利用孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法測(cè)定水樣中微量磷酸鹽

朱靖蓉,溫云杰,宋書會(huì) ,馬 磊,張金堯 ,汪 洪

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,烏魯木齊 新疆830091;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/耕地培育技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部植物營(yíng)養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100081)

利用孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法測(cè)定水樣中微量磷酸鹽

朱靖蓉1,溫云杰2,宋書會(huì)2,馬 磊1,張金堯2,汪 洪1

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,烏魯木齊 新疆830091;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/耕地培育技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部植物營(yíng)養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100081)

【目的】磷鉬藍(lán)分光光度法是水中磷酸鹽含量的常用檢測(cè)方法，但不適用于磷酸鹽含量低(<0.04 mg/L)的水樣。建立一種更準(zhǔn)確的水中微量磷酸鹽檢測(cè)方法?！痉椒ā繉?duì)孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法中最大吸收波長(zhǎng)、顯色劑中孔雀綠和濃硫酸的比例與用量、表面活性劑聚乙烯醇(PVA)用量、顯色穩(wěn)定時(shí)間等指標(biāo)依次優(yōu)化，選擇1個(gè)湖水樣品和系列低濃度磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，用優(yōu)化后的測(cè)定方法進(jìn)行方法回收率、精密度和檢出限研究?！窘Y(jié)果】?jī)?yōu)化后的關(guān)鍵點(diǎn)是最大吸收波長(zhǎng)620 nm，顯色劑配制比例鉬酸銨溶液(176.5 g/L)/孔雀綠溶液(11.2 g/L)/濃硫酸=40/32/34(體積比)，顯色體積中顯色劑比例占8%，顯色穩(wěn)定時(shí)間30 min，方法檢出限為1.2 g/L，磷(P)濃度小于10.00μg/L時(shí)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 8.3%～9.1%，P濃度大于10.00μg/L時(shí)RSD小于5%，加標(biāo)回收率在97.0 %～108.2 %。【結(jié)論】?jī)?yōu)化后的孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法檢測(cè)限低，靈敏度高，線性范圍寬，顯色溶液穩(wěn)定，準(zhǔn)確度、精密度符合水質(zhì)測(cè)定需求，操作簡(jiǎn)便，適合環(huán)境中水體微量磷酸鹽含量的檢測(cè)。

