信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子3和堿性螺旋—環(huán)—螺旋轉(zhuǎn)錄因子1在卵巢惡性上皮腫瘤中的表達

洪莉+楊將+邢輝

[摘要] 目的 探討信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）和堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1（Twist1）在卵巢惡性上皮腫瘤中的表達，并分析其表達失調(diào)與卵巢癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系。 方法 收集2015年3月～2016年12月于武漢大學人民醫(yī)院行手術(shù)的49例卵巢惡性上皮腫瘤患者和14例卵巢良性腫瘤患者的組織，應(yīng)用免疫組化SP法檢測STAT3和Twist1蛋白的表達情況，比較其在早期卵巢癌和晚期卵巢癌中的表達差異，并作Pearson相關(guān)性分析。 結(jié)果 STAT3和Twist1在卵巢癌中的陽性表達率明顯高于卵巢良性腫瘤，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；二者在晚期卵巢癌患者中的陽性表達率明顯高于早期卵巢癌，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；Twist1與STAT3在早期和晚期卵巢癌中的陽性表達均呈正相關(guān)（r = 0.653、0.798，均P < 0.05）。 結(jié)論 STAT3和Twist1在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和惡化中發(fā)揮著重要作用，其陽性表達率與卵巢癌FIGO分期相關(guān)，其機制可能是通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化實現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子3；堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1；相關(guān)性；卵巢惡性上皮腫瘤

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（c）-0118-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of signal transducer and activators of transcription 3 （STAT3） and Twist basic helix-loop-helix transcription factor 1（Twist1） in epithelial ovarian cancer， and to analyze the relationship between the expression dysregulation and the occurrence and development of ovarian cancer. Methods The tissue of 49 cases with epithelial ovarian cancer and 14 cases with ovarian benign tumor taken surgery in Renmin Hospital of Wuhan University from March 2015 to December 2016 were collected. The expression of STAT3 and Twist1 protein was examined by immunohistochemistry streptavidin peroxidase conjugated method， the expression differences of which in early ovarian cancer and advanced ovarian cancer were compared and analyzed by Pearson correlation analysis. Results The positive expression rates of STAT3 and Twist1 in ovarian cancer were significantly higher than those of ovarian benign tumor， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rates of STAT3 and Twist1 in the advanced ovarian cancer were higher than those of early ovarian cancer， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The positive expression of Twist1 in early ovarian cancer and advanced ovarian cancer was both positively correlated with STAT3（r = 0.653， 0.798， all P < 0.05）. Conclusion The expression of STAT3 and Twist1 plays an important role in the occurrence， development and deterioration of ovarian cancer， the positive expression rate has correlation with FIGO stage of ovarian cancer， and the mechanism may be achieved through epithelial-mesenehymal transition.

[Key words] Signal transducer and activators of transcription 3； Twist basic helix-loop-helix transcription factor 1； Correlation； Epithelial ovarian cancer

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢。調(diào)查顯示[1]，全世界每年新增病例約22萬例，約14萬婦女死亡，居全球女性生殖系統(tǒng)腫瘤死亡原因首位。因其具有早期癥狀不明顯、易轉(zhuǎn)移等特點，70%的患者在首次就診時已是晚期。據(jù)流行病學統(tǒng)計，懷孕或第1次生產(chǎn)年齡過早（≤25歲）或過晚（>35歲）、使用口服避孕藥以及拒絕母乳喂養(yǎng)等均可增加卵巢癌的發(fā)生風險。但其分子機制目前尚無絕對定論。Avtanski等[2]在乳腺癌的研究中顯示，信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducer and activators of transcription，STAT3）能夠調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenehymal transition，EMT）促進乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移。堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1（Twist basic helix-loop-helix transcription factor 1，Twist1）作為EMT發(fā)生中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，使腫瘤細胞膜上具有上皮特性的E鈣黏蛋白（E-cadherin）表達降低，具有間質(zhì)特性的N鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表達增高，導致癌細胞侵襲能力增強[3-4]。在卵巢癌中，STAT3與Twist1之間的聯(lián)系尚不明確，本研究通過組織水平研究，進一步闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集武漢大學人民醫(yī)院2015年3月～2016年12月卵巢上皮癌標本49例、卵巢良性腫瘤14例進行研究，術(shù)后均經(jīng)病理證實?；颊呔鶠榕裕挲g42～76歲，平均（63.4±5.2）歲。術(shù)前均未接受過化療、放療或免疫等抗腫瘤治療。FIGO分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期22例，Ⅲ期9例，Ⅳ期5例。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，充分告知參與者實驗相關(guān)事項并取得知情同意。

