男性年齡與精子頂體酶活性及精子DNA碎片指數(shù)的相關(guān)性分析

李雪瑤，楊菁，李潔，徐玲

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

男性年齡與精子頂體酶活性及精子DNA碎片指數(shù)的相關(guān)性分析

李雪瑤，楊菁*，李潔，徐玲

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

目的探討男性年齡與精子頂體酶活性、精子DNA碎片指數(shù)(DFI)的相關(guān)性。方法選取2016年1～8月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的436例不育癥男性患者為研究對(duì)象，所有患者均行精液常規(guī)檢查、精子頂體酶活性檢查和(或)精子DFI分析。將患者按年齡分為<30歲、30～39歲、≥40歲3組，分析各組的精液常規(guī)、頂體酶活性及精子核DFI的差異及其相關(guān)性。結(jié)果不同年齡段患者的體重指數(shù)(BMI)、禁欲天數(shù)、精液量無(wú)顯著性差異(P>0.05)；年齡≥40歲組患者的前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、活動(dòng)精子百分率及精子頂體酶活性顯著低于<30歲和30～39歲組(P<0.05)；≥40歲組患者的精子DFI顯著高于<30歲和30～39歲組(P<0.05)。年齡與前向運(yùn)動(dòng)精子百分率及活動(dòng)精子百分率之間呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，但是相關(guān)性較弱。精子頂體酶活性與精子正常形態(tài)率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、活動(dòng)精子百分率呈正相關(guān)(P<0.05)；精子DFI與年齡、禁欲天數(shù)、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率呈正相關(guān)(P<0.01)，與精液量、精子濃度、活動(dòng)精子百分率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；精子頂體酶活性和DFI之間無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論年齡增長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致精液前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、活動(dòng)精子百分率、精子頂體酶活性、DFI等參數(shù)改變，直接或間接影響男性生育力。說(shuō)明年齡對(duì)男性不育的影響是多方面的，建議有生育需求的大齡(≥40歲)男性盡早進(jìn)行生育咨詢與評(píng)估。

男性； 年齡； 頂體酶活性； 精子DNA碎片指數(shù)； 精液常規(guī)

(JReprodMed2017，26(9)：869-873)

不孕不育不僅影響患者身心健康，而且嚴(yán)重影響家庭和諧，逐漸成為一個(gè)全球性的問(wèn)題。與此同時(shí)，晚婚晚育、二胎政策的開(kāi)放以及失獨(dú)等社會(huì)因素，使得大量高齡夫妻有了迫切的生育要求。但是，越來(lái)越多的證據(jù)表明，隨著年齡增大，女性的生育力明顯下降，且男性生育力也有所下降[1-3]。一般認(rèn)為，女性年齡超過(guò)35歲，其生育力、正常受精率、妊娠率及活產(chǎn)率等明顯下降，而年齡對(duì)于男性生育力的影響以及影響程度，目前尚無(wú)定論。大數(shù)據(jù)的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，在調(diào)整了其他因素的影響后，女性年齡≥35歲，流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)明顯升高；而當(dāng)女性年齡≥35歲，且男性年齡≥40歲時(shí)，其流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)值更高[4-5]。有研究表明，男性年齡的增大會(huì)導(dǎo)致男性性功能下降，以及精液質(zhì)量如精子正常形態(tài)率與精子活力的下降[6-7]。精子頂體酶是一種以酶原形式貯存在精子頂體內(nèi)的胰蛋白酶，受精時(shí)，精子頂體酶釋放，為精卵結(jié)合創(chuàng)造條件[8]，因此著床率的下降可能與頂體酶活性的降低、精卵結(jié)合困難有關(guān)。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，男性年齡的增大使精子基因組的缺陷發(fā)生率增大[9]，比如與患病率顯著增加相關(guān)的基因組與精子外遺傳性缺陷，也可能與精子DNA碎片指數(shù)(DFI)增大[10]、氧化應(yīng)激損害等有關(guān)。還有研究表明，在自然妊娠與人工授精過(guò)程中，去掉女性年齡因素的影響后發(fā)現(xiàn)，隨著其配偶的年齡增大，女性妊娠率降低，而自然流產(chǎn)率增高[11-12]。