孔雀綠；分光光度法； 磷酸鹽； 水

0 引 言

【研究意義】人類活動(dòng)和自然因素導(dǎo)致磷素進(jìn)入湖泊、水庫(kù)造成水體富營(yíng)養(yǎng)化已經(jīng)是一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題[1-3]。磷酸鹽被認(rèn)為是水生植物過(guò)量生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素之一，水中磷酸鹽的含量是評(píng)價(jià)水質(zhì)的重要指標(biāo)[4]。磷鉬藍(lán)分光光度法是目前水樣中磷酸鹽含量測(cè)定的常用方法，但該法絡(luò)合物穩(wěn)定時(shí)間短，檢測(cè)限高，靈敏度低，不適于水樣中微量磷的測(cè)定?！兜乇硭h(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838-2002)規(guī)定我國(guó)III類水的水體中總P濃度臨界指標(biāo)是0.2 mg/L，湖泊和水庫(kù)中總P濃度臨界指標(biāo)是0.05 mg/L。因此研究水中微量磷酸鹽含量(低于0.04 mg/L)的檢測(cè)方法，是評(píng)價(jià)水質(zhì)、對(duì)水體污染進(jìn)行早期預(yù)警的關(guān)鍵[4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水中磷酸鹽含量的分析方法有分光光度法、重量法等化學(xué)方法，離子色譜、ICP-AES、電極電位等儀器分析方法也在快速普及[5-8]。分光光度法是經(jīng)典測(cè)定方法，在水樣中磷酸鹽含量分析時(shí)仍起著不可替代的作用。其中的磷鉬藍(lán)分光光度法是目前水樣中磷酸鹽含量測(cè)定的常用方法，其中《水質(zhì)總磷的測(cè)定 鉬酸銨分光光度法》(GB 11893-89)[9]此標(biāo)準(zhǔn)適用于地面水、污水和工業(yè)廢水，最低檢出濃度為0.01 mg/L，測(cè)定上限為0.6 mg/L?！端|(zhì) 磷酸鹽和總磷的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)-鉬酸銨分光光度法》(HJ 670-2013)[10]當(dāng)檢測(cè)光程為50 mm時(shí)，方法檢出限(以P計(jì))為0.01 mg/L，測(cè)定范圍為0.04～1.0 mg/L。這個(gè)方法測(cè)定磷的含量范圍能滿足判定水質(zhì)是否符合《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838-2002)規(guī)定的我國(guó)III類水的水體中總P濃度臨界指標(biāo)0.2 mg/L、湖泊和水庫(kù)中總P濃度臨界指標(biāo)0.05 mg/L。但磷鉬藍(lán)分光光度法測(cè)定磷酸鹽的缺點(diǎn)是靈敏度不夠高，對(duì)于水中微量磷(低于0.04 mg/L)的檢測(cè)難以應(yīng)用[6,7,11-13]，這對(duì)于研究水體中磷的積累過(guò)程、進(jìn)行早期預(yù)警是不利的?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法的原理是在酸性條件下，堿性染料孔雀綠與磷鉬雜多酸生成綠色離子締合物，同時(shí)以聚乙烯醇穩(wěn)定顯色液，直接用分光光度計(jì)測(cè)定。它可用于水中低含量濃度范圍磷的檢測(cè)，但顯色劑的配制方法和用量、孔雀綠的溶解過(guò)程、表面活性劑用量和最大吸光度波長(zhǎng)等關(guān)鍵內(nèi)容尚無(wú)明確結(jié)論[14-18]。研究建立一種更準(zhǔn)確的水中微量磷酸鹽檢測(cè)方法。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究孔雀綠磷鉬雜多酸分光光度法中關(guān)鍵環(huán)節(jié)技術(shù)條件變化對(duì)水中微量磷測(cè)定值的影響，評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確度和精密度，建立一種水中微量磷酸鹽檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑

濃硫酸、鉬酸銨、孔雀綠、聚乙烯醇(PVA)、 磷酸二氫鉀均為分析純。水為去離子水，符合GB/T6682二級(jí)水的規(guī)定。

1.1.2 儀器

紫外可見分光光度計(jì)(島津 UV-2700)、精密分析天平(精確至0.1 mg)、超純水系統(tǒng)(阻抗18.02MΩ·cm)。

1.2 方 法

1.2.1 溶液配制

鉬酸銨溶液(濃度176.5 g/L)：溶解176.500 g鉬酸銨于水中，稀釋定容至1 000 mL；孔雀綠溶液(濃度11.2 g/L)：加熱溶解5.600 g 孔雀綠于水中，稀釋定容至500 mL；1%聚乙烯醇(PVA)溶液：加熱溶解10.000 g PVA于水中，冷卻，稀釋定容至1 000 mL，經(jīng)濾紙過(guò)濾備用；鉬酸銨:濃硫酸:孔雀綠=40:32:34(體積比/mL)顯色劑：濃硫酸和孔雀綠溶液依次緩慢加入鉬酸銨溶液中，混勻后冷卻，經(jīng)濾紙過(guò)濾備用，避光貯藏；100 mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：溶解 0.219 7 g磷酸二氫鉀(105℃下烘干2 h)于水中，定容至500 mL，臨用前稀釋至所需濃度。

