體外受精-胚胎移植中與生化妊娠相關(guān)因素的分析

龔衍，趙梓琳，劉偉信，曾玖芝，葉飛，賴薇

(四川省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，成都 610045)

體外受精-胚胎移植中與生化妊娠相關(guān)因素的分析

龔衍*，趙梓琳，劉偉信，曾玖芝，葉飛，賴薇

(四川省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，成都 610045)

目的分析體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中導(dǎo)致生化妊娠的相關(guān)因素。方法回顧性分析2014年1月至2016年12月在我院行IVF/ICSI-ET助孕后生化妊娠的68個(gè)周期，以同期正常宮內(nèi)妊娠的307個(gè)周期為對照組，比較兩組患者的一般情況及助孕相關(guān)指標(biāo)，采用Logistic回歸分析篩選生化妊娠的影響因素。結(jié)果兩組患者的一般情況及助孕相關(guān)指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)女方年齡、亞臨床甲狀腺功能減退(SCH)及受精方式是生化妊娠的影響因素(P<0.05)，且年齡偏大、合并SCH未治療或治療后仍不正常、ICSI操作的患者更易發(fā)生生化妊娠。結(jié)論開始IVF-ET治療前應(yīng)重視甲狀腺功能檢查，及時(shí)糾正SCH，嚴(yán)格掌握ICSI指征及規(guī)范操作，重視高齡女性患者，盡量改善其卵母細(xì)胞質(zhì)量等有助于降低臨床上生化妊娠發(fā)生率。

體外受精-胚胎移植； 生化妊娠； 年齡； 亞臨床甲減； 卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射

(JReprodMed2017，26(9)：896-901)

體外受精-胚胎移植技術(shù)(IVF-ET)在臨床開展接近40年，卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)作為常規(guī)IVF的衍生技術(shù)，適用于嚴(yán)重男性因素不孕及常規(guī)IVF受精失敗的患者，在臨床開展也近30年，IVF/ICSI妊娠率逐漸提高，但仍徘徊在50%左右，其中部分為生化妊娠[1]。生化妊娠指胚胎已經(jīng)著床，但由于某種原因妊娠終止，β-HCG只是一過性升高[2]。生化妊娠在IVF/ICSI中的發(fā)生率約為12%～30%[3]，導(dǎo)致助孕失敗，增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力，迄今為止，其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。本研究回顧性分析我院近3年發(fā)生的68例生化妊娠的臨床資料，旨在探討其發(fā)生的相關(guān)因素，為臨床中采取針對性措施提供參考，最終改善IVF/ICSI的助孕結(jié)局。

資料與方法

一、研究對象和分組

回顧性分析2014年1月至2016年12月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI-ET助孕治療患者的臨床資料。納入新鮮胚胎移植后生化妊娠和臨床妊娠的周期，排除合并子宮畸形、子宮內(nèi)膜異位癥、夫婦至少一方染色體異常的周期，共納入429個(gè)周期，其中生化妊娠68個(gè)周期，臨床妊娠361個(gè)周期，生化妊娠發(fā)生率為15.85%(68/429)。臨床妊娠中正常宮內(nèi)妊娠307個(gè)周期，以正常宮內(nèi)妊娠者為對照組。

生化妊娠診斷標(biāo)準(zhǔn)為：β-HCG超過參考值但升高不明顯或下降，或移植后28 d陰道B超未見孕囊[4]。正常宮內(nèi)妊娠診斷標(biāo)準(zhǔn)：移植后28 d陰道B超見子宮內(nèi)孕囊、胚芽及胎心搏動(dòng)。

二、研究方法

1.控制性超排卵方案：根據(jù)患者年齡、卵巢儲(chǔ)備功能等選擇促排卵方案，卵巢儲(chǔ)備功能正常患者一般采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長方案；卵巢儲(chǔ)備功能下降、多囊卵巢綜合征患者一般采用GnRH拮抗劑(GnRH-ant)方案。給予果納芬(默克雪蘭諾，德國)150～225 U啟動(dòng)，根據(jù)卵泡生長、激素水平情況調(diào)整促性腺激素(Gn)的種類及用量。當(dāng)1～2個(gè)卵泡直徑達(dá)到18 mm后注射艾澤(默克雪蘭諾，德國)250 μg，36.5 h后B超引導(dǎo)下取卵。