本研究擬通過(guò)分析、比較不同年齡段的男性(<30歲、30～39歲、≥40歲)精液常規(guī)參數(shù)、精子頂體酶活性及精子DFI的關(guān)系，探討年齡對(duì)男性不育的影響。

材料與方法

一、研究對(duì)象

收集2016年1～8月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的不育癥男性患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)身體狀況良好；(2)體格檢查男性生殖器無(wú)發(fā)育畸形；(3)抽血排除肝腎功能異常等；(4)進(jìn)行了精液常規(guī)檢查、精子頂體酶活性檢查和(或)精子DFI分析。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)精液不液化；(2)手淫取精失敗或精液灑出等。所有患者簽署知情同意書(shū)，一共納入436例患者，全部進(jìn)行了精液常規(guī)的檢查，其中277例患者進(jìn)行了精子頂體酶活性的檢查，415例患者進(jìn)行了精子DFI檢查，257例患者同時(shí)進(jìn)行了精子頂體酶活性與精子DFI檢查。

二、研究方法

1.分組：根據(jù)年齡不同將患者分為3組：<30歲組(96例)、30～39歲組(253例)、≥40歲組(87例)。

2.精液標(biāo)本采集及處理：建議患者禁欲3～7 d，手淫取精法獲取精液，并將全部精液裝于一次性尿杯，37℃水浴箱內(nèi)液化30 min。排除液化時(shí)間大于60 min的標(biāo)本。

3.精液常規(guī)檢查：參照第五版《世界衛(wèi)生組織人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[13]推薦的方法檢測(cè)，包括精液體積、液化時(shí)間、pH值、精子濃度、正常形態(tài)率、精子活力。精液分析儀為西班牙CSA全自動(dòng)精子質(zhì)量分析系統(tǒng)。

4.精子頂體酶活性檢測(cè)：使用精子頂體染色試劑盒(PSA-FITC，深圳華康生物)檢測(cè)精子頂體酶活性，簡(jiǎn)要步驟如下：測(cè)定精液常規(guī)參數(shù)后，測(cè)定和對(duì)照Ep管中加入7.5×106個(gè)精子，離心去除精漿，按照試劑盒使用說(shuō)明操作，依次加入相關(guān)試劑，水浴后離心，紫外分光光度計(jì)讀取各管405 nm的OD值，計(jì)算頂體酶活性。精子頂體酶活性正常參考值為48.2～218.7 μIU/106精子。共檢查277例，<30歲組64例，30～39歲組157例，≥40歲組56例。

5.精子DFI檢查：采用精子核染色體結(jié)構(gòu)檢測(cè)(SCSA法)，使用精子核碎片檢試劑盒(杭州星博生物科技)，調(diào)整精子密度為1×106～2×106個(gè)/ml，取100 μl檢測(cè)精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，使用流式細(xì)胞儀(Accuri C6，BD，美國(guó))進(jìn)行定量分析，通過(guò)軟件計(jì)算精子DFI。DFI正常參考值<15%，15～30%為偏高，≥30%認(rèn)為碎片指數(shù)異常，考慮精子核DNA完整性差。共檢查415例，<30歲組90例，30～39歲組240例，≥40歲組85例。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組患者一般資料及精液常規(guī)參數(shù)比較

各組患者的體重指數(shù)(BMI)均在正常范圍內(nèi)，組間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。精液常規(guī)參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)：<30歲與30～39歲組的精子濃度略高于≥40歲組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；前向運(yùn)動(dòng)精子百分率及活動(dòng)精子百分率顯著高于≥40歲組(P<0.05)。30～39歲組的精子正常形態(tài)率顯著高于≥40歲組(P<0.05)。3組患者禁欲天數(shù)、精液量及非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者的一般資料與精液常規(guī)參數(shù)比較(-±s)

注：與≥40歲組比較，*P<0.05，**P<0.01

二、患者年齡與BMI、精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：年齡與BMI、禁欲天數(shù)、精液量、濃度、正常形態(tài)率、非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率之間無(wú)相關(guān)性，與前向運(yùn)動(dòng)精子百分率及活動(dòng)精子百分率之間呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，但是相關(guān)性較弱(r分別為-0.079和-0.142)(表2)。

