水辣蓼總黃酮的提取工藝及不同極性部位體外抑菌活性研究△

羅曉韻，程軒軒，楊慧文，溫淑婷，楊全

(廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006)

·中藥工業(yè)·

水辣蓼總黃酮的提取工藝及不同極性部位體外抑菌活性研究△

羅曉韻，程軒軒*，楊慧文，溫淑婷，楊全*

(廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006)

目的：優(yōu)化水辣蓼總黃酮的超聲提取工藝，比較不同極性萃取物對(duì)致病性大腸桿菌的體外抑菌效果。方法：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、超聲時(shí)間及乙醇濃度三因素進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)。采用牛津杯法測(cè)定各萃取物的抑菌圈直徑，通過(guò)微量稀釋法和平板法測(cè)定最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果：水辣蓼總黃酮最優(yōu)提取條件為料液比1∶38，乙醇濃度66%，超聲提取3次，每次37 min；總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.084 7 mg·g-1。不同極性的萃取物中，乙酸乙酯部位抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑(136.8±0.08)mm，最低抑菌濃度(MIC)為25 mg·mL-1。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定可行、操作簡(jiǎn)便；水辣蓼的乙酸乙酯萃取物是其體外抑制致病性大腸桿菌的活性部位。

水辣蓼；總黃酮；響應(yīng)面法；致病性大腸桿菌；抑菌活性

大腸桿菌病是由病原性大腸桿菌所致的一種人類(lèi)與動(dòng)物共患的多型性傳染病，本菌能引起人類(lèi)和動(dòng)物的腸道及泌尿系統(tǒng)感染。其中畜禽的大腸桿菌性腹瀉是養(yǎng)殖場(chǎng)中最常見(jiàn)的疾病，常引起大批畜禽發(fā)育不良或死亡，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[1-5]。因此防治畜禽大腸桿菌性腹瀉，開(kāi)發(fā)高效低毒和低耐藥性藥物是養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要課題之一。

獸醫(yī)臨床已證實(shí)，蓼科植物水辣蓼PolygonumhydropiperL.具有祛濕止瀉、散瘀止痛、殺蟲(chóng)等功能，主治畜禽冷腸泄瀉、寒痢等癥[6-7]。目前關(guān)于水辣蓼的基礎(chǔ)研究較少，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用機(jī)制尚不明確，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)缺乏，從而限制了辣蓼資源應(yīng)用。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水辣蓼主要成分為黃酮，本研究首先優(yōu)化總黃酮提取工藝，并對(duì)不同極性部位提取物的體外抗致病性大腸桿菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在確定其抑菌的有效部位，為充分利用水辣蓼資源及中獸藥開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ-500DE數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-1800紫外分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器有限公司)；BCM-1000A超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；YXQ-LS-SⅡ高溫高壓滅菌鍋(上海東亞壓力容器制造有限公司)。

1.2 材料

致病性大腸桿菌O78購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心；蘆丁(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：J1430068，98.0%)；硫酸卡那霉素(健陽(yáng)生物科技有限公司)；牛肉膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；細(xì)菌學(xué)蛋白胨、技術(shù)瓊脂粉(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

水辣蓼采于湖南省衡陽(yáng)市，經(jīng)廣東藥科大學(xué)楊全教授鑒定為蓼科植物水辣蓼PolygonumhydropiperL.的干燥全草，標(biāo)本保存于中藥學(xué)院標(biāo)本館。

2 方法

2.1 水辣蓼總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取1 g水辣蓼干燥粉末(過(guò)40目篩)，以適宜的料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間及功率進(jìn)行提取，合并濾液，濃縮，用提取溶劑定容至10 mL，搖勻，備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取蘆丁11.0 mg，用70%乙醇溶解并定容至50 mL，搖勻，備用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 分別吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL對(duì)照品溶液，置于10 mL量瓶中，以70%乙醇定容。再分別精密移取1 mL上述溶液置于10 mL量瓶中，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法顯色[8]，于505 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度(X，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.1.4 供試品總黃酮含量測(cè)定 精密量取1 mL供試品溶液置于10 mL量瓶，按2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算總黃酮含量。

2.1.5 單因素試驗(yàn)

