甘藍(lán)型油菜含油量性狀的QTL定位

王燕惠，顧元國，范李萍，段雅潔，高文偉，曲延英，陳躍華

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)試驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊 830091)

甘藍(lán)型油菜含油量性狀的QTL定位

王燕惠1，顧元國1，范李萍1，段雅潔1，高文偉1，曲延英1，陳躍華2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)試驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊 830091)

【目的】開發(fā)與含油量相關(guān)的分子標(biāo)記，發(fā)掘與該性狀相關(guān)的基因?！痉椒ā恳許pringfield-B和ymnm-8作為親本構(gòu)建F2群體，利用SRAP分子標(biāo)記構(gòu)建甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖譜?！窘Y(jié)果】該遺傳圖譜含有52個標(biāo)記位點(diǎn)，圖譜全長1 039.6 cM，含有15個連鎖群，標(biāo)記間的平均遺傳距離為19.9 cM。分析與含油量相關(guān)的QTL位點(diǎn)，獲得了2個與含油量相關(guān)QTL位點(diǎn)。其中qOC1位于連鎖群LG1:EM9ME6-EM17ME24標(biāo)記區(qū)，qOC15位于連鎖群LG1: EM3ME5-EM4ME22a標(biāo)記區(qū)間，其表型變異解釋率分別為11.23%和4.12%，加性效應(yīng)值分別為0.48和3.56?！窘Y(jié)論】獲得了2個與含油量相關(guān)QTL位點(diǎn)，為研究甘藍(lán)型油菜含油量奠定了一定的基礎(chǔ)。

甘藍(lán)型油菜；含油量；遺傳連鎖圖譜；QTL定位

0 引 言

【研究意義】油菜作為世界主要食用油作物，同時是我國第一大油料作物，為我國食用油的主要來源[1]。甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)為主要油菜育種栽培類型，許多學(xué)者提出其主要育種目標(biāo)為“雙低一高”，“一高”指的就是高產(chǎn)量、高含油量。甘藍(lán)型油菜含油量是有多基因控制的數(shù)量遺傳性狀，且環(huán)境因素影響較大，常規(guī)育種手段很難達(dá)到育種目標(biāo)[1]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用，甘藍(lán)型油菜含油率研究進(jìn)入分子水平?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究發(fā)現(xiàn)，高含油量親本對選育高含油量品系至關(guān)重要，陳玉峰[2]利用分子標(biāo)記技術(shù)，對我國高含油量油菜種質(zhì)資源進(jìn)行分析，從中挑選出22個雙親含油量均大于45.0%、均為雙低且親本之間遺傳距離大于0.5。張潔夫等[3]利用BC1 F1 為作圖群體，構(gòu)建了由19 個連鎖群組成的分子標(biāo)記遺傳圖譜，進(jìn)行甘藍(lán)型油菜QTL定位掃描，發(fā)現(xiàn)其含油量由1對加性-顯性主基因+加性-顯性-上位性多基因控制，同時定位出5 個與含油量相關(guān)的QTL位點(diǎn)。萬成燕[4]綜合利用SSR、RAPD和SRAP三種分子標(biāo)記構(gòu)建出一張分子標(biāo)記遺傳圖譜，檢測到了2個與含油量相關(guān)的QTL位點(diǎn)。有學(xué)者自主開發(fā)了一批甘藍(lán)型油菜GSS-SSR標(biāo)記，并將其用于構(gòu)建遺傳連鎖圖，檢測到了一系列控制含油量的QTLs[5,6]。孫美玉[7]對甘藍(lán)型油菜含油量QTLs定位及候選基因篩選，共檢測到17個QTLs。通過QTL定位，每個QTL解釋含油量表型變異是9.15%～24.56%，結(jié)合差異表達(dá)基因，共得到了7個含油量候選基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)引不同遺傳背景的甘藍(lán)型油菜含油量相關(guān)QTL定位鮮見報道，為進(jìn)一步研究控制含油量的相關(guān)基因，研究以來源于加拿大高含油量材料為母本，以來源于我國內(nèi)蒙古低含油量材料為父本， F2代為作圖群體，利用480對SRAP引物構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳圖譜。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對遺傳背景差異較大的甘藍(lán)型油菜含油量進(jìn)行QTL定位，進(jìn)一步確定影響含油量的相關(guān)基因，為提高其含油量奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

