杜仲總黃酮對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡的影響

李揚+劉國良+姚遠

[摘要] 目的 研究杜仲總黃酮對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡的影響。 方法 體外培養(yǎng)小兒血管瘤內(nèi)皮細胞，實驗分為空白組（正常培養(yǎng)小兒血管瘤內(nèi)皮細胞）；杜仲總黃酮高劑量組（50 μg/mL杜仲總黃酮處理小兒血管瘤內(nèi)皮細胞）；杜仲總黃酮中劑量組（5 μg/mL杜仲總黃酮處理小兒血管瘤內(nèi)皮細胞）；杜仲總黃酮低劑量組（0.5 μg/mL杜仲總黃酮處理小兒血管瘤內(nèi)皮細胞），繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，MTT法檢測細胞活力；TUNEL法檢測細胞凋亡；Western blot法檢測小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和caspase-9表達水平。 結(jié)果 與空白組相比，杜仲總黃酮中、高劑量組能夠抑制小兒血管瘤內(nèi)皮細胞增值，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；杜仲總黃酮中、高劑量組細胞凋亡升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；杜仲總黃酮高劑量組Bax蛋白表達上升，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；杜仲總黃酮中、高劑量組caspase-9蛋白表達上升，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；杜仲總黃酮低、中、高劑量組Bcl-2蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結(jié)論 杜仲總黃酮能夠通過抑制Bcl-2蛋白表達、促進Bax和caspase-9蛋白表達，從而誘導小兒血管瘤內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡，有望成為是一種有效的小兒血管瘤治療劑。

[關(guān)鍵詞] 杜仲總黃酮；小兒血管瘤；細胞凋亡；Bax；Caspase-9

[中圖分類號] R284 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（c）-0021-04

[Abstract] Objective To study the influence of Eucommia ulmoides oliver flavones （EUOF） on apoptosis of infantile hemangioma endothelial cell. Methods Infantile hemangioma endothelial cells were cultured in vitro. The cells was divided into blank groups （normal cultivate infantile hemangioma endothelial cells）， high dose group of EUOF （50 μg/mL EUOF treatment infantile hemangioma endothelial cells）， the middle dose group （5 μg/mL EUOF treatment infantile hemangioma endothelial cells）， the low dose group （0.5 μg/mL EUOF treatment children hemangioma endothelial cells）， then cultured for 72 hours， MTT method detected cell vitality. The TUNEL method detected apoptosis of cells； Western blot method detected expression levels of apoptosis related proteins Bax， Bcl-2 and caspase-9 in infantile hemangioma endothelial cell. Results Compared to the blank group， infantile hemangioma endothelial cell proliferation could inhibit in EUOF middle dose group， high dose group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The rate of apoptosis in high dosages group and middle dosages group rose， the differences were statistically significant （P < 0.05）； the expression of Bax in high dose group rose， differences were statistically significant （P < 0.01）. The expression of caspase-9 potein in the high dose group middle dose group and low dose group rose， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The expression of bcl-2 in high dose group， middle dose group decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion EUOF can inhibit the the expression of Bcl-2 protein and promote the expression of Bax and caspase-9 in infantile hemangioma endothelial cells， that is expected to be an effective therapeutic agent in the disease of hemangioma.endprint

[Key words] Eucommia ulmoides oliver flavones； Hemangioma； Apoptosis； Bax； Caspase-9