1.2.2 優(yōu) 化

準(zhǔn)確吸取1.0 mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)使用液1.0、1.5、2.0 mL于25 mL比色管中，依次加入2.00 mL顯色劑及1.00 mL 1% PVA溶液，搖勻，用水定容，室溫放置30 min，在400 ～700 nm波長(zhǎng)處掃描測(cè)定吸光度，得到最大吸收波長(zhǎng)。選擇特征波長(zhǎng)620 nm，依次對(duì)顯色劑比例與用量、表面活性劑PVA用量，顯色穩(wěn)定時(shí)間等指標(biāo)優(yōu)化。選擇1湖水樣品和系列低濃度磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，用優(yōu)化后的測(cè)定方法進(jìn)行方法回收率、精密度、檢出限等。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用1.0 mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液，按1.2的條件測(cè)定，以空白溶液為參比，于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以磷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=3.485 9X-0.007 96(R2=0.999 1)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品平行測(cè)定6次，樣品中磷含量用P元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。6次測(cè)量值pi的算術(shù)平均值為樣品中磷的估計(jì)值，即測(cè)量結(jié)果，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收波長(zhǎng)與吸光度關(guān)系

在0.04、0.06和0.08 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)磷溶液中，加入按文獻(xiàn)[15-18]常用比例配制的顯色劑(鉬酸銨/孔雀綠/濃硫酸=40/35/35，體積比)2.00 mL，在400～700 nm波長(zhǎng)內(nèi)，分別掃描溶液的吸光度，吸光度均在620 nm處達(dá)到最大，因此實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)選擇620 nm。雖然有研究發(fā)現(xiàn)綠色締合物與空白的吸光度差值在580 ～680 nm較大，在660 nm處最大[17]。圖1

圖1 孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法測(cè)定不同磷濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜

Fig.1 The MG colorimetric method of determinate absorption spectra of different phosphorus concentrations

2. 2 顯色劑配比對(duì)吸光度的影響

孔雀綠用量和溶液酸度對(duì)孔雀綠磷鉬雜多酸顯色反應(yīng)影響較大，在已有文獻(xiàn)中顯色劑配制比例均有差異[15-18]。試驗(yàn)中設(shè)計(jì)了由不同比例孔雀綠和硫酸配制的顯色劑，通過(guò)比較吸光度選擇合適的孔雀綠與硫酸用量。

以40 mL鉬酸銨溶液和32 mL孔雀綠溶液為基液，再添加不同體積硫酸溶液，配制成不同酸度的顯色劑，分別吸取2.00 mL加入到0.1 mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液中，按1.2步驟，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。研究表明，當(dāng)硫酸用量為32～36 mL時(shí)，顯色反應(yīng)吸光值較大，也較穩(wěn)定。

以40 mL鉬酸銨溶液和34 mL濃硫酸為基液，加入不同體積孔雀綠溶液，配制成顏色不同深度的顯色劑，加入0.1 mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液中，按1.2步驟，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。加入的孔雀綠溶液為34 mL時(shí)吸光值最高，加入量在32～38 mL之間吸光值并無(wú)顯著變化。圖2

確定顯色劑配比為：鉬酸銨溶液(176.5 g/L)/孔雀綠溶液(11.2 g/L)/濃硫酸=40/36/34(體積比)。

圖2 不同硫酸和孔雀綠用量的顯色劑下相同濃度磷溶液吸光度

Fig. 2 The absorbance of different amount of sulfuric acid and malachite green

2. 3 顯色劑用量的確定

在0.1 mg/L的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液中，分別加入按2.2方法配制的顯色劑1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL，及1 mL PVA試劑，定容至25 mL。在620 nm測(cè)定吸光度分別是0.268、0.309、0.345、0.344、0.335、0.315。顯色劑用量2和2.5 mL時(shí)吸光度最大，最終確定顯色劑用量為2 mL，即顯色體積中顯色劑比例占8%。

