百草枯的全身毒性及特異性耳毒性作用

張建輝丁大連孫虹Richard Salvi

1中南大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

2 Center for Hearing and Deafness,University at Buffalo

3川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

·基礎(chǔ)研究·

百草枯的全身毒性及特異性耳毒性作用

張建輝1，2，3丁大連1，2孫虹1，2Richard Salvi1，2

1中南大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

2 Center for Hearing and Deafness,University at Buffalo

3川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

百草枯是目前全球使用最廣泛的除草劑之一，其對哺乳類生物體的毒性機(jī)制主要是在細(xì)胞內(nèi)通過反復(fù)氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生大量的過氧化物陰離子并引發(fā)脂質(zhì)過氧化、線粒體損傷、DNA損害、蛋白質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等級聯(lián)反應(yīng)造成全身多器官的不可逆性損害。百草枯在急性中毒過程往往在肺泡細(xì)胞首先表現(xiàn)出特殊的高濃度聚集，這可能是因為百草枯與多胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，而肺的Clara細(xì)胞和肺泡I型及II型上皮細(xì)胞具備較強(qiáng)的多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，因此百草枯首先積聚在肺的Clara細(xì)胞和肺泡I型及II型細(xì)胞。百草枯還可穿越血腦屏障并通過多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在多巴胺神經(jīng)元中積累并首先造成多巴胺神經(jīng)元的破壞，因此，百草枯慢性中毒可能與帕金森病的發(fā)病機(jī)制也具有一定的關(guān)系。各種耳毒性藥物和強(qiáng)噪聲以及重金屬和老年性耳聾引起的內(nèi)耳損傷都與氧自由基的損害作用密切相關(guān)，百草枯對細(xì)胞的氧化損傷作用使之成為研究內(nèi)耳自由基損害和抗氧化劑保護(hù)效應(yīng)的理想研究模型之一。百草枯引起的實(shí)驗動物聽覺障礙表現(xiàn)出高頻聽力首先受損的特點(diǎn)，百草枯引起的耳蝸毛細(xì)胞損害則首先發(fā)生在耳蝸底回對應(yīng)高頻聽覺反應(yīng)的區(qū)域。在百草枯引起的受損耳蝸細(xì)胞內(nèi)，過氧化物陰離子首先在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)增強(qiáng)，隨后凝聚到細(xì)胞核內(nèi)，說明耳蝸細(xì)胞的損害確實(shí)是因為細(xì)胞內(nèi)首先發(fā)生的氧化應(yīng)激所引起，而這種自由基損害最終啟動了細(xì)胞的自毀裝置而導(dǎo)致了細(xì)胞的凋亡。我們在最近的實(shí)驗研究中發(fā)現(xiàn)，百草枯對耳蝸細(xì)胞的損害首先是發(fā)生在耳蝸毛細(xì)胞底部和周圍的支持細(xì)胞，由于這些支持細(xì)胞的破壞造成耳蝸Corti器的支持結(jié)構(gòu)塌陷，從而使耳蝸毛細(xì)胞因失去周圍細(xì)胞的連接和支持而發(fā)生排列散亂和位置漂移，這種因失去細(xì)胞之間的聯(lián)系而發(fā)生的毛細(xì)胞“失巢凋亡”可能也是造成毛細(xì)胞破壞的重要機(jī)制之一。因此，百草枯引發(fā)的毛細(xì)胞凋亡不僅與細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的各種自由基損害有關(guān)，而且因喪失與周圍支持細(xì)胞相聯(lián)系的外基質(zhì)而引發(fā)“失巢凋亡”，顯然這是一個值得思考的更重要的可能性損害機(jī)制。

百草枯；耳毒性；氧化應(yīng)激；耳蝸；失巢凋亡

This study was supported by the National Key Basic Research Program of China(973 Program),Grant no.2014CB943003 and National Natural Science Foundation of China(NSFC),Grant no.81170912.

All authors have no conflicts of interest and take responsibility for this article.

