基于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷評價黃芪來源成分的防護作用*

趙志敏黃 愷孫 鑫沈 麗劉成海，，3△

1.上海市中醫(yī)臨床重點實驗室（上海，201203） 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所 3.上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院

·實驗研究·

基于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷評價黃芪來源成分的防護作用*

趙志敏1黃 愷1孫 鑫2沈 麗2劉成海1，2，3△

1.上海市中醫(yī)臨床重點實驗室（上海，201203） 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所 3.上海高校中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院

目的：觀察黃芪來源成分對氯化鈷誘導(dǎo)SK-HEP-1細(xì)胞缺氧損傷的防護作用。方法：800μM氯化鈷作用于SK-HEP-1細(xì)胞24小時，誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧損傷，不同濃度的藥物成分作用于SK-HEP-1細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞活力，免疫熒光染色檢測細(xì)胞vWF表達，高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)觀察細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞核形態(tài)及溶酶體變化，熒光探針法檢測NO、NOS水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組細(xì)胞活力顯著下降，vWF表達明顯增加，細(xì)胞溶酶體平均熒光強度明顯減弱，NO、NOS水平顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）；藥物處理后，細(xì)胞活力明顯改善（P＜0.01），其中黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ組vWF表達顯著下降，溶酶體和NO水平顯著提高（P＜0.05）；毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷組vWF表達、溶酶體顯著改善（P＜0.05）；芒柄花素和芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷組細(xì)胞NO、NOS水平顯著提高，芒柄花素組細(xì)胞溶酶體熒光顯著增強（P＜0.05）。結(jié)論：黃芪來源的7種成分均有防護氯化鈷誘導(dǎo)的SK-HEP-1細(xì)胞缺氧損傷的作用，但其作用基礎(chǔ)存在細(xì)胞生物學(xué)差異。

黃芪來源成分；肝竇內(nèi)皮細(xì)胞；缺氧損傷；防護作用

黃芪味甘、性微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有補氣升陽，益氣固表，托毒生肌，利水退腫的功效。黃芪及其提取物對肝纖維化具有良好的治療作用［1，2］，其作用機制與改善肝臟血管損傷及肝竇毛細(xì)血管化有關(guān)［3］。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSEC）是肝臟微血管的主要組成細(xì)胞之一，對缺血缺氧最為敏感。我們通過采用具有肝竇內(nèi)皮細(xì)胞特征的SK-HEP-1細(xì)胞建立氯化鈷誘導(dǎo)的缺氧損傷模型，進一步研究黃芪來源成分對改善肝竇內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的防護作用，以期發(fā)現(xiàn)其活性成分。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 黃芪來源藥物成分7種（黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷、芒柄花素），購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；六水合氯化鈷（CoCl2·6H2O，Cat＃080M0101V）、噻唑藍購自Sigma公司；MEM干粉（Cat＃41500-067）、胎牛血清（FBS，Cat＃10099）購自GIBCOTM公司；兔vWF多克隆抗體（ab6994）購自Abcam公司；細(xì)胞毒性2試劑盒（Cat＃8400101），購自ThermoFisher；DAF-FM DA［一氧化氮（NO）熒光探針，Cat＃S0019］、DAPI細(xì)胞核染色液、抗兔FITC熒光二抗（P0186）購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 SK-HEP-1細(xì)胞培養(yǎng)及化學(xué)缺氧損傷模型制備 SKHEP-1人內(nèi)皮細(xì)胞購自ATCC，為人內(nèi)皮來源的腹水瘤細(xì)胞，具備肝竇內(nèi)皮的窗孔和內(nèi)吞特性［4］，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液。以每孔8000個細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞密度為70%左右，每孔加入100μl終濃度800μM的CoCl2·6H2O培養(yǎng)液，孵育24h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。

1.2.2 SK-HEP-1細(xì)胞分組與處理 每個藥物單體成分均在160μM范圍內(nèi)設(shè)6個濃度梯度確定對SK-HEP-1細(xì)胞的最大無毒范圍（與不加藥組細(xì)胞比存活率＞90%），根據(jù)最大無毒濃度再分設(shè)3個濃度梯度分別作用于細(xì)胞模型。各藥物與細(xì)胞共孵育24h同時添加800μM CoCl2·6H2O。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞活力 細(xì)胞接種于96孔板，長至亞單層，棄原培養(yǎng)液，換為各藥物成分培養(yǎng)液，100μl/孔，每組4－6個復(fù)孔，孵育24h。棄藥物培養(yǎng)液，加入0.5mg/ml MTT工作液，孵育4h?？梢娝{紫色結(jié)晶，小心吸棄工作液，加入DMSO 100μl/孔，至充分溶解，在微孔板掃描分光光度計上測定吸光度OD490。

