兔肝VX2腫瘤射頻消融后不同區(qū)帶VEGF的表達(dá)和細(xì)胞凋亡

劉 亞，呂維富，朱先海，施長(zhǎng)杲，王亞光，劉開(kāi)才，成德雷，周春澤，魯 東

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院影像科，安徽 合肥 230001)

·基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究·

兔肝VX2腫瘤射頻消融后不同區(qū)帶VEGF的表達(dá)和細(xì)胞凋亡

劉 亞，呂維富*，朱先海，施長(zhǎng)杲，王亞光，劉開(kāi)才，成德雷，周春澤，魯 東

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院影像科，安徽 合肥 230001)

目的分析兔肝VX2腫瘤射頻消融(RFA)后不同區(qū)帶血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞凋亡情況。方法將48只兔肝移植VX2腫瘤，建立動(dòng)物模型，分為實(shí)驗(yàn)組(n=42)和對(duì)照組(n=6)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組行RFA，分別在術(shù)后即刻、1天、2天、1周、2周、3周各處死7只實(shí)驗(yàn)兔，留存腫瘤標(biāo)本，進(jìn)行HE染色、VEGF檢測(cè)、Annexin V-FITC/PI標(biāo)記和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察不同時(shí)間段、不同區(qū)帶的VEGF變化及細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組RFA術(shù)后針道炭化區(qū)、熱凝固區(qū)和消融邊界區(qū)平均VEGF值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；針道炭化區(qū)、熱凝固區(qū)及邊界區(qū)術(shù)后即刻與其他時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；針道炭化區(qū)及熱凝固區(qū)VEGF在術(shù)后即刻達(dá)高峰，術(shù)后1天～3周呈整體下降趨勢(shì)，消融邊界區(qū)VEGF在術(shù)后即刻到1周呈上升趨勢(shì)，2周后下降。術(shù)后針道炭化區(qū)、熱凝固區(qū)和消融邊界區(qū)平均腫瘤細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，各區(qū)帶細(xì)胞凋亡率均在術(shù)后1天達(dá)高峰，后呈下降趨勢(shì)。結(jié)論RFA后針道區(qū)和熱凝固區(qū)內(nèi)腫瘤細(xì)胞VEGF下降和腫瘤凋亡顯著，而消融交界區(qū)仍可能有存活的腫瘤細(xì)胞；在RFA后第3周時(shí)，殘留腫瘤細(xì)胞的增殖能力可恢復(fù)到術(shù)前狀態(tài)，此時(shí)宜進(jìn)一步采取相應(yīng)的治療措施。

兔；肝；VX2腫瘤；射頻消融；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；凋亡

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)是HCC的高發(fā)國(guó)家。發(fā)現(xiàn)HCC時(shí)已多屬中晚期，加之多數(shù)患者合并肝硬化，僅20%的患者有手術(shù)切除機(jī)會(huì)[1]。因此，肝癌的微創(chuàng)治療得以迅速發(fā)展。目前，射頻消融(radiofrequency ablation, RFA)已廣泛應(yīng)用于臨床[2]。有研究[3]報(bào)道單次RFA后殘癌復(fù)發(fā)率約3%～52%。殘癌復(fù)發(fā)與RFA后殘余腫瘤組織細(xì)胞活性變化有關(guān)，殘余腫瘤釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)對(duì)新生血管的形成及觸發(fā)轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。探討RFA后靶區(qū)內(nèi)不同區(qū)帶細(xì)胞的凋亡變化規(guī)律，有利于在肝癌的RFA治療中制定科學(xué)的治療方案，獲得最佳的“安全邊界”。因此，本研究旨在分析RFA后腫瘤不同區(qū)帶VEGF的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1模型制備 荷VX2瘤種兔1只，健康新西蘭大白兔48只(由我院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供)，3～5月齡，雌雄不限，體質(zhì)量2.2～2.5 kg。切取種兔后腿VX2腫瘤邊緣生長(zhǎng)旺盛區(qū)，剪成直徑約2 mm的小塊，置于生理鹽水保存。經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg體質(zhì)量)對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行全身麻醉，開(kāi)腹將VX2腫瘤種植于兔肝臟左葉深處，完成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽洹?/p>