1 百草枯的除草功效及毒性機(jī)制

百草枯(Paraquat，PQ)是一種分子式為C12H14C12N2的具有超強(qiáng)氧化還原特性的化學(xué)制劑，歸類于紫羅堿（viologen）類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的氧化還原活性雜環(huán)家族，其化學(xué)名稱是1，1‘-二甲基-4，4’-聯(lián)吡啶。盡管Weidel和Russo于1882年最先合成出PQ，Michaelis和Hill于1933年發(fā)現(xiàn)PQ的氧化還原屬性并將其稱之為化合物甲基紫精（compound methyl viologen），但是PQ的除草性能直到1955年才被Brian等確認(rèn)[1]。由于PQ具有除草起效快和非選擇性除草以及在土壤中能被迅速降解等優(yōu)點(diǎn)，PQ于1962年開始被引入農(nóng)業(yè)領(lǐng)域并在130多個國家成為最廣泛使用的除草劑而沿用至今[2]。在PQ投入農(nóng)業(yè)領(lǐng)域不久，于1964年在愛爾蘭發(fā)生了第一例PQ中毒的病例，隨后世界各地相繼報道了許多不同數(shù)量和程度的PQ中毒事件[3]，其中大多以服用PQ的自殺案例為主。PQ中毒引起的死亡率相關(guān)報道約在43-90%[4-5]。值得注意的是，我國PQ中毒案例在近20年呈明顯的增長趨勢[6]。PQ的高效除草機(jī)制已經(jīng)被確定是由于PQ干擾植物細(xì)胞內(nèi)電子轉(zhuǎn)移光系統(tǒng)，通過抑制氧化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP β）轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），使之還原成PQ單陽離子自由基（PQ α）而引發(fā)一系列氧化還原反應(yīng)，造成大量活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的過氧化物陰離子（Peroxide anions）、單線態(tài)氧（Singlet oxy?gen）、羥基（Hydroxyl）和過氧自由基（Peroxy radi?cals）形成，最終使植物細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化而導(dǎo)致植物死亡[7]。PQ進(jìn)入到哺乳動物細(xì)胞之后，同樣是伴隨著細(xì)胞內(nèi)的氧化還原循環(huán)并在細(xì)胞內(nèi)反復(fù)被還原和再氧化導(dǎo)致組織的氧化損傷。PQ在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）—細(xì)胞色素P450還原酶、黃嘌呤氧化酶（XO）、線粒體電子轉(zhuǎn)移酶和一氧化氮合酶(NOS)的綜合作用下，被還原為聯(lián)吡啶陽離子PQ?+和NADP+或者NAD+。PQ?+快速與細(xì)胞內(nèi)分子氧發(fā)生的反應(yīng)使之產(chǎn)生出大量的過氧化物陰離子。進(jìn)一步生成的不成對自由基團(tuán)可導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)及多糖高分子的破壞而引起細(xì)胞內(nèi)的鈣含量增加，這種鈣超載可進(jìn)一步激發(fā)鈣激活蛋白酶的活動而造成細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p害[8-9]。PQ產(chǎn)生的過量ROS作為激活或調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要第二信使，其造成的細(xì)胞膜損害和線粒體損害勢必激發(fā)各自相應(yīng)的Caspase-8和Caspase-9，因此而啟動其下游的Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[10]。顯然，PQ過度消耗NADPH的后果必然是造成NADPH/NADP比值的降低，雖然戊糖途徑也可以代償性產(chǎn)生NADPH，但恐怕難以完全代償PQ誘發(fā)的氧化應(yīng)激損害而引起的NADPH大量消耗，還有可能為PQ的氧化還原循環(huán)提供更多的NADPH并由此反而促成了更多的ROS生成。如此惡性循環(huán)必將造成NADPH的缺乏而削弱細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)，使細(xì)胞最終難以抵擋過量自由基的損害[11]。

2 百草枯中毒途徑及選擇性集聚

造成PQ急性中毒的途徑主要是通過消化道吸收的自殺案例或誤食案例，亦有通過皮膚途徑或呼吸道途徑的PQ中毒的案例報道。百草枯進(jìn)入機(jī)體后廣泛分布到全身各個器官系統(tǒng)，但PQ集聚濃度最高的器官是肺和腎臟，PQ半衰期最長的器官是腦神經(jīng)系統(tǒng)[11]。PQ進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑是通過堿性或中性氨基酸和多胺運(yùn)輸系統(tǒng)或通過膽堿攝取系統(tǒng)，而PQ從細(xì)胞的流出則主要是通過P-糖蛋白的介導(dǎo)完成[12]。PQ之所以在腎臟形成高濃度集聚，其原因可能是因為腎臟是體內(nèi)PQ被清除的主要途徑，而PQ在肺形成高濃度集聚的原因卻可能主要是因為PQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)與多胺十分相似，而肺的某些特殊細(xì)胞內(nèi)所富含的多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有可能將PQ誤認(rèn)為是多胺底物而將其轉(zhuǎn)運(yùn)到富含多胺的靶細(xì)胞內(nèi)。例如位于支氣管的Clara細(xì)胞和位于肺泡內(nèi)的I型和II型上皮細(xì)胞中因其存在積極的多胺轉(zhuǎn)運(yùn)而成為PQ破壞的主要靶目標(biāo)[11]。PQ同樣在腦神經(jīng)系統(tǒng)也形成高濃度集聚，這可能是因為PQ的結(jié)構(gòu)與1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)十分相似而容易穿越血腦屏障進(jìn)入到顱內(nèi)，而MPP+卻正是一種帕金森癥的誘導(dǎo)毒素[13]。由于PQ進(jìn)入顱內(nèi)后在顱內(nèi)的半衰期竟然可達(dá)28天之久，因此PQ慢性中毒成為誘發(fā)帕金森癥的高風(fēng)險因素之一[14]。盡管天然的正二價PQ并不是多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體作用的底物，但是當(dāng)PQ在小膠質(zhì)細(xì)胞通過還原劑或NADPH氧化酶轉(zhuǎn)換成單價的PQ陽離子時，則可被多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)并積累在多巴胺神經(jīng)元，其誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激則進(jìn)一步造成了多巴胺神經(jīng)元的破壞[15]。目前PQ在不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)及分布尚不清楚，是否在不同的細(xì)胞存在不同的選擇性集聚，是一個值得繼續(xù)研究的課題。

