獼猴異體子宮移植技術(shù)的應(yīng)用研究

張曉莉，姚元慶，相磊

(1.武警總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100039；2.解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100853；3.解放軍總醫(yī)院動物實驗中心，北京 100853)

獼猴異體子宮移植技術(shù)的應(yīng)用研究

張曉莉1，姚元慶2*，相磊3

(1.武警總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100039；2.解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100853；3.解放軍總醫(yī)院動物實驗中心，北京 100853)

目的探討獼猴異體子宮移植活體捐贈手術(shù)技巧應(yīng)用，為下一步人體子宮移植臨床試驗提供實驗數(shù)據(jù)。方法選用性成熟、月經(jīng)規(guī)律的雌性獼猴2只，根據(jù)血型和體重選取供體1例和受體1例，將切除的供體子宮及髂血管給予器官保存液冷保存、灌注后原位移植到受體盆腔，供體的髂內(nèi)動脈、髂外靜脈與受體的髂外動、靜脈使用端-側(cè)吻合法間斷吻合，術(shù)中根據(jù)移植血管的搏動、子宮的色澤判斷移植是否成功，術(shù)后給予他克莫司、環(huán)孢霉素、潑尼松三聯(lián)免疫抑制劑預(yù)防移植免疫排斥。結(jié)果受體獼猴移植雙側(cè)髂血管吻合成功，可觸及移植血管搏動，移植子宮恢復(fù)血流灌注后子宮顏色由灰白逐漸轉(zhuǎn)為暗紅。受體動物于子宮移植術(shù)后28 d死亡，評估死亡原因可能為慢性衰竭。結(jié)論獼猴是適用于異體子宮移植研究的大型動物模型，使用髂內(nèi)動脈與受體的髂外動脈進(jìn)行端-側(cè)吻合法吻合是可行的，三聯(lián)免疫抑制劑可有效預(yù)防移植免疫排斥。

子宮移植； 獼猴； 手術(shù)技巧； 應(yīng)用研究

(JReprodMed2017，26(9)：927-931)

子宮移植是至今為止治療完全性子宮因素不孕的唯一手段，子宮因素不孕指的是育齡期女性因為先天性因素或后天因素導(dǎo)致的子宮缺如、子宮無功能。據(jù)統(tǒng)計，約500名育齡期女性就有1例為子宮因素不孕[1]，她們只能通過代孕或收養(yǎng)來傳宗接代，但代孕行為在一些國家是不合法的，包括中國；收養(yǎng)也因為傳統(tǒng)因素制約，在我國不像西方國家那樣普及。因此，子宮移植對子宮因素不孕患者來說是一個重要的選擇[2-5]。子宮移植就是借助輔助生殖技術(shù)(ART)和移植外科技術(shù)為子宮因素不孕女性移植一個具有生育功能的子宮。在過去的十七年，子宮移植經(jīng)歷了從齲齒類動物到大型物種包括非靈長類動物等各個物種的動物實驗研究，人體子宮移植試驗自2000年起也在不斷探索中，直到2014年10月瑞典哥德堡大學(xué)Brannstr?m博士和他的團(tuán)隊[6]宣布了世界首例子宮移植后活產(chǎn)為止，成功將子宮移植技術(shù)從一個技術(shù)概念轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床應(yīng)用[7-8]。目前，全世界已實行了13例子宮移植手術(shù)，但手術(shù)成功率及活產(chǎn)率卻不高，在實施大量人體子宮移植臨床實驗前，使用大型動物試驗以提供移植相關(guān)技術(shù)的指導(dǎo)仍是必要的。非人靈長類動物是研究人類器官移植的重要動物模型，獼猴異體子宮移植活體捐贈用于技術(shù)應(yīng)用研究在國內(nèi)仍屬空白。本研究以獼猴為大動物研究模型，探討異體子宮移植技術(shù)相關(guān)的應(yīng)用研究，為下一步人體子宮移植試驗提供更多的研究數(shù)據(jù)。

材料及方法

一、研究對象

實驗動物為2只雌性獼猴(批號No：2016-D03-10)，1例作為供體，1例作為受體，經(jīng)北京林業(yè)局審批后購于北京協(xié)爾鑫生物資源研究所有限責(zé)任公司，年齡4歲以上，性成熟，經(jīng)觀察兩只雌猴均可以觀察到月經(jīng)期(表1)，術(shù)前保證無妊娠，要求血型交叉配血相符。術(shù)前1周動物進(jìn)入實驗室熟悉周圍環(huán)境，術(shù)前48 h常規(guī)禁食水。