2.1.5.1 提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響 精密稱(chēng)定1 g藥材，按1∶30料液比加入80%乙醇，400 W功率超聲提取30 min，考察不同提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)對(duì)總黃酮含量影響。

2.1.5.2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 精密稱(chēng)定1 g藥材，以80%乙醇為提取溶劑，400 W功率超聲提取3次，每次30 min，考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)對(duì)總黃酮含量影響。

2.1.5.3 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響 精密稱(chēng)定1 g藥材，按1∶30料液比，400 W功率超聲提取3次，每次30 min，考察乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)對(duì)總黃酮含量影響。

2.1.5.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 精密稱(chēng)定1 g藥材，按1∶30料液比加入70%乙醇，400 W功率超聲提取3次，考察提取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)對(duì)總黃酮含量影響。

2.1.5.5 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響 精密稱(chēng)定1 g藥材，按1∶30料液比加入70%乙醇，超聲提取3次，每次30 min，考察超聲功率(300、350、400、450、500 W)對(duì)提取樣品總黃酮含量影響。

2.1.6 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Design Expert 8.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)原理[8-10]，選取料液比、乙醇濃度和超聲時(shí)間進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 菌液的制備 致病性大腸桿菌O78菌株經(jīng)復(fù)蘇后以營(yíng)養(yǎng)肉湯于搖床150 r·min-137 ℃培養(yǎng)24 h，以平板稀釋法[11]配制終濃度為1.0×107CFU·mL-1的菌懸液。

2.2.2 供試品藥液的制備 水辣蓼不同濃度醇提液的制備：按照優(yōu)選的最佳工藝制備提取液回收溶劑，濃縮至藥液濃度為1.00、1.25、1.50、2.00 g(生藥)·mL-1。

不同極性提取物的制備：將上述提取液，減壓回收溶劑后，混懸于蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取。各段萃取液分別回收溶劑、蒸干，得四段浸膏。分別精密稱(chēng)定標(biāo)準(zhǔn)上述浸膏各100 mg，以5‰CMC-Na溶液1 mL分散，121 ℃高壓滅菌20 min，制得無(wú)菌樣品。陽(yáng)性對(duì)照藥為卡那霉素(5‰ CMC-Na溶解)。

2.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn) 吸取100 μL菌懸液均勻涂布后，以牛津杯法測(cè)定藥液抑菌活性，以5‰CMC-Na作為空白對(duì)照，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。觀察抑菌情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑(mm)，重復(fù)3次。

2.2.4 不同極性萃取物中總黃酮含量與抑菌活性比較 分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下不同極性部位的藥液各1 mL，置于10 mL量瓶中，按2.1.3項(xiàng)下方法顯色并測(cè)量吸光度，計(jì)算不同極性浸膏中總黃酮含量。

2.2.5 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 取2.2.2項(xiàng)下的乙酸乙酯萃取液，以肉湯稀釋法[11]測(cè)量最低抑菌濃度(MIC)。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程

以吸光度值為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度(X，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：Y=1.215 2X-0.012 4，r=0.999 1。

3.2 單因素考察

3.2.1 提取次數(shù)對(duì)總黃酮含量影響 總黃酮含量隨著提取次數(shù)增加呈上升趨勢(shì)，提取次數(shù)超過(guò)3時(shí)，總黃酮含量上升趨勢(shì)減緩?？紤]操作方便和時(shí)間成本，故確定提取3次為宜，見(jiàn)圖1。

圖1 提取次數(shù)對(duì)總黃酮含量的影響

3.2.2 料液比對(duì)總黃酮含量影響 隨料液比的增加，總黃酮含量成先升后降，并于1∶30處有最大值(6.20 mg·g-1)。鑒于此，確定1∶30為最優(yōu)料液比，見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)總黃酮含量的影響

3.2.3 乙醇濃度對(duì)總黃酮含量影響 由圖3可知，乙醇濃度為70%時(shí)總黃酮含量有極大值5.78 mg·g-1。故選擇70%為適宜醇濃度。

圖 3 醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響

3.2.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量影響 由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)，總黃酮含量有最大值(6.02 mg·g-1)。在30 min后，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)提取率的提高幾乎無(wú)影響，故確定30 min為最優(yōu)提取時(shí)長(zhǎng)。