1.2RFA方法 于腫瘤成功植入第14天行CT平掃和增強(qiáng)掃描，確定移植瘤生長(zhǎng)情況。按照隨機(jī)數(shù)字表法將48只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為2組：實(shí)驗(yàn)組(n=42)，全身麻醉開(kāi)腹后行RFA治療(治療模式：功率48 W，溫度60～90℃，時(shí)間12 min)。分別于術(shù)后即刻和術(shù)后1天、2天、1周、2周、3周處死實(shí)驗(yàn)兔(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)7只)，取出病灶置于-80℃冰箱保存，行病理學(xué)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查。對(duì)照組(n=6)，動(dòng)物直接處死后取組織標(biāo)本。

1.3病理學(xué)檢查和流式細(xì)胞儀檢測(cè) 首先取大體病理標(biāo)本進(jìn)行觀察，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組根據(jù)RFA消融后瘤體呈現(xiàn)的3個(gè)區(qū)帶(即針道炭化區(qū)、熱凝固區(qū)、消融邊界區(qū))進(jìn)行組織提取，對(duì)照組取瘤體生長(zhǎng)旺盛部分組織(各3塊)分別行HE染色、VEGF表達(dá)、膜聯(lián)蛋白-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)染色。并進(jìn)行熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)。VEGF表達(dá)強(qiáng)度以強(qiáng)度評(píng)分(intersity score, IS)[4]表示，每張切片中隨機(jī)選取10個(gè)視野，將細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4級(jí)，并分別記分：0分為陰性，細(xì)胞無(wú)顯色；1分為弱陽(yáng)性，細(xì)胞顯色為淺黃色；2分為中度陽(yáng)性，細(xì)胞顯色為棕黃色；3分為強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞顯色為棕褐色。按以下公式計(jì)算IS：IS=∑[(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)]，F(xiàn)為每級(jí)染色強(qiáng)度細(xì)胞數(shù)占全部視野細(xì)胞數(shù)的百分比，數(shù)字表示染色強(qiáng)度級(jí)別。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以±s表示；實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)及細(xì)胞凋亡率的比較、實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)不同區(qū)帶細(xì)胞凋亡率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1組織病理學(xué)改變 對(duì)照組：瘤體無(wú)明顯包膜，切面呈魚(yú)肉狀改變，部分組織壞死；光鏡下腫瘤細(xì)胞異型性明顯，見(jiàn)浸潤(rùn)性癌巢，胞核大且深染。實(shí)驗(yàn)組：RFA后即刻，病灶區(qū)由內(nèi)向外大致分為針道炭化區(qū)、熱凝固區(qū)及消融邊界區(qū)。光鏡下見(jiàn)針道炭化區(qū)腫瘤細(xì)胞大量壞死，細(xì)胞核碎裂、固縮，1周后腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示模糊，出現(xiàn)溶解液化及血栓形成，2周后液化溶解范圍進(jìn)一步擴(kuò)大(圖1A)；熱凝固區(qū)以腫瘤細(xì)胞壞死為主，少量腫瘤細(xì)胞殘存，大量巨嗜細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及少量凋亡細(xì)胞共存，1周后較多的炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，3周后見(jiàn)部分腫瘤細(xì)胞存活；消融邊界區(qū)第1天可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞，肝竇間隙紅細(xì)胞交界區(qū)內(nèi)伴隨形態(tài)、分布較規(guī)則的腫瘤細(xì)胞，1周后可見(jiàn)少量膠原組織及纖維組織，2周后殘存腫瘤細(xì)胞增生(圖1B)。

表1 RFA術(shù)后各消融區(qū)的VEGF的表達(dá)IS值(±s)

表1 RFA術(shù)后各消融區(qū)的VEGF的表達(dá)IS值(±s)