1.2.4 免疫熒光法檢測細(xì)胞活力 4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15min，PBS洗滌，0.5%Triton X-100孵育10min，5%BSA/PBS 37℃封閉30mim，vWF一抗（1∶200）37℃孵育1h，PBS洗滌，熒光二抗（1∶100）37℃孵育1h，PBS洗后滴加DAPI染核5mim，PBS洗滌，Cellomics ArrayScan VTIHCSReader采集圖像，Cellomics Cell Health Profiling BioApplication Software對圖像進行分析。

1.2.5 細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞膜通透性及溶酶體數(shù)量高內(nèi)涵檢測

親核綠色熒光染料標(biāo)記細(xì)胞膜，紅色熒光染料標(biāo)記溶酶體，4%甲醛室溫固定15 min，PBS洗滌兩次，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，PBS洗滌兩次，圖像采集和分析同1.2.4。

1.2.6 熒光探針法檢測一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）水平 藥物孵育后棄原培養(yǎng)液，原位裝載NO或NOS探針，100μl/孔。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20～40min。PBS洗3次。Thermo scientific varioskan flash光譜掃描多功能讀數(shù)儀上檢測，使用495nm激發(fā)波長，515nm發(fā)射波長。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 12.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用±s表示。組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 各藥物成分對SK-HEP-1細(xì)胞氯化鈷損傷模型細(xì)胞活力的影響

藥物作用24小時各化合物對SK-HEP-1細(xì)胞最大無毒濃度分別為：黃芪甲苷20μM、黃芪皂苷Ⅰ10μM、黃芪皂苷Ⅱ5μM、毛蕊異黃酮20μM、毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷5μM、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷10μM、芒柄花素5μM。造模后，模型組細(xì)胞活力較正常組顯著下降（P＜0.01）；黃芪甲苷（5μM）、黃芪皂苷Ⅰ（2.5μM、5μM、10μM）、黃芪皂苷Ⅱ（1.25μM、2.5μM）、毛蕊異黃酮（5μM）、毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷（1.25μM、5μM）、芒柄花素（1.25μM）、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷（2.5μM）組SK-HEP-1細(xì)胞活力明顯提高（P＜0.01），見圖1。

圖1 各藥物成分對SK-HEP-1細(xì)胞氯化鈷損傷模型細(xì)胞活力的影響比較

2.2 各藥物成分對SK-HEP-1細(xì)胞氯化鈷損傷模型細(xì)胞vWF表達的影響

vWF免疫熒光染色顯示，模型組細(xì)胞熒光強度較正常組顯著升高（P＜0.05）；黃芪甲苷（10μM、20μM）、黃芪皂苷Ⅱ（2.5μM）、毛蕊異黃酮（5μM）、毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷（2.5μM、5μM）組vWF熒光強度有不同程度的降低（P＜0.05），差異具有顯著性意義，見插頁圖2。

圖2 各成分對SK-HEP-1細(xì)胞氯化鉆損傷模型細(xì)胞vWF表達的影響圖

2.3 各藥物成分對SK-HEP-1細(xì)胞氯化鈷損傷模型細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞膜通透性及溶酶體的影響

高內(nèi)涵檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞核面積增大、平均熒光強度降低，細(xì)胞膜通透性增高，溶酶體平均熒光強度減弱（P＜0.05）；與模型組比較，各成分對細(xì)胞核形態(tài)及細(xì)胞膜通透性無明顯影響（P＞0.05）；黃芪甲苷（5μM）、黃芪皂苷Ⅱ（5μM）、毛蕊異黃酮（5μM、10μM、20μM）、毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷（2.5μM、5μM）、芒柄花素（5μM）組細(xì)胞溶酶體平均熒光強度顯著增強（P＜0.05），見插頁圖3。

圖3 各成分對SK-HEP-1細(xì)胞氯化鉆損傷模型細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞膜通透性及溶酶體數(shù)量的影響圖

2.4 各藥物成分對SK-HEP-1細(xì)胞氯化鈷損傷模型細(xì)胞NO、NOS的影響

NO、NOS熒光探針檢測結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞NO、NOS表達較正常組明顯降低（P＜0.01）；黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ、芒柄花素、芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷能夠顯著增加氯化鈷損傷模型SK-HEP-1細(xì)胞NO、NOS的表達，差異具有顯著性意義（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。