表1 獼猴供-受體的基本情況

二、子宮移植術(shù)的操作方法

1.麻醉方式：供-受體動物依次采用全麻方式進(jìn)行麻醉，速眠新氯胺酮合劑4 mg/kg，誘導(dǎo)麻醉后行氣管插管，靜脈給予3%戊巴比妥鈉5 mg/kg靜推，經(jīng)口置入8.0號氣管導(dǎo)管并連接呼吸機(jī)進(jìn)行正壓通氣。

2.供體手術(shù)：獼猴呈仰臥位，術(shù)前備皮，碘伏消毒腹部皮膚及陰道，鋪單。于下腹部正中縱形切口12 cm，切開皮膚、皮下組織及腹膜，排墊腸管，暴露盆腔，見子宮為單子宮，呈倒置梨形(圖1)。獼猴的髂血管解剖結(jié)構(gòu)與人體主要區(qū)別是缺少髂內(nèi)靜脈，子宮深、淺靜脈均橫跨輸尿管與髂外靜脈匯合，子宮動脈分支來源于髂內(nèi)動脈(圖2[9])。近盆壁處斷扎圓韌帶，下推膀胱與直腸，游離左側(cè)子宮動脈長約4.5 cm，因術(shù)中導(dǎo)致一側(cè)深靜脈損傷，僅分離了左側(cè)深靜脈。電刀環(huán)切宮頸，斷扎輸卵管根部，保留雙側(cè)附件于供體體內(nèi)，夾閉血管前給予全身肝素化(靜脈給予肝素鈉2 ml)預(yù)防靜脈血栓，以子宮動脈與髂內(nèi)動脈前干分支匯合處為中心將髂內(nèi)動脈與周圍組織鈍性分離約5 cm，血管夾夾閉兩端血管，結(jié)扎、斷開髂內(nèi)動脈，完整獲取子宮動脈及部分髂內(nèi)動脈，電凝子宮動靜脈小的分支。整個切除物包括子宮、部分宮頸，雙側(cè)子宮動脈、左側(cè)深靜脈，雙側(cè)部分髂內(nèi)動脈和左側(cè)髂外靜脈。供體術(shù)中出血約400 ml。

U：子宮; C：宮頸; FM：輸卵管傘端圖1 獼猴生殖器官結(jié)構(gòu)與形態(tài)

Bladder：膀胱；Uterus：子宮；SUV：子宮淺表靜脈；UA：子宮動脈；Ureter：輸尿管；DUV：子宮深靜脈；IIA：髂內(nèi)動脈；EIV：髂外靜脈；EIA：髂外動脈圖2 獼猴子宮與周圍血管的關(guān)系[9]

3.離體子宮冷保存、灌注：迅速將移植的子宮及主要血管裹上紗布置4℃ UW器官保存液中冷保存，將26號靜脈套管針管芯(直徑約3 mm)后接20 ml注射器，1∶1生理鹽水稀釋肝素鈉(2 ml)共配成約10 ml肝素鈉混合液灌注髂內(nèi)動脈約15～20 min，灌注、冷保存的同時使用顯微器械修剪髂內(nèi)動脈、髂外靜脈管芯，同時轉(zhuǎn)受體手術(shù)。

4.子宮移植：供體動物麻醉后切開皮膚同前，進(jìn)入盆腔，于輸卵管根部斷扎雙側(cè)輸卵管，完整切除子宮、部分宮頸，宮頸保留盡可能長以便于殘端縫合。將冷保存的子宮放入受體盆腔，暴露髂血管，將雙側(cè)髂外動脈與周圍組織分離約5 cm，血管夾夾閉髂外動脈近心端和遠(yuǎn)心端，使用顯微手術(shù)刀縱形切除髂外動脈血管管壁長約2 mm，8-0可吸收線將移植的髂內(nèi)動脈與受體髂外動脈管壁行端-側(cè)吻合，約3～4針(圖3)，釋放單側(cè)血管夾，如發(fā)現(xiàn)縫合點(diǎn)出血，給予修補(bǔ)。1-0可吸收線間斷縫合陰道殘端，固定各子宮韌帶于盆腔側(cè)壁及盆壁。受體術(shù)中出血約600 ml，手術(shù)過程順利。