參試品種母本為Springfield-B母本，來源于加拿大，含油量48.51%，父本ymnm-8，來源于我國內(nèi)蒙古，含油量23.70%。于2014年4月至2015年7月在新疆農(nóng)科院安寧渠試驗(yàn)場進(jìn)行，收獲F2代，于2015年10月海南試驗(yàn)基地種植F2代， 共132棵單株，苗期取單株幼嫩葉片，采用CTAB法提取樣品DNA，于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 引物序列及條帶統(tǒng)計

參考G. Li 、 M. Gao[8]公布的SRAP引物，共480對引物，對供試品種DNA進(jìn)行擴(kuò)增，對清晰、穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶記為1，無帶的記為0，缺失的記為-1。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

列出PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序。表1，表2

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 F2群體含油量的平均值、變異系數(shù)及變異范圍

利用SAS8.1軟件(SAS Institute Inc., Cary, NC,USA)分析F2群體油菜含油率的平均值、變異系數(shù)及變異范圍。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

Table 1 PCR amplification reaction system

試劑Reagent體積Volume(μl)10×TaqBuffer(含Mg+)1 0dNTP(10mmol/L)0 8TaqDNAPolymerase(0 1U/μL)0 1引物Primer(10μmol/L)0 8DNA模板(60ng/μL)1 0ddH2O6 3

表2 PCR反應(yīng)程序

Table 2 PCR reaction procedure

過程Process溫度Temperature時間Time預(yù)變性Predenaturation94℃4min變性Denaturation94℃(5個循環(huán))1min退火Annealing35℃(5個循環(huán))45s延伸Extend72℃1min變性Denaturation94℃(35個循環(huán))1min退火Annealing50℃(35個循環(huán))45s延伸Extend72℃1min延伸Extend72℃10保存4℃

1.3.2 數(shù)據(jù)處理

利用SAS8.1軟件(SAS Institute Inc., Cary, NC,USA)分析F2群體油菜含油率的平均值、變異系數(shù)及變異范圍。其中母本記為2，父本記為0，F(xiàn)1記為1，缺失記為了1，F(xiàn)2分別記為2/0/1/-1。

1.3.3 分子遺傳圖譜的構(gòu)建及含油量的QTL定位

利用QTL作圖軟件QTL IciMapping Version3.2進(jìn)行遺傳連鎖圖譜繪制。設(shè)定LOD值為3.0，最大遺傳距離50 cm的情況下，通過復(fù)合區(qū)間法對甘藍(lán)型油菜含油量性狀進(jìn)行QTL定位。并計算各個標(biāo)記對表型能夠解釋的變異值和遺傳效應(yīng)值。

QTLs命名方法按照英文字母“q+性狀名稱的縮寫+連鎖群號”表示，性狀和連鎖群號之間加“-”隔開，同一染色體的不同QTL則在染色體名稱后加1、2等區(qū)分。

2 結(jié)果與分析

2.1親本及F2群體表型性狀

研究表明，F(xiàn)2群體含油量均值38.12%、變幅23.81%～48.47%、變異系數(shù)22.35%， F2群體分離較大；對F2群體進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，F(xiàn)2群體含油率性狀均成連續(xù)性變化，符合正態(tài)分布，且偏度與峰度的檢驗(yàn)結(jié)果均小于1，說明該群體可進(jìn)一步用于遺傳圖譜構(gòu)建。表3，圖1