3 百草枯是研究內(nèi)耳自由基損害的理想實(shí)驗?zāi)Ｐ?/h2>

雖然PQ的毒理機(jī)制已經(jīng)被認(rèn)定是首先激發(fā)了細(xì)胞內(nèi)過量的自由基鏈反應(yīng)而導(dǎo)致機(jī)體的損害，然而，其確切機(jī)制和伴隨的其它病理改變機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。目前，PQ活體動物實(shí)驗?zāi)Ｐ鸵言诖笫?、小鼠、豚鼠、狗、豬、羊、斑馬魚、果蠅、線蟲等成功建立[16]；在離體培養(yǎng)實(shí)驗系統(tǒng)，肺組織、肝組織、腎組織及神經(jīng)組織來源的多種細(xì)胞株也被廣泛用于研究PQ引起的自由基損害表現(xiàn)和機(jī)制[12]。PQ中毒十分兇險，挽救生命是唯一的PQ中毒搶救策略。由于服用PQ的自殺案例具有極高的死亡率，而PQ中毒引起的聽覺損害雖然影響生活質(zhì)量但并不足以致命，因此PQ中毒對聽覺系統(tǒng)的損害作用并未引起人們的足夠重視，也許正是由于上述原因，有關(guān)PQ中毒損害聽覺的案例也鮮有報道。然而在聽覺研究領(lǐng)域，無論是爆震或噪聲引起的耳聾還是藥物中毒引起的耳聾[17-27]，無論是重金屬中毒引起的耳聾還是老年性耳聾[28-33]，在各種感音神經(jīng)性聾的發(fā)病期間都伴隨著內(nèi)耳的過氧化損害，因此研究氧自由基對內(nèi)耳的損害作用對于研究各種感音神經(jīng)性聾的病變過程和病理機(jī)制都具有重要的意義。鑒于PQ對哺乳類細(xì)胞的損害作用主要是因其進(jìn)入細(xì)胞后所產(chǎn)生的大量過氧化物陰離子而引起細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化失衡并由此而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[34]，因此，PQ成為制備內(nèi)耳自由基損害和驗證新型抗氧化劑能否有效保護(hù)內(nèi)耳的最理想實(shí)驗研究模型之一[35-37]。

4 PQ對耳蝸聽覺系統(tǒng)的損害模式

我們先前在南美栗鼠活體動物實(shí)驗和離體培養(yǎng)大鼠耳蝸組織的實(shí)驗研究中發(fā)現(xiàn)，PQ引起的南美栗鼠的聽功能損害是從高頻聽覺障礙開始逐漸向低頻聽覺障礙發(fā)展，而PQ引起的耳蝸毛細(xì)胞損害則是從耳蝸底回開始逐漸向耳蝸頂回擴(kuò)展，這種高頻聽力首先受損的模式與耳蝸底回感受高頻聲音刺激的毛細(xì)胞首先被破壞的病理檢查結(jié)果完全吻合。實(shí)驗結(jié)果顯示PQ的耳毒性作用呈明顯的劑量依賴性，即PQ的應(yīng)用劑量越大，聽覺功能損害的程度越明顯，耳蝸毛細(xì)胞破壞的范圍和程度也越嚴(yán)重[36]。在大鼠耳蝸器官離體培養(yǎng)系統(tǒng)，PQ引起的耳蝸毛細(xì)胞損害模式同樣表現(xiàn)出外毛細(xì)胞的損害比內(nèi)毛細(xì)胞損害嚴(yán)重，耳蝸底回毛細(xì)胞的損害比耳蝸頂回的毛細(xì)胞損害嚴(yán)重的模式[34-35,37]，這種大鼠毛細(xì)胞損害模式不僅與南美栗鼠PQ耳中毒活體動物實(shí)驗結(jié)果完全一致，而且與許多其它耳毒性化學(xué)制劑如氨基糖苷類抗生素或重金屬等對耳蝸毛細(xì)胞的損害模式都非常相似[17-19,22-29]。然而我們在最近的小鼠耳蝸器官培養(yǎng)實(shí)驗研究中卻發(fā)現(xiàn)，出生后三天小鼠幼崽的耳蝸頂回毛細(xì)胞比耳蝸底回毛細(xì)胞更容易遭到PQ的損害[38]，這種不同于南美栗鼠和大鼠的耳蝸病變模式是否意味著處于內(nèi)耳發(fā)育階段早期的小鼠耳蝸頂回的毛細(xì)胞尚缺乏相應(yīng)的有效抗氧化防御體系？尚有待進(jìn)一步的研究。