血管瘤是嬰兒最常見的良性腫瘤，在新生兒中發(fā)病率可高達10%[1]，女性發(fā)病率約為男性的3倍[2]。血管瘤是一種非常奇特的腫瘤，大多數(shù)血管瘤在生后1～3個月內(nèi)出現(xiàn)，它可以在無任何治療干預下自行消退，消退期一般在1～3年，最終消退率可達80%[3]。但仍約有20%的血管瘤由于生長部位特殊、生長迅速、破壞力強、損害組織臟器功能，甚至危及生命，必須進行必要的干預處理[4-5]。所以，血管瘤的治療是一個不容忽視的問題，也是臨床和科研研究的熱點。近年來的研究表明，血管內(nèi)皮細胞增殖活性和凋亡是小兒血管瘤增生、消退的病理組織學基礎(chǔ)，而細胞凋亡是血管瘤自然消退的關(guān)鍵所在[6]。杜仲黃酮類提取物具有廣譜抑菌、抗氧化、清除自由基和增強免疫力等作用，是眾所周知的對健康有益產(chǎn)品，特別是對心血管疾病和癌癥預防[7-8]。然而杜仲黃酮類提取物對血管瘤內(nèi)皮細胞影響的報道較少，本研究觀察杜仲黃酮類提取物對血管瘤內(nèi)皮細胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白的影響，從而為其開發(fā)成治療血管瘤的藥物提供一些理論支持。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

小兒血管瘤內(nèi)皮細胞，購于上海博谷生物技術(shù)有限公司；Bax（批號：abs125423）、Bcl-2（批號：abs124378）、caspase-9（批號：abs119897）單克隆抗體、TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（批號：11684817910）均購于愛必信生物工程有限公司。

1.2 杜仲總黃酮提取及實驗用藥的制備

杜仲皮制成粉狀（過60目篩），稱取10 g，加60%乙醇200 mL，水浴回流60 min，過濾，提取2次，合并濾液，醋酸鉛胺沉淀過濾，后過大孔樹脂、聚酰胺和硅膠柱，過柱樣品與標準品蘆丁對照，測得總黃酮含量為65%。DMEM培養(yǎng)液制備總黃酮濃度分別為50、5、0.5 μg/mL的藥液，調(diào)pH至7.0～7.2后過濾備用。參照曾超珍等[9]的方法。

1.3 小兒血管瘤內(nèi)細胞的培養(yǎng)與實驗分組

小兒血管瘤內(nèi)皮細胞1×106個每孔接種于6孔板，培養(yǎng)在（DMEM）培養(yǎng)基、高溫滅菌10%FBS，0.5%血清，1%的雙抗（青霉素、鏈霉素），37℃ 5%二氧化碳濕潤培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h達到80%融合時，將細胞為空白組（正常培養(yǎng)小兒血管瘤內(nèi)皮細胞）；杜仲總黃酮高劑量組（50 μg/mL杜仲總黃酮100 μL處理小兒血管瘤內(nèi)皮細胞）；杜仲總黃酮中劑量組（5 μg/mL杜仲總黃酮100 μL處理小兒血管瘤內(nèi)皮細胞）；杜仲總黃酮低劑量組（0.5 μg/mL杜仲總黃酮100 μL處理小兒血管瘤內(nèi)皮細胞），每組6個平行樣本，重復3次。

1.4 MTT法細胞活力分析

選取無菌96孔板，96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入5×103～1×104個/mL單細胞懸液，每孔加入180 μL培養(yǎng)液，CO2孵箱中培養(yǎng)24 h并且加入倍比稀釋成3種濃度的（0.5、5、50 mg/mL）各180 μL，孵箱中培養(yǎng)48 h后吸去上清液，每孔中加入MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，自動酶標儀測量各孔的吸光度值（A值）。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡

操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加converter-POD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學顯微鏡計數(shù)并拍照。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.6 Bax、Bcl-2和caspase-9蛋白含量測定

杜仲總黃酮（0.5、5、50 μg/mL）加入小兒血管瘤內(nèi)皮細胞基培養(yǎng)72 h后，收集細胞，Western blot法測定細胞中Bax、Bcl-2和caspase-9蛋白的表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析（ANOVA），用Tamhane′s法進行方差檢驗，LSD法和SNK法對數(shù)據(jù)進行兩兩比較。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 杜仲總黃酮對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞活力的影響

與空白組比較，杜仲總黃酮對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞生長有抑制作用，并呈劑量依賴性，其中高劑量組增值率為56%，中劑量組增值率為85%，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），低劑量組對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞活力無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 杜仲總黃酮對小兒血管瘤細胞凋亡的影響

