豬血漿蛋白水解物對(duì)水包油型乳狀液氧化穩(wěn)定性的影響

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(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

豬血漿蛋白水解物對(duì)水包油型乳狀液氧化穩(wěn)定性的影響

李月,劉騫,陳益春,孔保華,夏秀芳*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

本實(shí)驗(yàn)主要研究了豬血漿蛋白水解物(Porcine plasma protein hydrolysate,PPPH)對(duì)水包油型(O/W型)乳狀液儲(chǔ)藏過(guò)程氧化穩(wěn)定性的影響。分別將PPPH以0、2.5、5、10和20 mg/mL的濃度添加到以Tween-20為乳化劑的菜籽油O/W型乳狀液中,測(cè)定乳狀液在37 ℃條件下儲(chǔ)藏10 d時(shí)間內(nèi)的熒光光譜分析、共軛二烯(Conjugated diene,CD)和硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)的變化趨勢(shì)。研究結(jié)果表明,色氨酸的氧化降解發(fā)生在蛋白氧化的初級(jí)階段,而熒光蛋白氧化產(chǎn)物(Fluorescent protein oxidation products,FP)的形成是蛋白氧化第二階段的產(chǎn)物。另外,在乳化體系儲(chǔ)藏期間,與對(duì)照組相比,添加2.5 mg/mL PPPH的處理組具有最高的色氨酸熒光強(qiáng)度和FP(p<0.05),同時(shí)具有最低的CD和TBARS值(p<0.05)。與此同時(shí),色氨酸熒光強(qiáng)度與CD含量和TBARS值之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系?？傊?PPPH的添加能夠顯著提高O/W型乳狀液的氧化穩(wěn)定性,為其作為抗氧化劑在乳狀液食品中的潛在應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

豬血漿蛋白水解物,乳狀液,色氨酸熒光光譜,氧化穩(wěn)定性,脂質(zhì)氧化

在食品加工貯藏過(guò)程中,氧化會(huì)產(chǎn)生多種自由基,引起食品發(fā)生氧化酸敗,產(chǎn)生難聞的氣味,降低產(chǎn)品質(zhì)量,減少食品貯藏期。為防止食品變質(zhì)帶來(lái)的危害,抑制食品的氧化就尤為重要,而防止氧化最直接有效的方法就是添加抗氧化劑[1]?，F(xiàn)已有研究者將抗氧化劑添加到乳狀液中以抑制氧化,提高乳狀液的穩(wěn)定性[2-5]。作為傳統(tǒng)抗氧化劑的潛在替代品,天然來(lái)源的抗氧化劑更符合現(xiàn)代人對(duì)食品安全營(yíng)養(yǎng)的需求,因此開(kāi)發(fā)天然來(lái)源的抗氧化劑引起了食品制造商的廣泛關(guān)注[6-7]。乳狀液在油滴粒徑減小的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生較大的界面面積因而易于被氧化,而動(dòng)植物蛋白經(jīng)適度水解所產(chǎn)生的由多肽組成的蛋白水解物可以在油滴表面形成物理屏障以阻礙氧化劑的滲入和擴(kuò)散[2,8],并且能夠迅速分散在油水界面上的同時(shí)形成較大的界面層,從而起到抑制脂質(zhì)氧化的作用[9]。

由于O/W型乳狀液容易發(fā)生分層、絮凝、聚集等不穩(wěn)定現(xiàn)象,可以通過(guò)添加表面活性劑來(lái)降低乳化體系的液面張力、增加油滴之間的排斥力以防止聚集現(xiàn)象的再次發(fā)生[10-11]。此外,研究還發(fā)現(xiàn)一些食品級(jí)表面活性劑(比如吐溫、斯潘、單甘酯等)能夠與蛋白水解物協(xié)同作用在油滴表面,從而改善由蛋白水解物制備的乳化體系的穩(wěn)定性[12]。雖然已經(jīng)有大量的研究證明豬血漿蛋白水解物具有良好的抗氧化活性,但其在植物油預(yù)乳化體系中抑制脂質(zhì)和蛋白氧化的抑制機(jī)制研究相對(duì)較少。因此,本研究以Tween-20為乳化劑的菜籽油水包油型(O/W型)乳狀液為基礎(chǔ),通過(guò)添加不同濃度的豬血漿蛋白水解物,以熒光光譜掃描結(jié)合傳統(tǒng)理化指標(biāo),分析探討乳狀液在貯藏期間氧化穩(wěn)定性的變化,為蛋白水解物在復(fù)雜食品體系中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