5 PQ對耳蝸聽覺系統(tǒng)的損害機(jī)制

如同PQ破壞機(jī)體其它各種器官的損害機(jī)制一樣，PQ同樣以這種特殊的自由基損害方式造成內(nèi)耳聽覺毛細(xì)胞的破壞。即PQ進(jìn)入細(xì)胞后，被NADPH氧化酶催化首先形成大量的過氧化物陰離子而造成感覺毛細(xì)胞的氧化應(yīng)激損害。我們在實(shí)驗中應(yīng)用dihydroethidium標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，PQ之所以導(dǎo)致毛細(xì)胞的死亡，確實(shí)是因為PQ在毛細(xì)胞中激發(fā)出大量的過氧化物陰離子[34-35,37]，類似的情況經(jīng)dihydroethidium標(biāo)記技術(shù)證實(shí)也同樣發(fā)生在慶大霉素或甲氟喹引起的耳蝸早期損害[17,20-21]。自由基的種類繁多，可分為活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive ni?trogen species,RNS）兩大類，前者包括過氧化物陰離子（?O2–）、羥基自由基（?OH–）及過氧化氫（H2O2）等，后者則包括一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）及過氧亞硝基陰離子（?ONOO–）。PQ在機(jī)體內(nèi)被還原成單價PQ陽離子之后所產(chǎn)生的過氧化物陰離子，其本身只不過是自由基反應(yīng)鏈上出現(xiàn)的第一個而且也是毒性作用最輕的一種活性氧自由基，然而過氧化物陰離子并不能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地保持其原形，而是在過氧化物歧化酶的催化作用下瞬間被轉(zhuǎn)化成過氧化氫，過氧化氫被認(rèn)為是自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)上的第二個自由基并具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，過剩的過氧化物陰離子還可與鐵離子或銅離子結(jié)合轉(zhuǎn)化成為殺傷力最強(qiáng)的羥基自由基，羥基自由基通過與核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)發(fā)生的非特異性反應(yīng)而造成組織細(xì)胞的嚴(yán)重破壞[39]。另外，過氧化物陰離子還可與一氧化氮直接反應(yīng)形成致命的過氧亞硝基陰離子。誠然，機(jī)體內(nèi)存在著與上述自由基相對應(yīng)的一系列抗氧化酶類，然而，當(dāng)抗氧化劑A與自由基A起反應(yīng)獲得或失去一個不成對電子時，原先的抗氧化劑A因攜帶了新的不成對電子、分子或原子團(tuán)反而使其本身變成了新的自由基B，隨后下一個抗氧化劑B奪取自由基B的不成對電子后又使其自身變成了自由基C，如此傳遞的“丟手絹”游戲式的自由基傳遞鏈?zhǔn)椒磻?yīng)因此而產(chǎn)生出一系列毒性更強(qiáng)的自由基并對機(jī)體造成更大的傷害。由此可見，PQ引起細(xì)胞損害的機(jī)制實(shí)際上并不單純是PQ激發(fā)過量的過氧化物陰離子的問題，更為合理的理解應(yīng)該是自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所產(chǎn)生的一系列有害自由基共同實(shí)現(xiàn)破壞機(jī)體的總和。大量醫(yī)學(xué)實(shí)驗證實(shí)，所有氧化應(yīng)激的反應(yīng)產(chǎn)物最終都可激發(fā)細(xì)胞啟動其凋亡程序，自由基損害的結(jié)局已經(jīng)被充分確認(rèn)就是引發(fā)啟動了細(xì)胞的自毀凋亡程序[21,34,35,37-41]。