表3 親本及F2群體田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

圖1 含油率次數(shù)分布

Fig.1 Frequency distribution diagram of oil content

2.2 親本間多態(tài)性篩選

試驗(yàn)利用220對SRAP引物對親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，其中52對引物表現(xiàn)出多態(tài)性，共獲得59個多態(tài)性位點(diǎn)，其中檢測到2個分離位點(diǎn)的標(biāo)記有5個，檢測到3個分離位點(diǎn)的標(biāo)記有2個，其余標(biāo)記均檢測到單個分離位點(diǎn)。圖2，圖3

2.3 繪制連鎖圖譜

以F2代為作圖群體，利用QTL作圖軟件QTL IciMapping Version 3.2進(jìn)行遺傳作圖，44個SRAP標(biāo)記位于15個連鎖群上，全長1 039.6 cM，標(biāo)記間平均距離為23.63 cM。圖4，表3

圖2 親本在不同SSR引物下的擴(kuò)增圖

Fig.2 Amplification map of parents under different SSR primers

圖3 引物EM16ME13在群體部分單株擴(kuò)增結(jié)果

Fig.3 Amplification of primer EM16ME13 in each plant population

圖4 群體連鎖圖譜

Fig.4 Population linkage map

表3 遺傳圖譜標(biāo)記在連鎖群上的定位

2.4 標(biāo)記基因型分離比例檢測

按數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化法將電泳帶型轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)，統(tǒng)計基因型，利用卡方檢驗(yàn)法檢驗(yàn)位點(diǎn)分離比情況，52個多態(tài)性位點(diǎn)有10個偏離1∶2∶1的分離比例，占標(biāo)記位點(diǎn)的19.20%。

2.5 含油量性狀的QTL檢測

運(yùn)用QTL Icimapping v2.2的復(fù)合區(qū)間法對甘藍(lán)型油菜含油量進(jìn)行QTL分析，檢測到2個與含油量相關(guān)的QTL位點(diǎn)。其中qOC1位于連鎖群LG1: EM9ME6-EM17ME24，其貢獻(xiàn)率為4.12%，加性效應(yīng)值為0.48，qOC15位于連鎖群LG1：EM3ME5-EM4ME22a(圖3～4)，其貢獻(xiàn)率為11.23%，其加性效應(yīng)值為0.63。表4

表4 油菜含油量的QTL定位

Table 4 QTL location of oil content in rape

QTL連鎖群Linkagegroup標(biāo)記區(qū)間Markinterval位置Position加性效應(yīng)AdditiveeffectLOD貢獻(xiàn)率ContributionrateqOC1LG149 74EM9ME6-EM17ME240 482 324 12%qOC15LG1535 14EM3ME5-EM4ME22a0 633 5611 23%

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜含油率是多基因控制，且受環(huán)境因素影響較大[9-11]，研究發(fā)現(xiàn)，與甘藍(lán)型油菜含油量相關(guān)的SRAP標(biāo)記位于15個遺傳連鎖群上，通過QTL定位分析，2個QTI位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率為15.35%，加性效應(yīng)高達(dá)0.63。與前人研究結(jié)果相似[12-14]，張書芬[15]通過對甘藍(lán)型油菜含油率主基因+多基因遺傳效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)分離世代F2及F2∶3家系含油量次數(shù)分布均呈混合的正態(tài)分布，符合主基因+多基因的遺傳特征，同時甘藍(lán)型油菜含油量受非加性效應(yīng)影響，高含油量雜交油菜育種應(yīng)以一般配合力較高的親本為主。