與空白組比較，杜仲總黃酮高、中劑量組細胞凋亡數(shù)量明顯上升，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。杜仲總黃酮低劑量組凋亡率無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖1、表2。

2.3 杜仲總黃酮對小兒血管瘤細胞Bax、Bcl-2、caspase-9表達的影響

與空白組比較，杜仲總黃酮高劑量組Bax表達上升，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），中、低劑量組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。杜仲總黃酮高、中、低劑量組Bcl-2蛋白表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），其中高劑量組效果最明顯。杜仲總黃酮高中低劑量組caspase-9表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），其中高劑量組效果最明顯。見圖2。

3 討論

杜仲，又名“木棉”，屬杜仲科落葉喬木，為我國特有的經(jīng)濟樹種。杜仲含許多藥用有效成分，如生物堿、黃酮類、維生素、氨基酸等，具有消炎抑菌、抗衰老、抗癌等諸多功效，現(xiàn)代研究表明：杜仲黃酮具有抗自由基、抗氧化、抑菌、抗病毒等作用[10]。杜仲中富含的黃酮類物質(zhì)，是大多數(shù)氧自由基的清除劑，可以提高的活力，減少及的生成，它可以增加冠脈流量，對實驗性心肌梗塞有對抗作用；對急性心肌缺血有保護作用；對治療冠心病、高血壓等疾病有顯著效果，并且有抗菌消炎的作用，但杜仲黃酮類對小兒血管瘤細胞的凋亡作用研究卻少有報道。endprint

細胞凋亡是多細胞有機體為了調(diào)控機體發(fā)育，維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞主動死亡過程。細胞凋亡參與機體許多病理生理過程。Bcl-2 基因家族在控制細胞凋亡過程中起著重要的作用，該家族包括抑制凋亡的基因 bcl-2 和bcl-xL，以及促進凋亡基因Bax和 bad[11-12]。它們具有同源的氨基酸序列。Bax的過表達已經(jīng)證明可以促進細胞的死亡，bcl-2是一種抑制細胞凋亡蛋白，在人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[13-14]。本研究顯示與空白組相比，杜仲總黃酮高劑量組Bax表達上升，中、低劑量組無明顯變化（P > 0.05），而杜仲總黃酮高、中、低劑量組Bcl-2蛋白表達明顯下降（P < 0.05），其中高劑量組效果最明顯，說明杜仲總黃酮的劑量對細胞凋亡因子的影響是關(guān)鍵，為了治療效果更佳明顯應(yīng)該選擇高劑量用于后期實驗研究。

caspase家族是執(zhí)行細胞凋亡的關(guān)鍵酶家族，caspase-9 作為其中一員，屬于該家族的凋亡起始組，其活化可以激活凋亡效應(yīng)組的 caspase-3 和caspase-7，從而誘導細胞凋亡[15-16]。而caspase-3和caspase-9 之間存在正反饋效應(yīng)，可使細胞凋亡加速[17-19]。血管內(nèi)皮細胞的增殖與凋亡是維持血管內(nèi)徑的重要因素，這種平衡的打破，就會導致血管的畸形[20-21]。本研究顯示與空白組相比，杜仲總黃酮高、中劑量組caspase-9表達上升，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），其中高劑量組效果最明顯。低劑量組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），說明杜仲總黃酮對caspase-9表達具有影響作用，這種作用成劑量依賴性。

本研究證實杜仲總黃酮可以在體外以劑量依賴性的方式誘導血管瘤內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡。這種凋亡可能是下調(diào)bcl-2表達，上調(diào)Bax、caspase-9表達而起作用，因此杜仲總黃酮是一類具有開發(fā)作為治療血管瘤的原料藥。

[參考文獻]

[1] 陳曉東，林曉曦.嬰小兒血管瘤發(fā)病機制的研究進展[J].組織工程與重建外科，2010，22（3）：18-19.