6 過氧化物歧化酶拮抗PQ對耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)作用

鑒于過氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）是一種專門催化過氧化物陰離子通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧和過氧化氫的抗氧化酶，而PQ的主要毒性機(jī)制正是因為激發(fā)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生出過量的過氧化物陰離子，因此應(yīng)用SOD類似物的抗氧化效應(yīng)理應(yīng)是防治過氧化物陰離子損傷的有效措施之一。我們在以往的實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用低濃度SOD的類似物M40403可以有效減輕了PQ引起的耳蝸毛細(xì)胞損害，然而如果給予高濃度的M40403，則反而造成耳蝸毛細(xì)胞的損害加重。我們還發(fā)現(xiàn)，高濃度的M40403甚至對正常耳蝸毛細(xì)胞也可造成嚴(yán)重的損害。由此可見，單純的過度抗氧化更為危險，因為過度抗氧化的后果必然是加重了細(xì)胞內(nèi)的氧化/抗氧化失衡使機(jī)體遭到更大的傷害[34,35,37,40]。從氧自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)式不難看出，過氧化物陰離子被SOD催化所產(chǎn)生的下一個反應(yīng)產(chǎn)物是比過氧化物陰離子毒性更強(qiáng)的過氧化氫。盡管機(jī)體內(nèi)存在的過氧化氫酶可以有效催化一定量的過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧，但是一旦使用過量的SOD類似物而造成了過多的過氧化氫形成，本來在機(jī)體內(nèi)處于與過氧化氫之間平衡狀態(tài)的過氧化氫酶將不足以催化或降解突然增加的大量過氧化氫，機(jī)體必將因此而受到那些過量過氧化氫的嚴(yán)重?fù)p害。同時，過剩的過氧化物陰離子與金屬離子結(jié)合后轉(zhuǎn)化成為最具毒性的羥基自由基，而羥基自由基對細(xì)胞顯然更具致命的殺傷力。顯而易見，任何傳統(tǒng)的單一抗氧化劑都不可能解決氧自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所產(chǎn)生的一系列氧自由基對機(jī)體造成的損害問題，而應(yīng)用多功能抗氧化劑控制氧化與抗氧化之間的動態(tài)平衡和應(yīng)用氫氣選擇性清除細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的最有害的羥基自由基，可能為抗氧化治療提供了更有希望的研究和應(yīng)用前景[23,40-42]。

7 PQ對耳蝸細(xì)胞的損害模式

我們在最近的研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PQ可以首先特異性引起耳蝸基底膜上支持細(xì)胞的破壞，這種支持細(xì)胞的破壞造成了耳蝸Corti器立體結(jié)構(gòu)的坍塌，從而造成毛細(xì)胞的位置發(fā)生了漂移（圖1）。值得特別注意的是，耳蝸毛細(xì)胞的破壞實(shí)際上是發(fā)生在Corti器的支持細(xì)胞和支持結(jié)構(gòu)被主要破壞之后（圖2）。由此可見，耳蝸基底膜上的Deiters細(xì)胞和內(nèi)側(cè)螺旋溝的邊緣細(xì)胞等可能是PQ攻擊的首要靶目標(biāo)，而隨后發(fā)生的毛細(xì)胞破壞很可能只不過是一種繼發(fā)于這些維持Corti器完整結(jié)構(gòu)的支持細(xì)胞被破壞之后的最終病變結(jié)果。試想當(dāng)Deiters細(xì)胞被破壞之后，間隔外毛細(xì)胞表皮板的Deiters細(xì)胞表皮板隨即消失，外毛細(xì)胞的表皮板一旦失去在其周圍形成網(wǎng)狀膜的Deiters細(xì)胞的指狀凸表皮板的連接和支持，網(wǎng)狀膜即不復(fù)存在，外毛細(xì)胞的游離漂散現(xiàn)象也就不難理解了。應(yīng)用dihydroethidium標(biāo)記技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在PQ的作用下，耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)的過氧化物陰離子在用藥后6小時首先在毛細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)增強(qiáng)，在用藥后12小時過氧化物陰離子集聚在毛細(xì)胞的細(xì)胞核，在用藥后24小時才出現(xiàn)大量的毛細(xì)胞缺損。但是，在用藥后6小時，過氧化物陰離子就已經(jīng)出現(xiàn)在那些發(fā)生明顯核固縮的耳蝸支持細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)（圖3）。如前所述，自由基損害激發(fā)細(xì)胞凋亡的規(guī)律已經(jīng)被大量實(shí)驗研究報道所證實(shí)。我們在最近的實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，位于內(nèi)外毛細(xì)胞下方的耳蝸支持細(xì)胞在暴露PQ后6小時和12小時均出現(xiàn)Caspase-8和Caspase-9以及Cas?pase-3的陽性表達(dá)，但毛細(xì)胞中出現(xiàn)的上述三個Caspase的活動卻主要發(fā)生在暴露PQ后24小時（圖4）。由此可見，PQ引起的耳蝸支持細(xì)胞的自由基損害和凋亡均早于毛細(xì)胞的損害。鑒于Caspase-8的啟動取決于細(xì)胞膜上的包括腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）和Fas在內(nèi)的細(xì)胞死亡因子受體，而Caspase-9的啟動則取決于因線粒體膜破裂而釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C（cytochrome C），因此Caspase-8和Caspase-9在耳蝸支持細(xì)胞內(nèi)的早期同時出現(xiàn)說明PQ激發(fā)的自由基損害同時刺激了細(xì)胞膜上的細(xì)胞死亡因子受體并造成線粒體膜的破裂，前者可視為凋亡信號的釋放是來自細(xì)胞膜[18-19,23]，而后者的凋亡信號釋放則是來自細(xì)胞內(nèi)的線粒體[17,20,44]。實(shí)驗研究證實(shí)，PQ確實(shí)可以特異性破壞受損細(xì)胞的線粒體而造成細(xì)胞色素C的釋放[45]。Caspase-3是位于Caspase-8和Caspase-9下游的死亡執(zhí)行者（excutioner），可被上述兩種細(xì)胞凋亡啟動子Caspase-8和Caspase-9激活，因此，PQ引起的Caspase-3活動是起源于細(xì)胞膜損害和線粒體損害兩條通路。如同甲氟喹引起的毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡一樣，PQ激發(fā)的自由基損害所啟動的凋亡信號釋放也是雙管齊下，同時損害了細(xì)胞表面的膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)的能量工廠—線粒體[21,46,47]。