圖 4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

3.2.5 超聲功率對(duì)總黃酮含量影響 由圖5可知，當(dāng)超聲功率為450 W時(shí)總黃酮含量有極大值(6.95 mg·g-1)。故認(rèn)為450 W為適宜超聲功率。

圖5 超聲功率對(duì)總黃酮含量的影響

3.3 提取工藝的響應(yīng)曲面優(yōu)化

提取工藝響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立總黃酮含量(Y)對(duì)料液比(A)、乙醇濃度(B)及提取時(shí)間(C)的二元多項(xiàng)回歸模擬方程：Y=5.967 2+0.328 2A-0.144 7B+0.416 8C-0.178 7AB+0.056 6AC-0.117 3BC-0.223 9A2-0.558 1B2-0.248 9C2。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸模型方差分析表

由表3可知，二次方程模型的Prob>F<0.000 1，表明該二次方程模型極顯著。失擬相P=0.241 0>0.1，不顯著，說(shuō)明模型不存在失擬因素，可以用回歸方程模擬實(shí)驗(yàn)的真實(shí)點(diǎn)?；貧w模型的r=0.981 6(RAdj2=0.958 0)，表明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值具有高度關(guān)聯(lián)性。變異系數(shù)C.V.%=2.013 5%，說(shuō)明模型的置信度較高。根據(jù)Prob>F值，A、B、C、A2、B2均為二次回歸模型的極顯著因素(P<0.01)，AB和C2為模型的顯著因素。其中料液比(A)和醇濃度(B)存在交互作用。此結(jié)論亦可以根據(jù)等高線(xiàn)密度和響應(yīng)曲面陡度得到證實(shí)[9-10]。

圖6 液料比與醇濃度對(duì)總黃酮含量的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖

圖7 液料比與超聲時(shí)間對(duì)總黃酮含量的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖

圖8 乙醇濃度與超聲時(shí)間對(duì)總黃酮含量的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖

由Design-Expert8.0軟件得出，總黃酮最優(yōu)提取工藝：料液比1∶38，乙醇濃度66%，超聲提取3次，每次37 min。在此條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，總黃酮含量為6.084 7 mg·g-1，與模型預(yù)測(cè)值(6.349 4 mg·g-1)接近。

3.4 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4～5可得，水蓼提取物抑菌活性與藥液濃度、總黃酮含量呈正相關(guān)，不同極性萃取物中以乙酸乙酯段萃取物總黃酮含量最高及抑菌活性最強(qiáng)。以肉湯稀釋法測(cè)定其最低抑菌濃度(MIC)為25 mg·mL-1。

表4 不同濃度水辣蓼醇提液的抑菌圈

注：“—”為無(wú)抑菌圈。下同。

表5 水辣蓼不同極性萃取物的抑菌圈直徑及總黃酮含量

表6 乙酸乙酯段提取液最低抑菌濃度測(cè)定

注：—無(wú)菌生長(zhǎng)；+菌體較少；++菌體較多；+++菌體很多。

4 討論

預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水辣蓼主要成分為黃酮類(lèi)化合物。分別比較了藥材的水提液、醇提液和粗多糖對(duì)致病性大腸桿菌O78的抑制效果。結(jié)果顯示，醇提液的抑菌圈較為明顯。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，上述樣品中總黃酮含量與抑菌活性呈正相關(guān)。故本文對(duì)水辣蓼總黃酮的醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化，并制備不同極性的萃取物，進(jìn)行抑菌活性的比較。結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取物為水辣蓼抑制致病性大腸桿菌的活性部位，最低抑菌濃度(MIC)為25 mg·mL-1。

鑒于超聲波對(duì)固體樣品提取效率較高，可避免高溫對(duì)目標(biāo)成分的破壞，具有提取時(shí)間短、提取溫度低的優(yōu)點(diǎn)。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化水辣蓼總黃酮的超聲提取工藝，并確定最佳工藝參數(shù)：料液比1∶38，醇濃度66%，超聲提取3次，每次37 min。各因素對(duì)總黃酮得率的影響程度：提取時(shí)間(C)>料液比(A)>乙醇濃度(B)。最佳工藝條件下實(shí)測(cè)總黃酮提取量為6.084 7 mg·g-1，與理論值6.349 4 mg·g-1基本相符?；貧w分析與驗(yàn)證試驗(yàn)表明該工藝穩(wěn)定可行。