豬血漿蛋白粉 黑龍江北大荒肉類有限公司;堿性蛋白酶(酶活為2.4 AU/g) 丹麥Novozymes公司;菜籽油 哈爾濱九三油脂;十二烷基磺酸鈉(SDS) Sigma公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津市巴斯夫化工有限公司;硫代巴比妥酸、三氯乙酸、鹽酸、異辛烷、異丙醇等 哈爾濱市萬(wàn)太生物藥品公司。

JD500-2電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司;AL-104型精密電子天平、FE20K型pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司;DK-8B電熱恒溫水浴鍋 上海驚宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;JB-2恒溫磁力攪拌器 上海雷磁新徑儀器有限公司;GL-21M冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;TU-1800紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;T18勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司;SPCH-10高壓均質(zhì)機(jī) 安盛聯(lián)合科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬血漿蛋白水解物(PPPH)的制備 根據(jù)Liu等人[13]的方法將加熱處理(95 ℃,5 min)的豬血漿蛋白水溶液(4% w/w,pH8.0)用堿性蛋白酶在55 ℃下水解1 h,酶與底物濃度之比為2∶100 (w/w),反應(yīng)過(guò)程中不斷加入1 mol/L的NaOH,使pH保持8.0不變。水解結(jié)束后95 ℃水浴5 min進(jìn)行滅酶,然后用1 mol/L HCl 將水解液pH調(diào)至7.0。水解物以9000×g離心10 min除去不溶顆粒。

1.2.2 乳狀液的制備 將10 wt%的菜籽油和90 wt%的水相溶液用高速均質(zhì)機(jī)在13500 r/min下乳化2 min后,35 MPa下經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)兩次。加入疊代鈉(0.03%,w/v)進(jìn)行抑菌。其中,水相為Tween-20溶于不同濃度的PPPH(0、2.5、5、10、20 mg/mL)溶液,使Tween-20的最終濃度為10 mg/mL。

1.2.3 熒光光譜掃描 通過(guò)使用熒光光譜法測(cè)定乳狀液中天然色氨酸熒光損失和蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物的熒光排放來(lái)評(píng)價(jià)豬血漿蛋白的氧化。

參照Estévez等人[14]的方法用磷酸鹽緩沖溶液(5 mL)稀釋乳狀液(檢測(cè)色氨酸熒光時(shí),向磷酸鹽緩沖溶液中加入100 μL的乳狀液;檢測(cè)FP時(shí),向磷酸鹽緩沖溶液中加入250 μL的乳狀液),混勻后分散在4 mL石英熒光比色皿中。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為283 nm時(shí),在320～400 nm之間記錄色氨酸發(fā)射光譜;當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm時(shí),在400～450 nm之間FP發(fā)射光譜。在這兩種測(cè)量中,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度設(shè)置是10 nm,以240 nm/min的速度收集數(shù)據(jù)。

1.2.4 共軛二烯烴的測(cè)定 按照Viljanen等人[11]的方法進(jìn)行分離分析。100 μL乳液與1.5 mL異辛烷-2-丙醇(3∶1,v/v)混合,渦流10 s,進(jìn)行三次。在548×g下離心5 min得到0.2 mL有機(jī)溶劑相,用5 mL異辛烷稀釋混勻,在234 nm下測(cè)量吸光度,使用25200 M-1·cm-1作為摩爾消化系數(shù)來(lái)計(jì)算CD。

1.2.5 硫代巴比妥酸值的測(cè)定 參考Mei等人[15]的方法并稍作修改。硫代巴比妥酸溶液的配制:將0.375 g硫代巴比妥酸、15 g的三氯乙酸、12 mol/L的鹽酸1.76 mL和82.9 mL水混合,并與2%的BHA溶液3 mL混勻。取上述溶液4 mL,樣品1 mL以及水1 mL混勻,在沸水浴中加熱15 min,冷卻到室溫,過(guò)0.45 μm濾膜,得到的濾液在532 nm處測(cè)其吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷做標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.8133x-0.051;其中:y為吸光度，x為硫代巴比妥酸值),確定樣品中的TBARS值。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1(分析軟件,St Paul,MN)軟件包中Linear Models程序進(jìn)行,差異顯著性(p<0.05)分析使用Tukey HSD程序,采用Sigmaplot 11.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1乳狀液貯藏期間熒光光譜的變化