區(qū)帶即刻術(shù)后1天術(shù)后2天術(shù)后1周術(shù)后2周術(shù)后3周針道炭化區(qū)0.62±0.120.23±0.080.25±0.070.18±0.050.20±0.080.21±0.11熱凝固區(qū)0.58±0.070.22±0.110.24±0.050.19±0.060.25±0.110.30±0.06消融邊界區(qū)0.63±0.192.15±0.142.31±0.052.40±0.172.16±0.171.85±0.09

表2 實(shí)驗(yàn)組RFA后不同區(qū)帶腫瘤細(xì)胞凋亡率的變化(%，±s)

表2 實(shí)驗(yàn)組RFA后不同區(qū)帶腫瘤細(xì)胞凋亡率的變化(%，±s)

區(qū)帶術(shù)后即刻術(shù)后1天術(shù)后2天術(shù)后1周術(shù)后2周術(shù)后3周針道炭化區(qū)7.08±0.8724.78±5.8824.01±4.5919.67±3.4313.86±4.368.12±0.35熱凝固區(qū)41.54±5.2642.14±5.5240.00±6.0432.14±6.9622.00±5.085.06±0.67消融邊界區(qū)45.52±6.1256.28±4.9150.69±6.5447.60±5.8022.57±3.374.96±0.71

圖1 RFA后2周病理改變(HE，×400) A.針道炭化區(qū),大片腫瘤細(xì)胞溶解、壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn); B.消融邊界區(qū)，腫瘤區(qū)與正常組織分界明顯，纖維組織增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯

圖2 RFA后1天不同區(qū)帶腫瘤細(xì)胞凋亡情況 A.針道區(qū)凋亡率17.21%; B.熱凝固區(qū)凋亡率43.89%; C.消融邊界區(qū)凋亡率62.34%

2.2VEGF表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后針道炭化區(qū)、熱凝固區(qū)和消融邊界區(qū)VEGF表達(dá)強(qiáng)度IS值術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.809、13.045和128.452，P均<0.05)，針道炭化區(qū)、熱凝固區(qū)及消融邊界區(qū)3個(gè)區(qū)帶術(shù)后即刻與其他時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，但術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)VEGF的變化規(guī)律不同，針道炭化區(qū)及熱凝固區(qū)VEGF在術(shù)后即刻達(dá)高峰，1天～2周呈下降趨勢(shì)，術(shù)后2周和3周略有上升趨勢(shì)，消融邊界區(qū)VEGF在術(shù)后即刻到1周呈上升趨勢(shì)，2周后下降。見(jiàn)表1。

術(shù)后即刻各區(qū)帶IS值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.305，P>0.05)，術(shù)后1天～3周，各區(qū)帶VEGF值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=318.559、2 917.230、1 317.678、599.603、757.407，P均<0.05)；除術(shù)后即刻外，其余各時(shí)間點(diǎn)消融邊界區(qū)VEGF表達(dá)均較針道炭化區(qū)及熱凝固區(qū)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，1周后VEGF值針道炭化區(qū)、熱凝固區(qū)、消融邊界區(qū)依次呈上升趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