水辣蓼作為一種常見(jiàn)易得的傳統(tǒng)中草藥，在中醫(yī)及獸醫(yī)臨床應(yīng)用歷史悠久、療效確切。本研究已證實(shí)，水辣蓼對(duì)O78致病性大腸桿菌有較好的抑菌活性。未來(lái)還將對(duì)水辣蓼體內(nèi)抑菌效果及作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

[1] 李春花.中藥復(fù)方“連黃”抗大腸桿菌性腹瀉作用的實(shí)驗(yàn)研究[D].吉林：延邊大學(xué)，2008.

[2] 付水廣，張水印.引起哺乳仔豬死亡原因分析及防制措施[J].南昌高專(zhuān)學(xué)報(bào)，2006，21(1)：104-105.

[3] 王國(guó)強(qiáng)，劉云，方世宇.哺乳仔豬死亡原因及控制措施[J].養(yǎng)豬，2004(6)：17-18.

[4] 劉書(shū)亮，陶勇，王紅寧，等.規(guī)?；i場(chǎng)致病性大腸桿菌血清型鑒定[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000(S1)：74-77.

[5] 夏倫斌，左瑞華，葛凱等.規(guī)?；i場(chǎng)致病性大腸桿菌的耐藥性分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37(6)：183-184.

[6] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

[7] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典：第二部[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010.

[8] 劉春雨，王集會(huì).發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮類(lèi)含量測(cè)定的方法學(xué)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(17)：154-155.

[9] 李亞娜，林永成，佘志剛.響應(yīng)面分析法優(yōu)化羊棲菜多糖的提取工藝[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，32(11)：28-32.

[10]闕淼琳，蔣玉蓉，曹美麗，等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化藜麥種子多酚提取工藝及其品種差異[J].食品科學(xué)，2016，37(4)：7-12.

[11]沈關(guān)心.微生物學(xué)與免疫學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2007.

StudyonExtractionTechnologyofTotalFlavonoidsfromPolygonumhydropiperandAntimicrobialSusceptibilityofDifferentPolarityFractions

LUOXiaoyun，CHENGXuanxuan*，YANGHuiwen，WENShuting，YANGQuan*

(KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicineforProduction&DevelopmentofCantoneseMedicalMaterials，CollegeofTraditionalChineseMedicine，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangdong510006，China)

Objective：To optimize the extraction conditions of total flavonoids fromPolygonum.hydropiperL.and compare the antimicrobial susceptibility of different extracts on pathogenicE.coli.Methods：On the basis of single-factor tests，Box-Behnken Design was used to optimize extraction technology of total flavonoids fromP.hydropiperwith three factors of liquid-solid ratio，ethanol concentration and extraction time.The diameter of inhibition zone of different extracts was determined by cylinder plate method and minimal inhibitory concentration (MIC) was investigated by the broth dilution and plate method.Results：The optimal extraction conditions were as follows：ultrasonic extracting with 66% ethanol for three times，37 min for each time，liquid-solid ratio of 38∶1(mL∶g).Under the optimal condition，the content of total flavonoids was 6.084 7 mg·g-1.Among the extracts with different polarities，ethyl acetate extract showed the strongest antibacterial activity，with the inhibition zone diameter of 136.8±0.08 mm，and MIC of 25 mg·mL-1.Conclusion：The optimum extraction process is stable，simple and feasible.The ethyl acetate extract could be considered as the antibacterial active site ofP.hydropiper.

PolygonumhydropipierL.；total flavonoids；response surface methodology；enteropathogenic E.coli；antimicrobial susceptibility

廣東省公益研究與能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014A020208133)

] 程軒軒，副教授，研究方向：中藥有效成分與藥理活性研究，E-mail：gdyxycxx@126.com；楊全，教授，研究方向：中藥材規(guī)范化生產(chǎn)及道地藥材質(zhì)量研究，E-mail：yangquan7208@vip.163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.020

2017-01-20)

*[