表2 患者年齡與BMI、精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性

三、三組患者精子頂體酶活性與DFI的比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：與≥40歲組相比，<30歲與30～39歲組的精子頂體酶活性顯著升高(表3a)，而DFI顯著下降(P均<0.05)(表3b)

表3a 不同年齡段男性精子頂體酶活性比較(-±s)

注：與≥40歲組比較，*P<0.05

表3b 不同年齡段男性精子DFI比較(-±s)

注：與≥40歲組比較，**P<0.01

四、頂體酶活性及DFI與年齡及精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示：精子頂體酶活性與精子正常形態(tài)率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、活動(dòng)精子百分率呈正相關(guān)(P<0.05)；精子的DFI與年齡、禁欲天數(shù)、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率呈正相關(guān)(P<0.01)，與精液量、精子濃度、活動(dòng)精子百分率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；精子頂體酶活性和DFI之間無(wú)相關(guān)性(表4)。

討 論

本文通過(guò)分析<30歲、30～39歲、≥40歲3個(gè)不同年齡段男性的精液常規(guī)檢查、精子頂體酶活性與精子DFI結(jié)果的相關(guān)性，探討年齡對(duì)男性不育的影響，結(jié)果顯示隨著年齡的增長(zhǎng)，男性的BMI、禁欲天數(shù)、精液體積無(wú)明顯變化，精子濃度呈下降趨勢(shì)，特別是≥40歲的男性，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<30歲與30～39歲男性之間的精液參數(shù)、頂體酶活性與DFI無(wú)明顯差異，而≥40歲男性的精子正常形態(tài)率與前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、活動(dòng)精子百分率、頂體酶活性較<30歲與30～39歲男性相比明顯下降，DFI呈顯著上升趨勢(shì)(P均<0.05)，說(shuō)明男性年齡對(duì)男性不育有多方面的影響，其進(jìn)一步的關(guān)系需要更大樣本量的研究。

有研究表明，男性年齡的增大導(dǎo)致的不育與精液體積、精子數(shù)量的減少、精子活力的下降，以及正常形態(tài)精子的減少密切相關(guān)[14-15]，這與本研究結(jié)果一致。供卵試管嬰兒中，消除了女性年齡的影響后發(fā)現(xiàn)，男方年齡超過(guò)50歲后，囊胚形成率與妊娠結(jié)局受到明顯影響，而且隨著年齡的增大，精液體積與精子活性有下降趨勢(shì)[16]。精子頂體酶下降會(huì)導(dǎo)致卵丘分解及透明帶的穿透失敗，從而影響男性生育力[10]。精子核DNA 關(guān)系到父系遺傳，DNA的完整性是保持物種完整性、成功受精和胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)。Aitken等[17]研究發(fā)現(xiàn)，隨著男性年齡的增加，精子DFI也隨之升高，二者呈明顯正相關(guān)，與本研究一致。多項(xiàng)研究表明，DFI能夠較準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)男性生育力，精子DNA損傷可以導(dǎo)致受精失敗或影響受精后原核的形成、胚胎著床、胚胎發(fā)育和子代的健康[18-19]。年齡的增大導(dǎo)致核苷酸的多態(tài)性，有研究顯示，隨著父方年齡的增大，單基因新創(chuàng)突變會(huì)每年增加兩個(gè)[20]，這可能對(duì)子代造成極大的影響。還有研究證實(shí)，年齡>35歲的男性，其總睪酮與游離睪酮顯著低于年齡≤35歲的男性，而LH與FSH無(wú)明顯差異[21]，說(shuō)明年齡越大的男性，其睪丸對(duì)LH與FSH的反應(yīng)性越差，從而間接影響男性生育力。而年齡的增大，可由于氧化應(yīng)激[22]、內(nèi)分泌問(wèn)題[10]、輻射等多種原因，導(dǎo)致男性不育。有學(xué)者認(rèn)為，年齡增長(zhǎng)導(dǎo)致男性睪丸、附睪等生殖系統(tǒng)器官發(fā)生退化，性功能減退導(dǎo)致不育[23]。也有人認(rèn)為，由于年齡的增大，罹患各種疾病的概率因此增大，間接影響男性生育力[24]。