2.3Annexin V-FITC/PI染色、熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè) 熒光顯微鏡觀察顯示實(shí)驗(yàn)組凋亡早期細(xì)胞膜呈綠色改變，中晚期凋亡細(xì)胞核呈紅色改變。對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為(4.05±0.29)%。實(shí)驗(yàn)組針道炭化區(qū)、熱凝固區(qū)和消融邊界區(qū)術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)腫瘤細(xì)胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.539、74.942、151.697，P均<0.05)，3個(gè)區(qū)帶各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)不同區(qū)帶的細(xì)胞凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=112.463、26.838、23.777、48.751、19.299、51.794，P均<0.05)，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)3個(gè)區(qū)帶間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。各區(qū)帶細(xì)胞凋亡率均在術(shù)后1天達(dá)高峰，后呈下降趨勢(shì)。術(shù)后即刻到術(shù)后2周細(xì)胞凋亡率由針道炭化區(qū)、熱凝固區(qū)至消融邊界區(qū)呈上升趨勢(shì)，而第3周有所下降。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)的不同區(qū)帶細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05；表2、圖2)。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)RFA后不同區(qū)帶、不同時(shí)間窗腫瘤的病理檢查發(fā)現(xiàn)：針道炭化區(qū)及熱凝固區(qū)雖存在少量腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但該類細(xì)胞多散在，不呈癌巢狀，且3周內(nèi)腫瘤細(xì)胞形態(tài)幾乎無(wú)變化，可據(jù)此鑒別殘癌組織。由于RFA治療中是高溫瞬間凝固作用，病灶內(nèi)部分腫瘤細(xì)胞形態(tài)被固定，雖然已經(jīng)失活，但細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保存完好，與活體組織非常相似，被稱之為鬼影細(xì)胞[5]，HE染色下與活體細(xì)胞難以正確區(qū)分。本組中針道炭化區(qū)可見(jiàn)少量的類似腫瘤細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組在2周內(nèi)均可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞形態(tài)，考慮為鬼影細(xì)胞，易誤認(rèn)為消融治療不徹底，消融病灶仍存在殘癌[6]。有研究[7]通過(guò)尼可酰胺腺嘌呤核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)組織化學(xué)染色法區(qū)分鬼影細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)由于殘癌組織中NADH含量高，顯色呈藍(lán)紫色，而鬼影細(xì)胞中無(wú)NADH，不顯色，可以據(jù)此鑒別。本研究通過(guò)觀察針道炭化區(qū)及熱凝固區(qū)細(xì)胞變化，認(rèn)為可通過(guò)細(xì)胞分布的區(qū)帶判斷消融后組織為腫瘤細(xì)胞或鬼影細(xì)胞。

VEGF是由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的一種二聚體糖蛋白，是一種最重要的調(diào)節(jié)血管生成的細(xì)胞因子[8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞表面有VEGF受體，VEGF與其受體結(jié)合后，可增加微血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂及毛細(xì)血管出芽生長(zhǎng)，誘導(dǎo)新生血管產(chǎn)生，且可降低腫瘤細(xì)胞的同質(zhì)黏附性，上調(diào)BCL-2的表達(dá)，介導(dǎo)癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)[9]。因此RFA治療肝癌后，VEGF蛋白表達(dá)可提示肝癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率的高低。本實(shí)驗(yàn)針道炭化區(qū)及熱凝固區(qū)VEGF術(shù)后即刻達(dá)高峰，1天～2周呈下降趨勢(shì)，術(shù)后2周和3周略有上升，提示RFA后可短期抑制針道炭化區(qū)及熱凝固區(qū)的腫瘤血管生成，但隨著時(shí)間推移腫瘤可恢復(fù)血供；而術(shù)后消融邊界區(qū)的VEGF處于高表達(dá)，可能與RFA后引起局部組織缺氧，誘導(dǎo)VEGF轉(zhuǎn)錄有關(guān)[10]；1周后由針道炭化區(qū)至邊界區(qū)VEGF呈上升趨勢(shì)，可能因RFA范圍有限及熱沉降效應(yīng)，消融邊界區(qū)的溫度較針道區(qū)和壞死凝固區(qū)降低，低溫亦可使VEGF表達(dá)上升，增加腫瘤轉(zhuǎn)移概率。