2.4 聚乙烯醇(PVA)用量對(duì)吸光度的影響

PVA是表面活性劑，作用就是作為增敏劑與增溶劑，通過(guò)疏水作用，在酸性條件下磷鉬雜多酸與孔雀綠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí)，使孔雀綠分子與磷鉬雜多酸更好的結(jié)合，生成穩(wěn)定的綠色離子締合物。在5 mL的0.1 mg/L的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加入2 mL按2.2方法配制的顯色液，分別加入0.5、1、1.5、2、2.5 mL的PVA試劑，定容至25 mL，測(cè)定吸光度分別為0.311、0.342、0.335、0.339、0.340。表明PVA用量對(duì)吸光度影響不大。

2. 5 顯色時(shí)間與磷酸締合反應(yīng)的關(guān)系

在各5 ml的0.10、0.20 mg/L的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加入2.0 mL按2.2方法配制的顯色劑和1 mL PVA溶液，定容至25 mL后，在顯色10 min到12 h之間的9個(gè)顯色時(shí)間后，在620 nm迅速測(cè)定吸光度。發(fā)現(xiàn)在顯色30 min后，兩個(gè)濃度磷溶液的吸光度達(dá)到最大，隨著顯色時(shí)間增長(zhǎng)吸光度再?zèng)]有明顯增大。說(shuō)明30 min后磷酸締合反應(yīng)基本完成，并且磷酸締合物穩(wěn)定時(shí)間較長(zhǎng)，至少可達(dá)12 h。圖3

圖3 不同顯色時(shí)間的磷溶液吸光度

Fig. 3 Theabsorbance of different color-developing time

2. 6 方法準(zhǔn)確度、精密度和檢出限

采用優(yōu)化后的測(cè)定方法，即分別在湖水樣、5.0、10.0、60.0、100 μg/L磷標(biāo)準(zhǔn)液，以及湖水樣+10.00、湖水樣+20.00、湖水樣+60.00 μg /L磷標(biāo)準(zhǔn)液中，加入2 .0 mL顯色劑和1.0 mL PVA溶液，顯色30 min，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。結(jié)果表明，無(wú)論是磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，還是加入磷標(biāo)準(zhǔn)液的湖水樣，所測(cè)的回收率均在97.0 %～108.2 %之間。溶液磷濃度小于10 μg /L時(shí)，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在8.3%～9.1%；大于10 μg/L時(shí)RSD則小于5 %。顯然方法的準(zhǔn)確度、精密度符合水質(zhì)監(jiān)測(cè)需求。表1

3 討 論

表1 優(yōu)化方法測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率(n=6)

Table. 1 The relative standard deviation and recovery rate of the optimized test method(n=6)

處理TreatmentsP平均值(μg/L)MeasuredPvalue相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)回收率(%)Recoveryrate湖水樣24．5±1．87．4/湖水+10．00μg/LP標(biāo)準(zhǔn)溶液35．1±1．54．3106．0湖水+20．00μg/LP標(biāo)準(zhǔn)溶液43．9±1．22．797．0湖水+60．00μg/LP標(biāo)準(zhǔn)溶液85．4±1．11．3101．55．00μg/LP標(biāo)準(zhǔn)溶液5．50±0．59．1108．2%10．00μg/LP標(biāo)準(zhǔn)溶液10．80±0．98．3108．1%60．00μg/LP標(biāo)準(zhǔn)溶液59．3±2．13．598．8%100．00μg/LP標(biāo)準(zhǔn)溶液101．1±2．12．1101．1%

注：測(cè)定值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(n=6)

按照國(guó)際應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)檢出限測(cè)定方法[19,20]，用空白試劑進(jìn)行了12次重復(fù)測(cè)定，試劑空白平均值3.2 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)為0.0004，檢出限MLD=3×SD=1.2 μg/L。這個(gè)檢出限遠(yuǎn)小于《水質(zhì) 磷酸鹽和總磷的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)-鉬酸銨分光光度法》標(biāo)準(zhǔn)(HJ 670-2013)[13]和《水質(zhì)總磷的測(cè)定 鉬酸銨分光光度法》標(biāo)準(zhǔn)(GB 11893-89)[12]的檢出限0.01 mg/L(10 μg/L)，也小于《水質(zhì)磷酸鹽的測(cè)定 離子色譜法》標(biāo)準(zhǔn)(HJ 669-2013)[8]的檢出限7μg/L。