圖3 獼猴移植髂內(nèi)動脈與受體髂外動脈端-側(cè)吻合

5.術(shù)中及術(shù)后處理：術(shù)中受體給予潑尼松龍注射液500 mg免疫抑制劑誘導(dǎo)治療，并給予補(bǔ)液、預(yù)防感染治療。免疫抑制劑方案采用他克莫司+環(huán)孢霉素+糖皮質(zhì)激素方案三聯(lián)治療(表2)，術(shù)后按照維持劑量給予免疫抑制劑，并觀察受體動物的一般情況，如動物死亡及時行尸檢并送病理查找死亡原因。

表2 免疫抑制劑治療方案

結(jié) 果

一、一般情況

供-受體術(shù)中及術(shù)后未出現(xiàn)麻醉及手術(shù)并發(fā)癥，受體術(shù)中的基本情況，見表3。供體移植的髂血管與受體的髂血管吻合成功，吻合的動脈可觸及明顯血管搏動，移植子宮恢復(fù)循環(huán)后顏色由灰白逐漸轉(zhuǎn)為暗紅。術(shù)后腹部切口均愈合良好，供體術(shù)后長期存活，受體術(shù)后28 d死亡，立即開腹行尸檢發(fā)現(xiàn)：盆腔輕度粘連，盆腔各組織界限清晰，盆腔未見明顯出血、腹水及膿腫，子宮顏色尚正常，觸之有彈性，未見明顯缺血壞死跡象，取部分子宮肌層組織送病理，未見明顯缺血、血栓、壞死表現(xiàn)(圖4)，根據(jù)尸檢及病理結(jié)果考慮動物死亡原因可能為慢性衰竭。

表3 獼猴子宮移植基本操作情況

圖4 獼猴術(shù)后28 d尸檢子宮肌層組織病理圖片(HE染色，×20，標(biāo)尺：50 μm)

討 論

子宮因素不孕在過去一直沒有有效的治療方式，因為這些患者先天性無子宮或因為早期良惡性腫瘤、產(chǎn)科因素等原因?qū)е伦訉m被迫切除，或子宮畸形導(dǎo)致的子宮無生育功能?，F(xiàn)代嘗試子宮移植的動物實驗研究最早起源于2000年代早期[10-11]，第1例子宮移植后出生的后代是2003年以同基因小鼠作為動物實驗?zāi)Ｐ?，生育的后代有正常的生長軌跡及生育能力[12]，之后在這個物種實驗表明小鼠子宮能夠耐受冷缺血24 h[13]，同種異體子宮移植的排斥診斷主要以子宮形態(tài)、血流信號、白細(xì)胞增生的異常為特征[14-15]。而在大鼠同種異體子宮移植的模型研究中，認(rèn)為他克莫司預(yù)防排斥優(yōu)于環(huán)孢霉素[16-17]，之后豬和羊也被用于子宮移植的動物實驗研究。大型動物與齲齒類動物相比，更適合用于子宮移植模型的主要優(yōu)勢在于器官及子宮血管的尺寸更大，羊使用髂外血管吻合也更適合用來作為自體子宮移植的模型[18-19]，狒狒和恒河猴也作為子宮移植的動物實驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行臨床試驗前研究。在狒狒自體子宮移植實驗中，術(shù)后月經(jīng)恢復(fù)率約20%，修改了灌注方法及手術(shù)吻合后成功率提高了3倍[20]。因此，血管的選擇與吻合技巧、器官灌注、術(shù)后免疫抑制劑的應(yīng)用對子宮移植的成功起到了關(guān)鍵作用。狒狒也可以通過宮頸-陰道部進(jìn)行子宮內(nèi)膜活檢、宮腔鏡監(jiān)測和胚胎移植，因此便于子宮移植后的術(shù)后觀察。雖然狒狒自體移植后月經(jīng)恢復(fù)，但因為嚴(yán)重粘連和術(shù)后輸卵管阻塞而導(dǎo)致妊娠失敗。因為在動物模型中不能有效地監(jiān)測他克莫司的藥物濃度，較易發(fā)生急性移植免疫排斥導(dǎo)致移植失敗，狒狒的異體子宮移植也一直沒能成功。