細(xì)胞凋亡是在體內(nèi)、外一些因素的作用下，觸發(fā)細(xì)胞死亡程序而導(dǎo)致細(xì)胞主動(dòng)死亡的一種方式，是細(xì)胞損傷的結(jié)果。研究[11]表明，F(xiàn)as、Bax及P53等基因可以促進(jìn)凋亡作用，BCL-2和BCL-XL等基因可以抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生。本研究結(jié)果表明，在RFA術(shù)后不同時(shí)間由針道炭化區(qū)至消融邊界區(qū)腫瘤細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較均呈上升趨勢(shì)，針道炭化區(qū)出現(xiàn)大量凝固性壞死，消融邊界區(qū)則以腫瘤細(xì)胞凋亡為主，提示射頻消融中心溫度高，直接殺滅腫瘤細(xì)胞主要為細(xì)胞壞死，向外隨著熱效益衰減，而表現(xiàn)為以凋亡為主；術(shù)后即刻到術(shù)后2周細(xì)胞凋亡率由針道炭化區(qū)、熱凝固區(qū)至消融邊界區(qū)呈上升趨勢(shì)，術(shù)后1天各區(qū)帶處于凋亡高峰，可能與RFA引起的漸進(jìn)性損傷有關(guān)[12]，術(shù)后三個(gè)區(qū)帶均比對(duì)照組凋亡率上升，說(shuō)明RFA可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但術(shù)后第3周消融邊界區(qū)凋亡率接近對(duì)照組，隨著時(shí)間推移，RFA由內(nèi)向外，凋亡率逐漸下降，提示腫瘤細(xì)胞漸進(jìn)性損傷作用隨著時(shí)間推移減退，這也成為腫瘤復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)兔VX2肝移植瘤在RFA后不同區(qū)帶和不同時(shí)間段腫瘤組織的病理學(xué)改變、VEGF表達(dá)和腫瘤細(xì)胞凋亡的分析，發(fā)現(xiàn)RFA后腫瘤組織不同區(qū)帶、不同時(shí)間的損傷情況及變化規(guī)律，可為進(jìn)一步完善肝癌RFA的科學(xué)決策[13]、減少腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、提高RFA效果提供科學(xué)依據(jù)。

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ExpressionofVEGFandapoptosisoftumorcellsindifferentregionsofVX2tumorinrabbitliverafterradiofrequencyablation

LIUYa,LYUWeifu*,ZHUXianhai,SHIChanggao,WANGYaguang,LIUKaicai,CHENGDelei,ZHOUChunze,LUDong

(DepartmentofRadiology,AnhuiProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

ObjectiveTo explore the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and apoptosis of the tumor cells in the different regions of rabbit liver VX2 tumor after radiofrequency ablation (RFA).MethodsForty-eight experimental rabbits were implanted with VX2 tumor. After successfully established the model, the rabbits were randomly divided into control group (n=6) and RFA group (n=42). In the RFA group, 7 rabbits at each time point were killed at immediately, 1 day, 2 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks after RFA, and the tumor specimens were retained and performed with HE staining, VEGF, Annexin V-FITC/PI labeling, flow cytometry analysis. The changes of VEGF and apoptosis of the cells in different periods and different zones after RFA were observed.ResultsAfter the operation, the difference of the VEGF value of the needle zone, coagulation necrotic zone and junction zone had statistically significant (allP<0.05). The difference of the VEGF value in each zone between immediately and the other time points after operation by pairwise comparisons were significantly different (allP<0.05). The VEGF value of the needle zone and coagulation necrotic zone reached the peak after operation immediately, which declined from 1 day to 3 weeks after operative. And VEGF of the junction zone increased from immediately to 1 week after operation, and declined 2 weeks after operation. There were significant differences in the apoptosis rate of the three zones after RFA compared with control group (allP<0.05). The apoptosis rate in all zones were at the peak on the 1 day after operation, and then showed a downward trend.ConclusionThe reduction of VEGF and apoptosis of tumor cells in the needle zone and coagulation necrotic zone are significant, but tumor remnant remains visible in the junction zone. In the third week after RFA, the proliferation of the remaining tumor cells can be recurrent to preoperative levels, which suggests that the further treatment should be performed at this period.

Rabbits; Liver; VX2 tumor; Radiofrequeney ablation; Vascular endothelial growth factor; Apoptosis

國(guó)家衛(wèi)計(jì)委醫(yī)學(xué)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(w2015xr13)、安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(1704a0802152)。

劉亞(1982—)，女，安徽合肥人，在讀碩士。研究方向：介入放射學(xué)。E-mail: xiniuniu0615@126.com

呂維富，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院影像科，230001。E-mail: lwf99@126.com

2017-01-24 [

] 2017-06-01

10.13929/j.1672-8475.201701038

R735.7; R-332

A

1672-8475(2017)09-0561-05