由于乳狀液中同時(shí)含有小分子肽和油脂,所以油脂的氧化也會(huì)引起小分子肽的氧化[16]。因此,本研究用色氨酸熒光光譜掃描的方法來(lái)測(cè)定乳狀液在0～10 d儲(chǔ)藏期內(nèi)的蛋白氧化。Nooshkam等人[17]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),色氨酸能夠在與氧分子發(fā)生色氨酸過(guò)氧化基反應(yīng)后生成氫過(guò)氧化物,從而能夠通過(guò)色氨酸熒光的損失來(lái)判斷脂質(zhì)體或者乳狀液中蛋白氧化的程度。由圖1可以看出,在乳狀液儲(chǔ)藏期間,PPPH的含量從2.5 mg/mL增加到20 mg/mL時(shí),乳狀液的熒光強(qiáng)度顯著降低(p<0.05),添加2.5 mg/mL PPPH的乳狀液具有最高的色氨酸熒光強(qiáng)度,而含有10、20 mg/mL PPPH的乳狀液的色氨酸熒光損失較為嚴(yán)重。而隨著時(shí)間的推移,色氨酸熒光強(qiáng)度逐漸降低(p<0.05)。在乳狀液存儲(chǔ)過(guò)程中,氨基酸氧化降解會(huì)導(dǎo)致色氨酸熒光損失,因此乳狀液熒光強(qiáng)度較低時(shí)蛋白氧化程度較高。圖2為含2.5 mg/mL豬血漿蛋白水解物的O/W型乳狀液貯藏過(guò)程中的色氨酸熒光光譜。在乳化體系儲(chǔ)藏期間,波長(zhǎng)大約在340～360 nm時(shí),色氨酸的最大峰值發(fā)生改變,在第10 d時(shí)乳狀液的熒光強(qiáng)度最低。本研究中各處理組之間差異性顯著(p<0.05),具有較低濃度PPPH的乳狀液因較高水平的色氨酸殘基表現(xiàn)出較高的熒光排放物。

圖1 含有不同豬血漿蛋白水解物濃度的O/W型乳狀液貯藏過(guò)程中色氨酸熒光強(qiáng)度的損失Fig.1 Decrease of tryptophan fluorescence during oxidation of emulsions containing different levels of PPPH注：不同小寫字母表示同一貯藏時(shí)間不同處理組間差異顯著(p<0.05)；圖3同。

圖2 含2.5 mg/mL豬血漿蛋白水解物的O/W型乳狀液貯藏過(guò)程中的色氨酸熒光光譜Fig.2 Spectrum corresponding to tryptophan fluorescence in emulsions containing 2.5 mg/mL PPPH during prooxidant storage注:激發(fā)波長(zhǎng)=283 nm。

色氨酸的氧化分解發(fā)生在氧化過(guò)程的早期,而FP是由蛋白質(zhì)氧化的次級(jí)過(guò)程產(chǎn)生。對(duì)含不同濃度PPPH乳狀液的熒光蛋白氧化產(chǎn)物之間的顯著差異進(jìn)行檢測(cè)。由圖3可知,在整個(gè)測(cè)定過(guò)程中,2.5 mg/mL的PPPH的乳狀液表現(xiàn)出較高的熒光性,約是含20 mg/mL PPPH的乳狀液的兩倍。然而,不同濃度的PPPH所制備的乳狀液的熒光強(qiáng)度之間存在著差異,是由于FP來(lái)自于蛋白質(zhì)的氧化,具有較低PPPH含量的乳狀液將有較高含量的氧化產(chǎn)物。FP發(fā)射的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加,在第10 d檢測(cè)到最高水平的熒光強(qiáng)度。由圖4可知,與色氨酸熒光相比,熒光蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物的最高峰發(fā)射波長(zhǎng)在415～425 nm時(shí)發(fā)生改變,蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生的化合物的熒光吸收峰通常是在大約420 nm左右。色氨酸熒光損失的同時(shí),隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),FP的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),這是因?yàn)檠趸腜PPH和次級(jí)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物之間相互作用的結(jié)果。PPPH可能在防止脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化中發(fā)揮了保護(hù)作用。