2.IVF、胚胎培養(yǎng)：取卵后短時(shí)授精或ICSI授精，取卵后2.5～7.5 h拆除顆粒細(xì)胞以觀察卵母細(xì)胞形態(tài)并評估其成熟度。將胞質(zhì)顆粒細(xì)小、分布均勻，無發(fā)黑，胞漿內(nèi)無壞死區(qū)、空泡、折光小體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等內(nèi)容物，第一極體光滑、完整，呈圓形或橢圓形，透明帶及卵周隙正常的MⅡ卵定義為正常形態(tài)卵母細(xì)胞，反之為異常形態(tài)卵母細(xì)胞[5]。1個(gè)周期的卵母細(xì)胞中只要有1個(gè)卵母細(xì)胞形態(tài)明顯異常即定義為卵母細(xì)胞形態(tài)異常周期。

受精后20～22 h觀察受精情況，雙原核(2PN)為正常受精。受精后第2、3天觀察卵裂、胚胎情況。根據(jù)形態(tài)學(xué)參數(shù)將第3天(D3)胚胎分為4級。Ⅰ級：卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)均勻清晰，沒有顆粒現(xiàn)象，碎片0～5%；Ⅱ級：卵裂球大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片10%～20%；Ⅲ級：細(xì)胞大小明顯不均勻，形態(tài)明顯不規(guī)則，胞質(zhì)見顆粒現(xiàn)象，碎片21%～50%；IV級：細(xì)胞大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象，碎片>50%。優(yōu)質(zhì)胚胎定義：Ⅰ、Ⅱ級，卵裂球>6個(gè)。Ⅰ～Ⅲ級胚胎為可移植胚胎。優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/可移植胚胎數(shù)×100%。移植胚胎中至少有1個(gè)優(yōu)胚的周期為有優(yōu)質(zhì)胚胎的周期。

3.ET、黃體支持及隨訪：取卵后3 d腹部超聲引導(dǎo)下移植1～3個(gè)胚胎。取卵日肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)60 mg/d進(jìn)行黃體支持，胚胎移植日口服地屈孕酮(上海雅培)20 mg/d。移植后14 d查血清β-HCG，確診生化妊娠者移植28 d行B超檢查。

4.觀察指標(biāo)：統(tǒng)計(jì)每個(gè)周期的一般情況：雙方年齡、不孕因素、女方體重指數(shù)(BMI)、自然流產(chǎn)史、是否合并亞臨床甲狀腺功能減退(SCH)、男方精子DNA碎片率。統(tǒng)計(jì)IVF過程中：HCG日孕酮(P)水平、卵母細(xì)胞形態(tài)、受精方式、優(yōu)胚率、移植胚胎數(shù)、移植胚胎中是否有優(yōu)胚、子宮內(nèi)膜厚度等。

男方IVF前常規(guī)按照WHO第五版精液分析標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液檢查，精子DNA碎片率>15%為升高。女方IVF術(shù)前常規(guī)檢查甲狀腺功能，如異常即給予相應(yīng)治療。SCH的診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考美國甲狀腺學(xué)會(huì)推薦的妊娠早期診斷標(biāo)準(zhǔn)，促甲狀腺激素(TSH)>2.5 mU/L，游離甲狀腺素(FT4)、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)正常。治療：口服左甲狀腺素鈉片(柏林，德國)，將TSH控制在2.5 mU/L以下[6]。ET后首次驗(yàn)孕日查甲狀腺功能，如TSH<2.5 mU/L為治療后正常，否則為治療后仍不正常，未遵醫(yī)囑服藥者為未治療。HCG日P值<9.51 nmol/L為正常；如HCG日P≥9.51 nmol/L或≥4.76 nmol/L持續(xù)超過3 d，HCG日內(nèi)膜<8 mm則取消移植，全胚冷凍。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、一般情況比較

生化妊娠組68個(gè)周期，女方年齡22～45歲，男方年齡23～58歲；正常宮內(nèi)孕組307個(gè)周期，女方年齡20～43歲，男方年齡24～46歲。兩組患者一般情況比較無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、助孕相關(guān)指標(biāo)比較