[2] 陳超，楊體泉.嬰小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡研究進展[J].中華實用兒科臨床雜志，2007，22（11）：869-871.

[3] 馬剛，林曉曦，金云波，等.嬰小兒血管瘤發(fā)生與消退的研究進展[J].中華小兒外科雜志，2007，28（5）：266-268.

[4] 劉國林.嬰小兒血管瘤增殖、退化機制的研究進展[J].當代醫(yī)學，2010，16（1）：27-29.

[5] 趙卓，張艷，張園程，等.嬰小兒皮膚血管瘤的治療現(xiàn)狀及研究進展[J].實用皮膚病學雜志，2013，6（4）：224-226.

[6] Yu H，Littlewood T，Bennett M. Forkhead transcription factor FOXO3a potently induces smooth muscle cell apoptosis and promotes extracellular matrix degradation through activation of matrix metalloproteinases [J]. Atherosclerosis，2014，235（2）：e24.

[7] 丁艷霞，郭洋靜，任瑩璐，等.杜仲雄花中黃酮類化學成分及其抗氧化活性研究[J].中草藥，2014，45（3）：323-327.

[8] 馮晗，周宏灝，歐陽冬生.杜仲的化學成分及藥理作用研究進展[J].中國臨床藥理學與治療學，2015，20（6）：713-720.

[9] 曾超珍，劉志祥.微波提取杜仲總黃酮的工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（5）：1170-1171.

[10] 彭紅梅，李小姝.杜仲的藥理研究現(xiàn)狀及應(yīng)用展望[J].中醫(yī)學報，2013，28（1）：72-73.

[11] Radhakrishna PG，Srivastava AS，Hassanein TI，et al. Induction of apoptosis in human lung cancer cells by curcumin [J]. Cancer Lett，2004，208（2）：163-170.

[12] Mat hiasen IS，Sergeev IN，Bast holm L，et al. Calcium and calpain askey mediators of apoptosis-like death induced by vitamin D compounds in breast cancer cells [J]. J Biol Chem，2002，277（34）：30738-30745.

[13] 張艷.β受體阻滯劑誘導增殖期血管瘤凋亡的研究[D].天津：天津醫(yī)科大學，2014.

[14] 彭威，寧慧婷，徐仙赟，等.普萘洛爾和美托洛爾體外調(diào)控小鼠血管瘤細胞增殖及凋亡作用的初步比較[J].中國小兒血液與腫瘤雜志，2016，21（2）：77-80.

[15] 周曉波，趙成鵬，王鎏，等.腫瘤抑素影響嬰小兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖與凋亡的相關(guān)機制[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2015，25（28）：17-21.

[16] Scatena R，Bottoni P，Botta G，et al. The role of mitochondria in pharmacotoxicology：a reevaluation of an old，newly emerging topic [J]. Ajp Cell Physiol，2007，293（1）：12-21.

[17] Rixe O，F(xiàn)ojo T. Is cell death a critical end point for anticancer therapies or is cytostasis sufficient？[J]. Clin Cancer Res，2007，13（24）：7280-7287.

[18] Groenendyk J，Michalak M. Endoplasmic reticulum quality control and apoptosis [J]. Acta Biochim Pol，2005，52（6）：15-20.

[19] Morishima N，Nakanishi K，Tsuchiya K，et al. Translocation of Bim to the endoplasmic reticulum （ER） mediates ER stress signaling for activation of caspase-12 during ER stress-induced apoptosis [J]. J Biol Chem，2004，279（48）：50375-50385.

[20] Shang YC，Chong ZZ，Hou J，et al. The Forkhead Transcription Factor FOXO3a Controls Microglial Inflammatory Activation and Eventual Apoptotic Injury through Caspase 3 [J]. Curr Neurovasc Res，2009，6（1）：20-31.

[21] Banfi C，Brioschi M，Wait R，et al. Proteome of endothelial cell-derived procoagulant microparticles [J]. Proteomics，2005，5（17）：4443-4455.

（收稿日期：2017-04-30 本文編輯：蘇 暢）endprint