1.2 材料和試劑

所有組織樣本均選取部分于4%甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋，剩余部分于-70℃儲存，用于組織蛋白的提取。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑和S-P試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；抗體STAT3和抗體Twist1分別購自美國CST公司和Abcam公司。

1.3 方法

免疫組化染色采用鏈霉親和素-生物素復合物技術(shù)法（S-P法）。主要操作步驟：常規(guī)行組織標本脫蠟、水化、抗原修復、阻斷、封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色。蘇木精復染，脫水、透明、封片，于正置顯微鏡下選擇400倍視野，每張免疫組化片上隨機選擇5個視野，每個視野拍攝5幅照片。

1.4 評價標準

免疫組化結(jié)果判定：免疫組化結(jié)果采用半定量判定分析[5]。根據(jù)陽性細胞比例評分：≤5%細胞著色為0分；>5%～25%細胞著色為1分；>25%～50%細胞著色為2分；>50%～75%細胞著色為3分；>75%細胞著色為4分。按染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞比例評分與染色強度評分乘積為染色總評分：≤2分為陰性；≥3分為陽性表達，其中3～4分為弱陽性，5～6分為陽性，≥7分為強陽性。結(jié)果均由有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生采用盲法評估。FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期為早期，Ⅲ～Ⅳ期為晚期。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 STATA3在卵巢癌和卵巢良性腫瘤中的陽性表達率比較

通過免疫組化分析，STAT3表達于細胞核和細胞質(zhì)，主要表達于細胞核（圖1，封三）。卵巢癌組織中陽性表達率明顯高于卵巢良性腫瘤，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 Twist1在卵巢癌和卵巢良性腫瘤中的陽性表達率比較

免疫組化分析，卵巢癌組中Twist1蛋白表達于細胞核（圖2，封三），陽性表達率為79.6%，明顯高于卵巢良性腫瘤組織（28.6%），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 STATA3和Twist1陽性表達率與卵巢癌FIGO分期的關(guān)系

晚期卵巢癌組織中STAT3、Twist1的陽性表達率均明顯高于早期，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。提示，STAT3、Twist1的陽性表達與卵巢癌FIGO分期相關(guān)。見表2。

2.4 STAT3和Twist1在早期和晚期卵巢癌中的Pearson相關(guān)性分析

根據(jù)卵巢癌組織中STAT3和Twist1的陽性表達情況，采用Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者表達在早期和晚期卵巢癌中均呈正相關(guān)（r = 0.653、0.798，均P < 0.05）。見圖3。

3 討論

迄今為止，卵巢癌的早期診斷仍無特殊方法，嚴重威脅著女性的身心健康。STAT3是STAT家族中的重要成員，負責將細胞因子、生長因子等胞外信號刺激傳遞到胞核特異性DNA片段，通過誘導靶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮生物學效應(yīng)[6-7]。通過對小鼠胚胎發(fā)育的動態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)在STAT3缺陷的小鼠中，當胚胎發(fā)育至第6.5～7.5天時，胚胎的發(fā)育急劇退化，這表明STAT3的表達對早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要[8]。然而，近年來，越來越多的研究聚焦于STAT3在腫瘤中所發(fā)揮的作用。在裸鼠的荷瘤模型中，STAT3信號通路的沉默可以抑制腫瘤細胞的增殖，促進凋亡和減緩腫瘤的生長[9]。在結(jié)腸癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)，患者預后與STAT3的表達水平密切相關(guān)[10-11]。本研究中，STAT3在卵巢癌中的陽性表達率高于卵巢良性腫瘤，差異有統(tǒng)計學意義，提示STAT3在卵巢癌的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。同時，STAT3在晚期卵巢癌中的陽性表達率明顯高于早期，差異有統(tǒng)計學意義，提示卵巢癌臨床分期越晚，STAT3蛋白陽性表達越高，STAT3蛋白的表達水平與卵巢癌的發(fā)展和惡化密切相關(guān)。