生化妊娠組移植日內(nèi)膜厚度為8～18 mm，卵母細(xì)胞形態(tài)異常的周期1個(gè)；正常宮內(nèi)孕組移植日內(nèi)膜厚度為6～20 mm，卵母細(xì)胞形態(tài)異常的周期2個(gè)。兩組患者助孕治療中相關(guān)指標(biāo)比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、單因素Logistic回歸分析

以組別為結(jié)果變量，其余變量為自變量進(jìn)行賦值(具體見表3)，并分別進(jìn)行單變量Logistic回歸分析，結(jié)果見表4。由表4可知，在單因素分析中，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素包括：女方年齡、精子DNA碎片率、SCH、受精方式。

四、多因素Logistic回歸分析

將女方年齡、SCH、男方精子DNA碎片率、受精方式作為多因素Logistic回歸分析的候選變量，采用后退法對變量進(jìn)行篩選，最后進(jìn)入模型的變量和參數(shù)見表5。由表5可知，除男方DNA碎片率外，女方年齡、SCH、受精方式均P<0.05，因此女方年齡、SCH、受精方式與生化妊娠有關(guān)，結(jié)合回歸分析前對各變量的賦值及系數(shù)均為負(fù)值，分析得出年齡偏大、合并SCH未治療或治療后仍不正常、ICSI受精患者更易發(fā)生生化妊娠。

表1 兩組患者一般情況比較 [(-±s)，n (%)]

表2 兩組患者助孕治療相關(guān)指標(biāo)比較 [(-±s)，n (%)]

表3 研究變量的定義及賦值

表4 生化妊娠相關(guān)因素的單因素Logistic分析結(jié)果

注：*P<0.05

表5 與生化妊娠相關(guān)因素的多因素Logistic回歸分析

討 論

生化妊娠是早期妊娠丟失(FTPL)的一種特殊類型，在自然受孕的婦女中發(fā)生率約為30%，在IVF/ICSI中發(fā)生率約為12%～30%[3]，本研究中生化妊娠在IVF/ICSI中的發(fā)生率為15.85%，與文獻(xiàn)[3]報(bào)道相符。生化妊娠發(fā)生機(jī)制尚不完全明確，可能與胚胎染色體異常(主要為非整倍體)、母體內(nèi)分泌、免疫等異常，精子質(zhì)量異常，環(huán)境中有毒、有害物質(zhì)等有關(guān)[3]。對這些因素進(jìn)行相關(guān)分析的報(bào)道不多，尤其對胚胎染色體、環(huán)境因素的檢測相對困難，因此我們分析了臨床常見的一些指標(biāo)：患者一般情況、病史、IVF/ICSI過程中的相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)女方年齡、SCH、ICSI受精是生化妊娠的危險(xiǎn)因素。

一、重視女性高齡患者

女性年齡越大，卵母細(xì)胞線粒體、紡錘體老化和同源染色體不分離、姐妹染色單體過早分離越容易發(fā)生，卵母細(xì)胞非整倍體發(fā)生率增加、胚胎質(zhì)量下降，進(jìn)而導(dǎo)致妊娠率下降、生化妊娠率增加[7]。本研究結(jié)果顯示高齡是導(dǎo)致生化妊娠的因素之一，因此重視高齡患者，促排卵前盡量改善卵母細(xì)胞質(zhì)量有望降低生化妊娠率。女性年齡增加，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、形態(tài)學(xué)可能發(fā)生異常，出現(xiàn)胞漿顆粒化、極體碎裂、卵周隙增大等，研究顯示生化妊娠比正常妊娠卵母細(xì)胞形態(tài)異常所占的比例增加[5]。因本研究樣本量較小，生化妊娠組卵母細(xì)胞異常周期僅1個(gè)，正常宮內(nèi)孕組僅2個(gè)，沒有進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有待今后擴(kuò)大樣本量后再進(jìn)行研究。