4 結(jié) 論

對(duì)孔雀綠-磷鉬雜多酸分光光度法關(guān)鍵技術(shù)條件優(yōu)化后，檢出限低至1.2 μg/L，靈敏度高，線性范圍寬，顯色溶液穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)，準(zhǔn)確度、精密度符合水質(zhì)監(jiān)測(cè)需求，操作簡(jiǎn)便，可用于水中微量磷酸鹽含量的測(cè)定；優(yōu)化后的關(guān)鍵條件是：顯色劑按鉬酸銨(176.5 g/L)/孔雀綠(11.2 g/L)/ 濃硫酸=40/32/34(體積比)配制，顯色劑用量2.0 mL，1%聚乙烯醇(PVA)溶液1.0 mL，顯色30 min，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

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Determinationofphosphateinwaterbythecomplexesofmalachitegreen-phosphomolybdatespectphotometry

Zhu Jing-rong1,Wen Yun-jie2,Song Shu-hui2, Ma Lei1, Zhang Jin-yao2, Wang Hong2

(1.InstituteofQualityStandards&TestingTechnologyforAgro-products,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091，China;2.NationalEngineeringLaboratoryforImprovingQualityofArableLand/KeyLaboratoryofPlantNutritionandFertilizer，MinistryofAgriculture/InstituteofAgriculturalResourcesandRegionalPlanning,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081，China)

【Objective】 Phosphorus molybdenum blue spectrophotometry is a commonly used method for the determination of phosphate in water, but it is not suitable for low concentration (<0.04 mg / L). This paper attempts to establish a more accurate method for the determination of trace phosphate in water. 【Method】 The maximum absorption wave length, the ratio and amount of malachite green and concentrated sulfuric acid in the colorant, the amount of PVA, the color stability time and so on were optimized in the range of the maximum absorption wave length of the malachite green-phosphomolybdate heteropoly acid spectrophotometry. The recovery rate, precision and detection limit of the optimized method were studied using a lake sample and a series of low concentrations of phosphorus standard solution.【Results】 The maximum absorption wavelength was 620 nm, the volume ratio of ammonium molybdate(176.5 g/L)/sulfuric acid(11.2 g/L)/malachite green was 40/32/34 in chromogenic agent. The proportion of color reagent in color development accounted for 8%, PVA 4%. Color stability time was up to 12 h. The detection limit was 1.2 μg/L, the relative standard deviation RSD was in the range of 8.3% -9.1% when the phosphorus concentration was less than 10.00 μg / L, and the RSD was less than 5% when the P concentration was more than 10.00 μg/L. The recovery rate was in the range of 97.0%-108.2%. 【Conclusion】The modified malachite green-phosphomolybdate heteropoly acid spectrophotometric detection limit is low, the sensitivity is high, the linear range is wide, the color solution is stable, the accuracy and precision meet the water quality requirement, and the operation is simple and suitable for the microphosphate content of the detection.

malachite green (MG); spectphotometry; phosphate; water sample

Wang hong(1970- ), male, native place: Anhui. Professor, Ph.D.,research field: Study on crop nutrition and detection technology. (Email) wanghong01@caas.cn*

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.023

2017-04-15

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2013CB127402)

朱靖蓉(1972-)，女，浙江人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)技術(shù), zhujr2030@163.com

汪洪(1970-)， 男，安徽人， 研究員，博士，研究方向作物營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)技術(shù)，wanghong01@caas.cn

S19

：A

：1001-4330(2017)08-1559-07

Supported by: The Major State Basic R & D Program of China (973 Program) (2013CB127402)