卵巢癌中90%以上為上皮源性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展與EMT的發(fā)生密切相關(guān)。EMT是由緊密連接、不能運動的上皮細胞通過程序化轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞B接疏松、遷移能力的間質(zhì)細胞過程。分子水平主要為E-cadherin的降低和Vimentin、N-cadherin的表達增高；生物學上主要表現(xiàn)為與正常上皮極性相關(guān)的細胞骨架結(jié)構(gòu)和介導細胞與細胞、細胞與間質(zhì)之間連接的蛋白分布與表達的改變；行為學上體現(xiàn)為細胞黏附力下降，極性丟失，細胞由多邊形向梭形轉(zhuǎn)變，侵襲和遷移能力增強[12]。EMT不僅在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，而且影響著腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。早期癌細胞通過間質(zhì)化改變細胞極性，獲得更高遷移能力。晚期腫瘤細胞通過間質(zhì)內(nèi)皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-epithelial transition，MET）重塑上皮表型，表達相關(guān)分子，介導癌細胞與組織接觸并整合，從而形成轉(zhuǎn)移灶[13]。Twist1作為EMT發(fā)生中的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，是近年來廣受關(guān)注的致癌基因，其核苷酸和氨基酸序列高度保守[14]，其突變可導致胚胎發(fā)育異常和出生后發(fā)生染色體異常的塞-科綜合征（Saethre-Chotzen syndrome，SCS）[15]。腫瘤中，Twist1通過直接與E鈣黏蛋白啟動因子上的黏“E-box”序列結(jié)合，抑制E鈣黏蛋白的表達，使癌細胞緊密連接松弛，不斷間質(zhì)化，促使癌細胞粘連消失、形態(tài)改變和極性變化，最終介導EMT的發(fā)生[16]。研究證明[14，17-20]，Twist1基因的過表達不僅在乳腺癌、胃癌、肝癌等腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，同時，其下調(diào)還能夠抑制乳腺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，降低腫瘤細胞的遷移能力[21]。本研究中，Twist1在卵巢癌中的陽性表達率明顯高于卵巢良性腫瘤，并且在晚期卵巢癌組織中的陽性表達率明顯高于早期卵巢癌，差異均有統(tǒng)計學意義，提示Twist1不僅參與了卵巢癌的發(fā)生，而且還在卵巢癌的惡化中發(fā)揮著重要作用。endprint

大量研究表明，在一些惡性腫瘤中，Twist1的轉(zhuǎn)錄表達受STAT3調(diào)控。Hsu等[22]在胃癌患者組織的研究中表明，Notch/STAT3/Twist信號軸在腫瘤的形成過程中發(fā)揮著重要作用。Cheng等[23]通過STAT3-shRNA轉(zhuǎn)染和STAT3-shRNA治療STAT3增強劑處理的乳腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)Twist基因是STAT3發(fā)揮生物學效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄靶點和基因錨點，證明了在乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中STAT3/Twist信號軸的重要功能。Zhang等[24]研究也得出了相似的結(jié)論，并證明了活化的STAT3信號與Twist、E-cadherin表達相聯(lián)系，并介導肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，異常的p-STAT3/Twist/E-cadherin信號軸可能導致肝癌患者預后差。本研究通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)STAT3與Twist1在卵巢癌中的表達呈正相關(guān)，提示STAT3和Twist1蛋白關(guān)系密切，Twist1的表達可能受到STAT3的調(diào)控，進而介導EMT的發(fā)生。

總之，本研究通過對卵巢癌進行組織水平的研究，提示STAT3和Twist1作為兩個致癌基因，其表達的失調(diào)直接影響著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，兩者間具有密切的相關(guān)性，與其共同作為EMT的上游調(diào)控基因密不可分。因此，本研究為研究者們理解STAT3和Twist1在卵巢組織發(fā)生惡性生物學行為的持續(xù)表達中提供了有力依據(jù)，為卵巢癌的靶向治療和研究提供了新思路。

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（收稿日期：2017-04-25 本文編輯：張瑜杰）endprint