圖3 含有不同豬血漿蛋白水解物濃度的O/W型乳狀液貯藏過(guò)程中蛋白氧化產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的增加Fig.3 Increase of FP fluorescence during oxidation of emulsions containing different levels of PPPH

圖4 含2.5 mg/mL豬血漿蛋白水解物的O/W型乳狀液促氧化貯藏過(guò)程中的蛋白氧化產(chǎn)物熒光光譜Fig.4 Spectrum corresponding to FP fluorescence in emulsions containing 2.5 mg/mL PPPH during prooxidant storage注:激發(fā)波長(zhǎng)=350 nm。

2.2乳狀液貯藏期間CD和TBARS的變化

由于肽能夠清除自由基并對(duì)促氧化的金屬具有螯合能力,因此蛋白或者肽水解物的主要好處是可以抑制脂質(zhì)體的氧化[18]。表1和表2分別為PPPH制備的O/W乳狀液貯藏過(guò)程中氧化產(chǎn)物共軛二烯反應(yīng)物(CD)和硫代巴比妥酸值(TBARS)的變化趨勢(shì),這兩種指標(biāo)可以較為可靠地反映油脂氧化的程度。一些研究表明,一定濃度的蛋白水解物的存在可以提高乳狀液的抗氧化活性[19-21]。在本研究中,以PPPH和Tween 20為乳化劑時(shí),37 ℃避光貯藏10 d后,含PPPH的乳狀液的CD和TBARS值都低于未加蛋白水解物的乳狀液,所有實(shí)驗(yàn)濃度都起到了降低CD和TBARS氧化產(chǎn)物的作用。因此,結(jié)果表明添加PPPH能夠明顯抑制O/W乳狀液初級(jí)和次級(jí)氧化產(chǎn)物的形成。隨著貯藏期的延長(zhǎng),CD的生成量呈現(xiàn)著逐漸增加的趨勢(shì)。而一旦脂質(zhì)過(guò)氧化物形成后,PPPH可以通過(guò)穩(wěn)定自由基、隔離Fe2+的氧化、促進(jìn)氧化金屬分解,作為金屬螯合劑打斷過(guò)氧化二級(jí)產(chǎn)物的分解,從而抑制TBARS的形成。

表1 含有不同豬血漿蛋白水解物濃度的O/W乳狀液貯藏過(guò)程中氧化產(chǎn)物共軛二烯反應(yīng)物(CD)含量的變化Table 1 Formation of CD during storage of rapeseed O/W emulsions prepared with PPPH at various concentrations

注:數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。A～D在同一列字母中,a～d在同一行字母中相同表示差異不顯著,不同則表示差異顯著(p<0.05);表2同。

表2 含有不同豬血漿蛋白水解物濃度的O/W乳狀液貯藏過(guò)程中氧化產(chǎn)物硫代巴比妥酸值(TBARS)的變化Table 2 Formation of TBARS during storage of rapeseed O/W emulsions prepared with PPPH at various concentrations

表3 含有不同豬血漿蛋白水解物濃度的O/W乳狀液貯藏過(guò)程中色氨酸熒光強(qiáng)度與CD含量和TBARS值的相關(guān)性Table 3 Correlation of CD or TBARS with fluorescence intensity of rapeseed O/W emulsions prepared with PPPH at different concentrations

而PPPH的抗氧化性能主要?dú)w因于各種性能的協(xié)同效應(yīng),包括芳香氨基酸和含硫氨基酸清除自由基能力還可作為金屬離子螯合劑的抑制脂質(zhì)體的氧化[22-23]。另外,PPPH還可能在脂質(zhì)體表面形成一層物理屏障來(lái)阻止氧化的滲透和擴(kuò)散,類似于一些蛋白質(zhì)在乳狀液中的作用[8]。本研究中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的變化與其他研究人員研究的水包油乳狀液氧化的模式相似[24-26]。在氧化初期,脂肪酸氧化分解產(chǎn)生氫過(guò)氧化物,CD與TBARS的含量在儲(chǔ)藏期間逐漸增加,在第10 d時(shí)達(dá)到最大值。本研究中含量為2.5 mg/mL的PPPH抑制脂質(zhì)氧化作用效果最好,具有最低的CD和TBARS值。這可能是由于高濃度PPPH和Tween-20之間在界面上存在著競(jìng)爭(zhēng)吸附[27],并且PPPH在界面上的累積會(huì)引起了不同油滴表面多肽的橋聯(lián)作用,從而促進(jìn)了液滴間的聚集及脂自由基的鏈增長(zhǎng)[28]。