圖1 應(yīng)用Phalloidin標(biāo)記F-actin以顯示耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛和表皮板結(jié)構(gòu)。圖1A顯示耳蝸毛細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液（不含PQ）中培養(yǎng)24小時保持著內(nèi)外毛細(xì)胞的整齊排列。圖1B顯示經(jīng)50μM PQ培養(yǎng)24小時后，耳蝸外毛細(xì)胞的位置因支持結(jié)構(gòu)的破壞而發(fā)生移位。Fig.1 Photomicrographs showing F-actin expression on the stereocilia and cuticular plate of cochlear hair cells labeled with TRITC-conjugated phalloidin.(A)Note the orderly arrangement of three rows of outer hair cells(OHC)and single row of inner hair cells(IHC)in control culture medium without paraquat for 24 h.(B)Note the dislocation and irregular arrangement of OHC and IHC due to loss of the surrounding support cells 24 h after 50μM paraquat(PQ)treatment.

圖2 應(yīng)用Phalloidin和Topro-3雙重染色技術(shù)分別標(biāo)記毛細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)（紅色熒光產(chǎn)物）和細(xì)胞核（綠色熒光產(chǎn)物）。圖2A顯示經(jīng)不含PQ孵育液培養(yǎng)24小時的耳蝸Corti器，耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞均保持良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)。圖2B顯示經(jīng)200μM PQ培養(yǎng)12小時的耳蝸Corti器，耳蝸毛細(xì)胞保持著正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但外毛細(xì)胞下方的支持細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞核濃縮，提示耳蝸支持細(xì)胞首先表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的病理學(xué)改變特征。圖2C顯示經(jīng)200μM PQ培養(yǎng)24小時的耳蝸Corti器，此時耳蝸支持細(xì)胞的細(xì)胞體已經(jīng)消失，殘存外毛細(xì)胞不僅發(fā)生移位，而且外毛細(xì)胞的細(xì)胞核均發(fā)生明顯的的細(xì)胞核濃縮或細(xì)胞核破裂。Fig.2 Z-plane confocal photomicrographs of the organ of Corti showing the surface structure(red fluorescently labeled phalloidin that binds to actin)and the nucleus(TOPRO-3, green fluorescence)of hair cells and supporting cells.(A) Control sample from control cochlea cultured for 24 h without paraquat.Nuclei of OHC and Deiters cells are relatively close together.(B)Pathological changes in the organ of Corti 12 h after 200μM paraquat treatment.Note shrinkage,condensation and fragmentation of supporting cell nuclei beneath OHC that have normal nuclei.Apoptotic nuclei were first observed in supporting cells prior to OHC damage.(C)Pathological changes in the organ of Corti 24 h after 200μM paraquat treatment.At this time,the cochlear supporting cells beneath OHC have completely disappeared,and the remaining OHC with condensed nuclei were displaced.