二、IVF前重視甲狀腺功能檢查并糾正SCH可減少生化妊娠

本研究結(jié)果顯示SCH是生化妊娠的危險(xiǎn)因素。不育婦女中SCH的發(fā)生率約4.0%～15.4%[8]。甲狀腺素在維持人類正常生殖功能中發(fā)揮重要作用：TSH及其受體和甲狀腺激素受體在人卵巢顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞均有表達(dá)，協(xié)同調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞增殖與凋亡、P分泌、滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入等[8-9]。SCH患者體內(nèi)性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)減少，游離睪酮與雌二醇(E2)增加，抑制FSH分泌，直接降低顆粒細(xì)胞對FSH的反應(yīng)性，影響卵母細(xì)胞的發(fā)育；升高的TSH通過對垂體-甲狀腺軸的負(fù)反饋，使促甲狀腺素釋放激素(TRH)升高，多巴胺分泌減少，引起高泌乳素血癥，導(dǎo)致排卵障礙、黃體功能不足[10]；甲狀腺素協(xié)同EGF的作用下降，影響胚胎著床及正常妊娠的維持[11]；降鈣素水平降低，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化和胚泡發(fā)育的作用下降，影響胚胎著床，導(dǎo)致生化妊娠。

IVF過程中患者體內(nèi)E2、SHBG、P水平升高，對于TSH及甲狀腺激素水平的要求可能與自然妊娠不完全一致。研究發(fā)現(xiàn)IVF/ICSI周期中TSH>2.5 mU/L時(shí)，患者的流產(chǎn)率升高，活產(chǎn)率、種植率降低，TSH>4.2 mU/L時(shí)流產(chǎn)率高達(dá)24.24%，生化妊娠率高達(dá)11.80%[1]。因此，2012年美國內(nèi)分泌協(xié)會(huì)臨床實(shí)踐指南建議，有SCH或不孕癥病史、年齡超過30歲、甲狀腺抗體陽性等情況的婦女，孕前最好控制TSH水平在2.5 mU/L以內(nèi)[6]。我們參照該指南給予SCH患者左甲狀腺素片治療，結(jié)果正常宮內(nèi)妊娠組比生化妊娠組TSH<2.5 mU/L的周期所占比例更高，統(tǒng)計(jì)分析也顯示SCH未治療或治療后未正常是生化妊娠的危險(xiǎn)因素，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致。目前國內(nèi)尚沒有指南規(guī)定IVF患者孕前SCH的診斷標(biāo)準(zhǔn)、治療目標(biāo)等，有必要就此深入研究。

三、嚴(yán)格掌握ICSI指針有望減少生化妊娠

目前，ICSI對胚胎著床率、生化妊娠率是否有影響還存在爭議[13-14]。本研究數(shù)據(jù)分析顯示ICSI是生化妊娠的危險(xiǎn)因素。ICSI導(dǎo)致生化妊娠的可能原因?yàn)椋篒CSI適應(yīng)證包括嚴(yán)重少、弱、畸形精子癥，附睪、睪丸取精，前次IVF受精失敗者，這部分患者本身可能存在嚴(yán)重的精子或卵母細(xì)胞缺陷，導(dǎo)致胚胎質(zhì)量差、發(fā)育停滯；ICSI過程避開了正常受精時(shí)精卵融合后觸發(fā)的卵母細(xì)胞皮質(zhì)反應(yīng)，但可能損傷卵母細(xì)胞的微管微絲系統(tǒng)，影響受精卵及胚胎發(fā)育[14]。男性年齡較大時(shí)精子DNA碎片率升高，精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致胚胎質(zhì)量下降甚至發(fā)育停滯，DNA碎片率≥30%時(shí)流產(chǎn)率增加[15]。我們的數(shù)據(jù)顯示兩組患者不孕因素構(gòu)成比接近，且與生化妊娠沒有相關(guān)性；男性年齡、DNA碎片率亦與生化妊娠沒有相關(guān)性。因此，生化妊娠可能與ICSI適應(yīng)癥無關(guān)，而與ICSI操作本身對卵母細(xì)胞、胚胎質(zhì)量的影響有關(guān)，因此嚴(yán)格掌握ICSI指征可能會(huì)減少生化妊娠。但因本研究樣本量較小、生化妊娠的影響因素又眾多，后續(xù)還需全面深入地研究加以驗(yàn)證。