進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，精子正常形態(tài)率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、非前向運(yùn)動(dòng)精子百分率以及活動(dòng)精子百分率與精子頂體酶活性正相關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明精子頂體酶活性能夠較好地反映精液質(zhì)量，提示其可以作為評(píng)估男性生育力的指標(biāo)之一，這與之前一些文獻(xiàn)[25-29]的觀點(diǎn)一致。有學(xué)者認(rèn)為，精子畸形可能導(dǎo)致頂體缺失、過(guò)薄、頂體不完整等情況[30-32]，可能影響卵細(xì)胞卵丘的分解及精子對(duì)卵母細(xì)胞透明帶的穿透[8]，從而導(dǎo)致男性不育。DFI與年齡、禁欲天數(shù)呈正相關(guān)，這與劉安娜[33]的研究一致，可能因?yàn)槟挲g與禁欲天數(shù)的增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激等的累積增多，精子DNA的損傷加重，因此DFI增加。Evenson等[34]認(rèn)為DFI 10%～15%為高生育力，16%～29%為中度生育力，≥30%為低度生育力，≥80%為無(wú)生育能力。本研究中，<30歲男性平均DFI為24.33%，30～39歲男性25.10%，≥40歲男性高達(dá)37.80%，3組患者DFI平均值均較高，可能因?yàn)楸狙芯考{入的人群較多傾向于不育患者。

綜上所述，男性不育的影響因素有多種，且機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，年齡只是其中一個(gè)直接或間接的因素，但是年齡對(duì)于男性不育的影響是多方面的。雖然相對(duì)于女性，男性年齡對(duì)于妊娠結(jié)局的影響較小，但是年齡對(duì)于男性不育的影響仍是不可忽視的，所以對(duì)有生育需求的年齡較大的男性，特別是超過(guò)40歲的男性，建議盡早進(jìn)行相關(guān)檢查，進(jìn)行生育咨詢與評(píng)估。

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[編輯：辛玲]

Relationshipbetweenspermacrosinactivity&spermDNAfragmentationindexandmaleage

LI Xue-yao，YANG Jing*，LI Jie，XU Ling

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060

Objective： To analyze the relationship between male age and sperm acrosin activity，sperm DNA fragmentation index (DFI).

Methods： A total of 436 infertile men in our reproductive medical center from January to August 2016 were investigated.All the patients were conducted the examination of semen parameters，sperm acrosin activity and (or) sperm DFI.The patients were divided into 3 groups according to male age：<30 years group，31-39 years group，and≥40 years group.Comparison and correlation analysis among their semen parameters，sperm acrosin activity and sperm DFI were conducted.

Results： There were no significant differences in BMI，days of abstinence，semen volume among the three groups (P>0.05).The percentage of morphologically normal sperm，progressive sperm rate and sperm motility，sperm acrosin activity in ≥40 years group were significantly lower (P<0.05)，but DFI was significantly higher than <30 years group and 31-39 years group (P<0.05).There was a negative correlation between age and progressive sperm rate and sperm motility (P<0.05).There were positive correlations between sperm acrosin activity and the percentage of morphologically normal sperm，progressive sperm rate and motility (P<0.05).Sperm DFI was positively correlated with age，abstinence days，progressive sperm rate (P<0.01)，while it was negatively correlated with semen volume，semen concentration & motility (P<0.05).No correlation was found between sperm acrosin activity and DFI.

Conclusions： Increase of male age can lead to the deterioration of progressive sperm rate，sperm motility，sperm acrosin activity and sperm DFI，and directly or indirectly affects male infertility.Preconception counseling and evaluation of fertility are recommended for elder men (≥40 years) with reproduction requirement.

Male； Age； Sperm acrosin activity； Sperm DNA fragmentation index； Semen parameters

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.004

2017-03-21；

2017-04-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(81401255)

李雪瑤，女，湖北咸寧人，碩士研究生，生殖醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè).(*

，Email：dryangqing@hotmail.com)