圖3 應(yīng)用dihydroethidium標(biāo)記技術(shù)顯示細(xì)胞內(nèi)的過氧化物陰離子并對耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞中dihydroethidium的熒光灰度值進(jìn)行半定量分析。在未經(jīng)PQ培養(yǎng)的耳蝸正常Corti器，毛細(xì)胞內(nèi)和支持細(xì)胞內(nèi)的dihydroethidium表達(dá)處于較低水平狀態(tài)；經(jīng)200μMPQ培養(yǎng)6小時及12小時，毛細(xì)胞內(nèi)和支持細(xì)胞內(nèi)的dihydroethidium標(biāo)記均呈持續(xù)升高的態(tài)勢，但支持細(xì)胞內(nèi)的dihydroethidium標(biāo)記顯著高于毛細(xì)胞內(nèi)的dihydroethidium標(biāo)記；經(jīng)200μMPQ培養(yǎng)24小時，毛細(xì)胞內(nèi)的dihydroethidium標(biāo)記水平仍然持續(xù)增高，但支持細(xì)胞內(nèi)的dihydroethidium標(biāo)記在培養(yǎng)24小時后，由于大量支持細(xì)胞的死亡消失，殘存支持細(xì)胞內(nèi)的dihydroethidium的表達(dá)出現(xiàn)明顯的減弱。Fig.3 Histogram showing semi-quantitative level of superoxide levels in cochlear hair cells and supporting cells;measurements reflect fluorescent gray level values of the dihydroethidium.Low gray level values of superoxide in hair cells and support cells in normal control cochlear explants.Superoxide levels in cochlear hair cells and supporting cells increased from 6 h to 12 h after 200 μM paraquat(PQ)treatment;superoxide levels in supporting cells were significantly higher than in hair cells at this time.After 24 h treatment with 200μM paraquat,superoxide levels in supporting cells decreased likely due to loss of supporting cells whereas they continue to increase in hair cells.

圖4 應(yīng)用Phalloidin（綠色）和Topro-3（藍(lán)色）及Caspase-3（紅色）三重染色分別標(biāo)記毛細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）及細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的活化Caspase-3（紅色）。圖4A顯示經(jīng)不含PQ孵育液培養(yǎng)24小時的耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞內(nèi)均未見Caspase-3的活動。圖4B顯示經(jīng)200μM PQ培養(yǎng)12小時的耳蝸支持細(xì)胞首先出現(xiàn)Caspase-3的活動并伴有支持細(xì)胞的細(xì)胞核濃縮，但耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)未見明顯病理學(xué)改變也未見Caspase-3的活動。圖4C顯示經(jīng)200μM PQ培養(yǎng)24小時的耳蝸支持細(xì)胞基本上破壞殆盡，殘存毛細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)Caspase-3的活動并伴有細(xì)胞核的濃縮（黃色箭頭顯示活化的Caspase-3紅色信號）。Fig.4 Z-plane confocal photomicrographs of the organ of Corti triple labeled with fluorescently conjugated phalloidin (green)to label the apical pole of the hair cells,TOPRO-3 to label nuclei(blue)and fluorogenic caspase-3(red).(A)Caspase-3 was absent from cochlear outer hair cells(OHC),inner hair cells(IHC)and supporting cells in control cochlear explants cultured for 24 h.(B)Caspase-3 only present in cochlear supporting cells with a typical apoptotic feature of nuclear condensation 12 h after 200μM paraquat(PQ)treatment. Caspase-3 was absent from hair cells at 12 h post-treatment. (C)After 24 h treatment with 200μM PQ,caspase-3 was heavily expressed in the OHC and IHC region,but largely absent from the supporting cells beneath the OHC;absence of blue nuclei below the OHC due destruction and loss of supporting cells.