圖4 各藥物成分對SK-HEP-1細(xì)胞氯化鈷損傷模型細(xì)胞NO、NOS的影響比較

3 討論

肝臟受損和炎癥時常伴有缺氧現(xiàn)象，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞是缺氧的感受器，其改變往往早于大部分慢性肝病的發(fā)展，任其進一步發(fā)展將加重肝臟疾病如纖維化并形成難以逆轉(zhuǎn)的血管病理。缺氧損傷條件下，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞會發(fā)生表型變化，窗孔破壞、減少或消失，vWF表達增高；活性氧生成提高，細(xì)胞膜通透性增強，細(xì)胞核大小和形態(tài)發(fā)生改變，溶酶體膜的完整性受損，溶酶體內(nèi)容物的釋放甚至大于溶酶體的崩解引起細(xì)胞凋亡或壞死［5］。LSEC具有合成和分泌NO的功能，可通過NO-環(huán)磷鳥苷通路維持LSEC窗孔和表型，抑制星狀細(xì)胞活化，從而調(diào)節(jié)肝竇和血管的舒張。實驗證實肝硬化時LSEC功能紊亂，NO水平下降［6］。氯化鈷化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧損傷是體外研究常用的技術(shù)方法，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞、癌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞缺氧研究［7］。我們前期采用氯化鈷誘導(dǎo)SK-HEP-1構(gòu)建缺氧損傷模型，篩選并發(fā)現(xiàn)了部分抗肝竇內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的中藥活性成分［8］。在本實驗中，SK-HEP-1細(xì)胞經(jīng)氯化鈷缺氧損傷處理后，表型標(biāo)志物vWF表達增多，細(xì)胞膜通透性增強，溶酶體平均熒光強度顯著下降，細(xì)胞核形態(tài)及大小出現(xiàn)改變，細(xì)胞活力顯著下降。

黃芪是臨床有效治療肝纖維化的中藥復(fù)方如當(dāng)歸補血湯、黃芪湯、復(fù)方861等方劑中的主要組成藥味，其抗肝纖維化作用機制主要在于抗脂質(zhì)過氧化、抑制星狀細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶表達、抑制膠原合成和沉積等。黃芪及其提取物如黃芪總皂苷、黃芪總黃酮等多見于心腦血管疾病的研究，其有效成分可通過抑制細(xì)胞內(nèi)皮素分泌、增加NO釋放、維護細(xì)胞連接的完整性、抑制凋亡和促進增殖和遷移等保護內(nèi)皮細(xì)胞功能［9］。對于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞這一特殊血管內(nèi)皮的研究較少，李娟梅等發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可通過影響肝竇內(nèi)皮細(xì)胞微區(qū)力學(xué)、增加NO合成從而改善肝臟微循環(huán)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪來源的7種單體成分對缺氧損傷的SK-HEP-1細(xì)胞活力有明顯改善作用，其中皂苷類的黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ?qū)σ种苬WF表達、保護細(xì)胞溶酶體、改善細(xì)胞NO合成功能有明顯作用；黃酮類的毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮-7-O-b-D-葡萄糖苷對vWF表達、細(xì)胞溶酶體有效，但對NO無明顯影響；而同是黃酮類的芒柄花素和芒柄花素-7-O-b-D-葡萄糖苷對NO合成有明顯改善作用，芒柄花素還可保護細(xì)胞溶酶體，但兩者對細(xì)胞vWF表達無明顯影響。綜上所述，實驗初步發(fā)現(xiàn)7種成分均有防護氯化鈷誘導(dǎo)的SK-HEP-1細(xì)胞缺氧損傷的作用，但存在作用差異，對其機制的深入研究將對慢性肝病的治療具有特殊意義。

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Evaluation the protective effects of the com pounds from astragalus based on liver sinusoid endothelial cell injury

ZHAO Zhi-Min1，HUANGKai1，SUN Xin2，LIUCheng-Hai1，2，3△，etal.1.Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine（Shanghai，201203）China

Objective：To observe the effects of the components from Astragalus on protecting SK-HEP-1 cells from hypoxia injury induced by cobaltous chloride（CoCl2）.M ethods：SK-HEP-1 cell hypoxia injury was induced by 800μM CoCl2 for24 hours，and the cellswere treated with different concentrations of components.Cell viability wasmeasured by MTT assay，vWF was detected by immunofluorescence staining，themembrane permeability，nuclearmorphology and lysosomal changeswere observed by high content screen（HCS）system，NO and NOSwere detected by fluorescence probemethod.Results：Compared with the control group，800μM CoCl2 decreased cell viability extremely，the expression of vWF increased significantly，themean fluorescence intensity of lysosomes，NO and NOSdecreased significantly（P＜0.05 orP＜0.01）.After treatment，cell viability was significantly improved in different groups（P＜0.01）.The expression of vWF was decreased while lysosomes and NO levels increased significantly in AstragalosideⅣand AstragalosideⅡgroups（P＜0.05）；in Calycosin and Genistein-7-O-b-D-glucoside groups，the expression of vWF was decreased but lysosome was improved significantly（P＜0.05）；NO and NOS levels in Formononetin and Ononin groups increased significantly，lysosomes in formononetin group were also significantly enhanced（P＜0.05）.Conclusion：The 7 compounds from astragalus have protective effects on SK-HEP-1 cells hypoxia injury induced by CoCl2，but there are some differences in cell biology.

sinusoidal endothelial cells；hypoxia injury；activity evaluation

2017－04－17 編輯：黃育華）

10.3969/j.issn.1005－0264.2017.03.011

國家自然科學(xué)基金（No.81473404）；中國博士后基金；△通訊作者：E-mail：chenghailiu＠hotmail.com