成功妊娠需要優(yōu)質(zhì)的胚胎和容受性正常的子宮內(nèi)膜。生化妊娠與優(yōu)胚率、是否移植優(yōu)質(zhì)胚胎的相關(guān)性尚沒有定論[4]。本研究中優(yōu)胚率、是否移植優(yōu)質(zhì)胚胎與生化妊娠沒有明顯相關(guān)性?？赡芘c以下因素有關(guān)：采用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評分胚胎，不能完全反映胚胎染色體是否正常及預(yù)測胚胎發(fā)育潛能，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為優(yōu)質(zhì)胚胎的染色體異常發(fā)生率仍高達(dá)32.8%[16]；即使對胚胎進(jìn)行植入前非整倍體篩查(PGS)，選擇染色體正常的胚胎移植，也不能降低生化妊娠率[17]，提示胚胎染色體異常不是生化妊娠的主要原因。目前我中心尚未進(jìn)行單胚胎移植，故將移植胚胎中至少有1個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎的周期作為參數(shù)之一，開展單胚胎移植后可以直接比較“優(yōu)質(zhì)胚胎”周期和“非優(yōu)質(zhì)胚胎”周期。有研究還發(fā)現(xiàn)HCG日內(nèi)膜厚度<9 mm、P≥9.51 nmol/L者生化妊娠發(fā)生率升高[18]，但也有研究否定這種相關(guān)性[5]。本研究顯示兩者均與生化妊娠無關(guān)，可能因?yàn)榘凑瘴抑行娜∠浦驳臉?biāo)準(zhǔn)，這些患者大部分全胚冷凍，因此減少了可能發(fā)生的生化妊娠。有研究報(bào)道既往合并自然流產(chǎn)史的患者發(fā)生生化妊娠的概率更高[4]，本研究結(jié)果未顯示兩者的相關(guān)性，這可能與排除合并子宮畸形的周期，IVF前進(jìn)行充分檢查和治療，根除了既往導(dǎo)致自然流產(chǎn)的部分因素有關(guān)。另外，IVF中首選優(yōu)質(zhì)胚胎移植，充分的黃體支持和密切隨訪也大大削減了可能導(dǎo)致自然流產(chǎn)的因素。

綜上所述，IVF治療前重視甲狀腺功能檢查及治療，嚴(yán)格掌握ICSI指征，尤其注意高齡患者，盡量改善其卵母細(xì)胞質(zhì)量有助于減少生化妊娠。導(dǎo)致IVF中生化妊娠的原因十分復(fù)雜，每個(gè)生殖中心患者的特點(diǎn)、預(yù)處理措施及促排卵方案、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件均不同，需要結(jié)合自己的實(shí)際情況尋找最可能的原因并給予針對性干預(yù)。

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[編輯：肖曉輝]

AnalysisofinfluencingfactorsofbiochemicalpregnancyafterIVF/ICSI

GONG Yan*，ZHAO Zi-lin，LIU Wei-xin，ZENG Jiu-zhi，YE Fei，LAI Wei

CenterofReproductiveMedicine，SichuanMaternalandChildren'sHospital，Chengdu610045

Objective： To analyze the influencing factors of the biochemical pregnancy after IVF/ICSI-ET.

Methods： The data of 68 biochemical pregnancies and 307 intrauterine pregnancies in IVF/ICSI-ET cycles from January 2014 to December 2016 were retrospectively analyzed.The general conditions and the assisted pregnancy related indexes of the two groups were compared.The influencing factors of biochemical pregnancy were screened by univariate regression logistic analysis.

Results： There was no significant difference in general conditions and the assisted pregnancy related indexes between the two groups (P>0.05).Multivariate logistic regression analysis showed that female age，subclinical hypothyroidism (SCH) and fertilization method were the influencing factors of biochemical pregnancy (P<0.05).The elder women with SCH who did not be treated or were still abnormal after treatment were more prone to biochemical pregnancy after ICSI treatment.

Conclusions： The thyroid function tests should be paid attention to，SCI should be timely corrected before IVF/ICSI-ET，and ICSI indications should be strictly controlled.The elder patients need more attention to improve the quality of oocytes.All the measures will help reduce the incidence of biochemical pregnancy.

IVF-ET； Biochemical pregnancy； Age； Subclinical hypothyroidism； ICSI

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.009

2017-02-14；

2017-04-07

四川省衛(wèi)計(jì)委課題(16PJ386)

龔衍，女，漢族，四川人，碩士，副主任醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*

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