目前許多學(xué)者對油菜含油量進(jìn)行QTLs定位，同時對相關(guān)基因進(jìn)行篩選。進(jìn)一步確定控制油菜含油量的主效基因，開發(fā)相關(guān)分子標(biāo)記，在后代群體中進(jìn)行篩選，避免環(huán)境因素造成的基因型丟失，更重要的是縮短育種年限。研究利用F2群體進(jìn)行遺傳連鎖作圖、QTL定位，44個SRAP標(biāo)記位于15個連鎖群上，全長1 039.6 cM，標(biāo)記間平均距離為23.63 cM。王繼變[16]以SGE群體為作圖群，構(gòu)建了一個全長為1 142.8 cM、標(biāo)記間平均距離為6.68 cM的SGE甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖譜，共有93個標(biāo)記位點(diǎn)完全匹配。邵玉鎖[17]分別用BC3F1群體、DH群體進(jìn)行QTL定位，進(jìn)一步確定了與含油量相關(guān)的QTL標(biāo)記位于A7連鎖群上，且標(biāo)記直間約3 cM，在該區(qū)間存在控制油菜含油量基因可信度更高。研究僅僅只是在F2群體中進(jìn)行初步定位，所用標(biāo)記只有SRAP標(biāo)記，要確定本次QTL定位的準(zhǔn)確性，需要構(gòu)建DH群體或BC3F1群體，利用更多的分子標(biāo)記對遺傳連鎖圖譜進(jìn)行加密，確定所定位的準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

以高含油率Springfield-B作為母本、低含油率ymnm-8作為父本構(gòu)建F2群體，建立遺傳連鎖圖譜，分析與含油量相關(guān)的QTL位點(diǎn)，獲得了2個與含油量相關(guān)QTL位點(diǎn)。其中qOC1位于連鎖群LG1的EM9ME6-EM17ME24標(biāo)記區(qū)間，標(biāo)記對表型能夠解釋的變異值為4.12%，加性效應(yīng)為0.48，qOC15位于連鎖群LG1的EM3ME5-EM4ME22a標(biāo)記區(qū)間，標(biāo)記對表型能夠解釋的變異值為11.23%，其加性效應(yīng)為0.63。

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MappingQTLsforOilContentTraitsinBrassicanapusL.

WANG Yan-hui1, GU Yuan-guo2, FAN Li-ping1, DUAN Ya-jie1, GAO Wen-wei1, QU Yan-ying1, CHEN Yue-hua2

(1.CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofAgricultureBiologicalTechnology,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China; 2.ResearchInstituteofEconomicCrops,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 To locate the molecular markers related to the oil and explore the genes related to the trait. 【Method】In this study, F2population was constructed with Springfield-B and ymnm-8 as parents, and SRAP molecular markers were used to construct the genetic linkage map ofBrassicanapusL. 【Result】The results showed that the genetic map contained 52 marker sites with a total length of 1,039.6 cM and 15 linkage groups. The average genetic distance between the markers was 19.9 cM. The QTLs associated with oil content were analyzed and two QTLs related to oil content were obtained. QOC15 was located in the linkage group LG1: EM3ME5-EM4ME22a, and the explanatory rates were 11.23% and 4.12%, respectively, and the additive effect values were 0.48 and 3.56, respectively. The qOC1 was located in the linkage group LG1: EM9ME6-EM17ME24. 【Conclusion】Two QTL loci related to oil content were obtained, which laid a foundation for the study of oil content inBrassicanapusL.

BrassicanapusL.; oil content; genetic linkage map; QTL mapping

GAO Wen-wei (1973-) male, native place:Shanxi, Professor, research field: Crop genetics and breeding. (E-mail)280594606@qq.com CHEN Yue-hua (1958-), male, Changji, Xinjiang ,Researcher，research field: Genetics, breeding and cultivation of rape，(E-mail)chenyuehua158576@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.08.008

2017-06-05

自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展計劃“新疆甘藍(lán)型春油菜分子標(biāo)記輔助雜種培育技術(shù)應(yīng)用”(201311109)

王燕惠(1989-)，女，福建安溪人，碩士研究生，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種，(E-mail)280594606@qq.com

高文偉(1973-)，男，陜西乾縣人，教授，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種，(E-mail)280594606@qq.com 陳躍華(1958-)，男，新疆昌吉人，研究員，研究方向?yàn)橛筒诉z傳育種與栽培，(E-mail)chenyuehua158576 @ sina.com

S565.4

：A

：1001-4330(2017)08-1437-07

Supported by: Autonomous research and development plan for high technology "Application of molecular marker assisted hybrid breeding technique for Brassica napus in Xinjiang" (201311109)