2.3熒光強(qiáng)度與CD和TBARS的相關(guān)性分析

表3描述含有不同豬血漿蛋白水解物濃度的O/W乳狀液貯藏過(guò)程中色氨酸熒光強(qiáng)度與CD含量和TBARS值的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)色氨酸的熒光強(qiáng)度與CD含量和TBARS值存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。在O/W乳狀液中,氨基酸殘基位于油滴的表面,例如色氨酸,它能夠顯著影響脂質(zhì)氧化。事實(shí)上,色氨酸的氧化降解是發(fā)生在氧化的前期,當(dāng)脂質(zhì)氧化進(jìn)入增值階段時(shí)變得更加明顯。此外,蛋白質(zhì)中游離的氨基酸能夠與次級(jí)氧化產(chǎn)物反應(yīng)致使熒光蛋白氧化產(chǎn)物形成[29-30]。本研究中使用熒光分光光度計(jì)對(duì)這些脂蛋白復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)天然的色氨酸熒光強(qiáng)度與CD及TBARS呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,能夠更好地反映出初級(jí)氧化產(chǎn)物與色氨酸殘基之間存在相互作用。這一相關(guān)性更好地反映出使用熒光光譜法評(píng)價(jià)豬血漿蛋白水解物對(duì)水包油型乳狀液氧化穩(wěn)定性的方便性和準(zhǔn)確性,避免了傳統(tǒng)測(cè)定方法中產(chǎn)生的可能誤差。

3 結(jié)論

將不同濃度(0～20 mg/mL)的PPPH添加到由Tween-20和菜籽油制備的O/W型乳狀液中,在37 ℃儲(chǔ)存0～10 d的條件下,PPPH的添加能夠顯著提高整個(gè)乳狀液的氧化穩(wěn)定性。另外,整個(gè)乳狀液在儲(chǔ)存期間的色氨酸熒光強(qiáng)度與CD、TBARS值之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此,PPPH可以作為一種功能性成分添加到食品乳狀液中來(lái)提高整體乳狀液的氧化穩(wěn)定性。研究結(jié)果將有助于蛋白水解物在復(fù)雜乳狀液類食品中的實(shí)際應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ),而且能夠提高多不飽和脂肪酸在乳狀液類食品中的應(yīng)用。

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Effectsofporcineplasmaproteinhydrolysatesonoxidationstabilityofoil-in-wateremulsions

LIYue,LIUQian,CHENYi-chun,KONGBao-hua,XIAXiu-fang*

(College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Potential effects of porcine plasma protein hydrolysates(PPPH)on oxidative stability of oil-in-water type(O/W)emulsions were investigated during the storage. Different concentration of PPPH(0～20 mg/mL)were added to rapeseed O/W emulsions which used Tween-20 as the emulsifier. The changes of tryptophan fluorescence spectroscopy,conjugated diene(CD)and thiobarbituric acid-reactive substances(TBARS)values of the emulsions were determined during 0～10 days which storage at 37 ℃. The results showed that the oxidative degradation of tryptophan residues occurred as an early event in protein oxidation whereas fluorescent protein oxidation product(FP)formed later as secondary protein oxidation products. In addition,compared with the control group,the treatment group with the addition of 2.5 mg/mL PPPH had the highest tryptophan fluorescence intensity and FP(p<0.05),while having the lowest CD and TBARS values(p<0.05). At the same time,the significant negative correlations were found between tryptophan fluorescence and CD. In conclusion,PPPH could significant increase the stability of oil-in- water type emulsions,the antioxidant properties of PPPH at the interface of emulsion droplets would render them suitable as natural antioxidants in some food products.

procine plasma protein hydrolysates;emulsion;tryptophan fluorescence spectroscopy;oxidative stability;lipid oxidation

2017-02-07

李月(1993-)，女，碩士研究生，研究方向:畜產(chǎn)品加工,E-mail: li_yue@yeah.net。

*通訊作者:夏秀芳(1973-)，女，博士，教授，研究方向:畜產(chǎn)品加工,E-mail:xxfang524@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31671788)；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“學(xué)術(shù)骨干”項(xiàng)目(16XG18)。

TS251.9

:A

:1002-0306(2017)16-0024-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.006