本研究以獼猴為異體子宮移植動物模型，行雙側(cè)髂內(nèi)動脈及一側(cè)髂外靜脈作為移植血管，獲取的長度要求距離血管蒂長約6 cm，與受體的髂外動脈行端-側(cè)間斷吻合。根據(jù)吻合結(jié)果認(rèn)為，使用髂血管端-側(cè)吻合法吻合移植血管是安全、有效的，相對于端-端吻合法減少了血栓的發(fā)生，血管吻合后根據(jù)動脈的搏動及子宮的色澤變化來判斷移植是否成功。在研究中我們對獼猴進(jìn)行了血型匹配，因為根據(jù)國外的獼猴子宮移植經(jīng)驗[21]，供、受體術(shù)前進(jìn)行血型的匹配是可行的，且沒有發(fā)現(xiàn)明顯的移植排斥，為預(yù)防急性免疫排斥我們在術(shù)前也給予了免疫抑制劑靜脈沖擊治療。術(shù)后的維持治療方案依照動物及人體子宮移植實驗的免疫抑制劑應(yīng)用經(jīng)驗[5，14]，使用他克莫司+環(huán)孢霉素+糖皮質(zhì)激素，均能夠預(yù)防或延緩急慢性免疫排斥的發(fā)生。雖然移植動物僅存活28 d，根據(jù)尸檢及病理結(jié)果分析，死亡原因可能為手術(shù)創(chuàng)傷、進(jìn)食量少、慢性貧血等引起的各臟器慢性衰竭，與移植技術(shù)及術(shù)后排斥無明顯關(guān)系。

本研究為防止子宮內(nèi)感染，我們未進(jìn)行子宮頸和子宮內(nèi)膜活檢，因此對子宮移植排斥的發(fā)生缺少預(yù)測性。下一步我們將增加子宮移植免疫排斥相關(guān)的研究。雖然我們僅進(jìn)行1例異體子宮移植試驗且未觀察到生殖功能恢復(fù)問題，但根據(jù)本研究可以為異體子宮移植手術(shù)技術(shù)的應(yīng)用提供一定參考，為下一步人體子宮移植試驗提供初步的操作技巧及實施方案。

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[編輯：侯麗]

Applicationresearchonthetechnologyofuterusallotransplantationinrhesusmonkey

ZHANG Xiao-li1，YAO Yuan-qing2*，XIANG Lei3

1.DepartmentofGynecologyandObstetics，CAPFGeneralHospital，Beijing100039 2.DepartmentofGynecologyandObstetics，PLAGeneralHospital，Beijing100853 3.TheAnimalExperimentCenterofPLAGeneralHospital，Beijing100853

Objective： To examine application research on the technology of uterus allotransplantation in rhesus monkey，and provide clinic data for the next step human uterus allotransplantation.

Methods： Two female rhesus monkeys with sexual maturity and regular menstrual cycle were used.One donor and one recipient were selected depending on their blood type and body weight.The uterus with vaginal canal and main blood vessels were removed from living donors and stored in cold preservation solution.Then the isolated organ was transplanted to the recipient after perfusion.The internal iliac artery was end-side anastomosed with external iliac arteries from the recipient animals.Whether the transplantation was successful，it was depended on the pulsation of grafts vessels，color and elastic，size，bleeding of the grafts uterus during operation.The recipient was offered tacrolimus，cyclosporine，prednisone triple immunosuppressive agents to prevent transplant immune rejection postoperative.

Results： The transplantation bilateral iliac vascular anastomosis of recipient rhesus monkey was successful.The pulse of transplanted blood vessels can be touched.The transplanted uterus color was changed from grey gradually to red.The recipient animal was died due to chronic failure 28 days after surgery.

Conclusions： Rhesus monkey is suitable for large animal models of allogeneic uterine transplantation.The iliac artery and external iliac artery to end-side anastomosis method is feasible，and the trigeminy immune inhibitors are effective preventing rejection.

Uterus transplantation； Rhesus monkey； Surgical technique； Application research

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.014

2017-04-14；

2017-05-03

張曉莉，女，山東曹縣人，碩士研究生，主治醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*

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