biāo)準(zhǔn)品；B.供試品；1.華蟾酥毒基；2.酯蟾毒配基。圖1 干蟾皮HPLC圖

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取華蟾酥毒基、酯蟾毒配基標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL容量瓶中，加色譜甲醇定容，華蟾酥毒基質(zhì)量濃度為53 μg·mL-1，酯蟾毒配基質(zhì)量濃度為54 μg·mL-1。精密量取華蟾酥毒基對照品溶液4 mL，酯蟾毒配基對照品溶液1 mL，混勻即為混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.3 供試品溶液配制 稱取干蟾皮2 g，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件加熱回流提取，濾紙過濾，收集提取液，水浴揮干后用色譜甲醇定容至50 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，搖勻，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：進(jìn)樣華蟾酥毒基、酯蟾毒配基混合對照品2、4、6、8、10、12 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得華蟾酥毒基回歸方程：Y=513.47X-0.060 7(r=0.099 9)，線性范圍為0.085～0.509 μg；酯蟾毒配基回歸方程：Y=422.91X-0.318 7(r=0.999 2)，線性范圍為0.022～0.130 9 μg。

精密度試驗(yàn)：取華蟾酥毒基、酯蟾毒配基混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積的RSD分別為1.88%、1.07%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：稱取干蟾皮2 g，按照供試品溶液制備方法制備樣品(10倍量90%乙醇提取2次，每次1.5 h)，分別放置0、2、4、6、8 h后進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積的RSD分別為2.14%、2.37%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取干蟾皮6份，每份2 g，按照供試品溶液制備方法制備樣品(10倍量90%乙醇提取2次，每次1.5 h)，分別進(jìn)樣10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算華蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量平均數(shù)分別為1.650、0.468 μg，總量平均數(shù)為2.12 μg，RSD值為2.96%，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：稱取干蟾皮6份，每份0.5 g，分別加入華蟾酥毒基對照品溶液(0.55 mg·mL-1)3 mL、酯蟾毒配基對照溶液(0.23 mg·mL-1)2 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 華蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量測定的加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

2.2 提取工藝優(yōu)選

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定提取次數(shù)為2次，選擇乙醇濃度、液料比、提取時間為自變量，以華蟾酥毒基、酯蟾毒配基總量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平中心復(fù)合試驗(yàn)，因素水平表見表2。稱取干蟾皮，按照設(shè)計(jì)方案提取，按2.1.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測定華蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表3。采用Design Expert 8.06軟件對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表4。

表2 提取工藝中心復(fù)合試驗(yàn)因素水平

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及分析結(jié)果

經(jīng)Design Expert 8.06軟件擬合得總評分Y對提取時間、提取次數(shù)、加水量的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=2.14-0.078A+0.016B+0.066C-0.078AB-0.048AC-0.045BC-0.21A2-0.202+0.020C2。

由表4可知模型回歸P值為0.006 7，說明模型回歸顯著可靠；失擬誤差P值為0.200 2>0.05，失擬度不明顯，說明該方程擬合度較高，該模型可以預(yù)測干蟾皮提取工藝過程。

表4 回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

乙醇濃度、液料比、乙醇濃度的平方、提取時間的平方對綜合評分的的影響較顯著(P<0.05)，在三個因素之間，乙醇濃度對試驗(yàn)結(jié)果的影響最大。

根據(jù)二次多項(xiàng)式方程，分別繪制各指標(biāo)與響應(yīng)值交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖，用來確定各因素對干蟾皮提取工藝的影響，結(jié)果見圖2～4。

圖2 提取時間與乙醇濃度交互作用的響應(yīng)面圖

圖3 液料比與乙醇濃度交互作用的響應(yīng)面圖

圖4 液料比與提取時間交互作用的響應(yīng)面圖

通過Design Expert 8.06軟件計(jì)算并分析得到的各因素的最優(yōu)條件：88.64%的乙醇提取2次，每次1.49 h，液料比為12∶1，預(yù)測華蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量總量為2.24 mg。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

取同一批干蟾皮，精密稱取3份，每份2 g，按照優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取，計(jì)算華蟾酥毒基、酯蟾毒配基平均含量總量為2.28 mg，RSD值為2.13%，與預(yù)測值偏差較小，說明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可靠。

3 討論

干蟾皮具有明確的抗癌作用，對其藥效成分進(jìn)行有效提取并開發(fā)利用具有實(shí)用價值。響應(yīng)面法目前廣泛應(yīng)用于中藥提取工藝研究[8-10]，其分析方法直觀、精密度高、預(yù)測性好。

本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上首先固定提取次數(shù)為2次，通過響應(yīng)面法分析乙醇濃度、提取時間、液料比3個因素對干蟾皮提取工藝的影響，模擬的二

次項(xiàng)方程通過回歸和檢驗(yàn)分析都具有很好的擬合性和有效性，表明此方程具有可預(yù)測性，最終確定干蟾皮提取工藝的條件為88.64%的乙醇提取2次，每次1.49 h，液料比為12∶1。該研究可以為干蟾皮的提取開發(fā)提供參考。

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OptimizationofExtractionCraftBufoCoriumbyUsingBox-BehnkenResponseSurfaceMethod

ZHAOXu*，WANGKun，WANGNanfei

(HeNanProvinceHospitalofTCM，Zhengzhou450002，China)

Objective：To optimize the extraction process of craft bufo.Methods：The refluxing process was applied，the amount of cinobufagin and resibufogenin was used as response value，box-Behnken response surface method was employed to investigate the influence of ethanol concentration，extraction time and the amount of alcohol added on the extraction process of craft bufo.Results：The optimized extraction technology was：extracted 2 times with 12 times the amount of 88.64% ethanol；1.49 hours per time.Under the optimized conditions，the total amount of cinobufagin and resibufogenin was 2.24 mg.Conclusion：The optimized extraction process is simple and predictable，can provide a reference basis for production.

Bufocurium；Box-Behnken Response Surface Method；cinobufagin；resibufogenin

河南省科技公共計(jì)劃項(xiàng)目(132102310243)

] 趙旭，副主任中藥師，研究方向：醫(yī)院制劑研究；Tel：(0371)60908883，E-mail：13592533250@139.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.020

2016-04-05)

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