8 PQ特異性損害耳蝸支持細(xì)胞和毛細(xì)胞的另一種可能性機(jī)制

雖然PQ中毒可造成生物體許多組織細(xì)胞的損害，但是不同的細(xì)胞對PQ的敏感性并不相同。以PQ引起的肺損害為例，PQ主要集聚在肺泡的I型細(xì)胞、II型細(xì)胞和Clara細(xì)胞并首先破壞這三種類型的細(xì)胞，PQ選擇性集聚在肺泡內(nèi)這三種細(xì)胞的原因被認(rèn)為與這三類細(xì)胞富含多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有關(guān)[48]。我們的實(shí)驗結(jié)果證實(shí)，PQ對耳蝸基底膜上的支持細(xì)胞也有著特殊的攻擊傾向，這是否意味著耳蝸支持細(xì)胞的多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也與肺泡內(nèi)的I型細(xì)胞和II型細(xì)胞以及Clara細(xì)胞相似？尚有待進(jìn)一步的研究。耳蝸基底膜上支持細(xì)胞的破壞導(dǎo)致了Corti器支持結(jié)構(gòu)的崩解，耳蝸毛細(xì)胞一旦失去周圍細(xì)胞的連接和支持，必然造成耳蝸毛細(xì)胞的位置改變。細(xì)胞凋亡的類型中有一種因失去細(xì)胞之間連接而發(fā)生的特殊程序化死亡模式，被稱之為“失巢凋亡”。失巢凋亡的英文名稱是Anoikis，這個希臘名詞的意思是“無家可歸”，Anoikis在生物學(xué)的使用是專指因失去細(xì)胞-基質(zhì)相互作用（cell-matrix interactions）而引起的細(xì)胞凋亡模式。正常生長的細(xì)胞與相鄰周圍細(xì)胞通過外基質(zhì)（surrounding ex?tracellular matrix）相聯(lián)系，外基質(zhì)是由多糖和膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白和蛋白聚糖共同組成的細(xì)胞之間的一種網(wǎng)架狀結(jié)構(gòu)，其重要功能除了支持、連接、保護(hù)和包裹細(xì)胞之外，還是傳遞細(xì)胞信息和調(diào)節(jié)細(xì)胞功能以及維持細(xì)胞生長的必要生存條件。一旦細(xì)胞與周圍細(xì)胞失去聯(lián)系，則立刻因喪失細(xì)胞-基質(zhì)之間的正常相互作用而發(fā)生所謂的“厭食”性“自殺”行為[49-50]。我們在PQ耳毒性實(shí)驗中見到的繼支持細(xì)胞死亡和Corti器結(jié)構(gòu)解體之后發(fā)生的毛細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，看起來也完全符合Anoi? kis的發(fā)生條件，而且與細(xì)胞膜緊密相連的外基質(zhì)一旦遭到破壞，細(xì)胞膜的損傷則不可避免，這與我們發(fā)現(xiàn)的PQ早期啟動因細(xì)胞膜損害而激發(fā)的Cas?pase-8啟動凋亡信號釋放的情況相吻合。因此我們認(rèn)為PQ引起的耳蝸毛細(xì)胞凋亡除了因為產(chǎn)生過量的過氧化物陰離子引發(fā)一系列有害自由基對毛細(xì)胞的破壞而啟動毛細(xì)胞的“自毀裝置”之外，毛細(xì)胞與周圍支持細(xì)胞之間發(fā)生的細(xì)胞-基質(zhì)相互作用喪失可能是另一個更為致命的病變機(jī)制。

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Systemic Toxicity and Specific Ototoxicity of Paraquat

ZHANG Jianhui1，2，3,DING Dalian1，2,SUN Hong1，2,Richard Salvi1，2
1 Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,Xiangya Hospital,Central South University
2 Center for Hearing and Deafness,University at Buffalo
3 Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College

DING Dalian Email:dding@buffalo.edu

Paraquat(PQ),one of the most widely used herbicides in the world,is believe to exert its toxic effects on mammalian organisms by generating a large amount of superoxides via redox reactions which in turn cause lipid peroxidation,mitochondrial degeneration,DNAdamage and protein degradation.In the acute poisoning process,PQ initially accumulates in alveolar cells in the lungs presumably because the chemical structure of PQ is similar to polyamine. Clara cells and alveolar type I and II epithelial cells in the lungs contain very strong polyamine transport systems.PQ can also cross the blood-brain barrier and accumulate in dopaminergic neurons by uptake through dopamine transporters making,dopaminergic neurons highly susceptible to PQ neurotoxicity.Consequently,chronic PQ poisoning has beenimplicated in the pathogenesis of Parkinson's disease.PQ has also been shown to damage sensory hair cells in the cochlea.The damage is thought to be mediated by increased production of superoxide anions and oxidative stress.Local application of PQ induces a stereotypic pattern of damage which begins at the base of the cochlea and progresses toward the apex,consistent with early high-frequency hearing loss that expands to low frequencies.In PQ damaged cochlear cells,superoxide anions detected by dihydroethidium first appear in the cytoplasm and later condense in the nucleus, suggesting that the damage to cochlear cells is indeed due to the occurrence of superoxide.The free radical damage eventually initiates the cell's self-destruction leading to apoptosis.In contrast to earlier reports,our recent experimental studies indicate that PQ-induced cochlear cell damage first occurs in supporting cells.The destruction of these support cells results in the collapse of support structures of the organ of Corti such that cochlear hair cells become detached and rearranged within the sensory epithelium.Anoikis is a form of programmed cell death that is induced by anchorage-dependent cells becoming detached from the surrounding extracellular matrix.The loss of surrounding cells connections induces anoikis.Our new results suggest that the PQ induced damage to hair cells is initiated by anoikis caused by PQ induced damage of supporting cells which releases hair cells from the extracellular matrix.Thus,PQ-induced apoptotic damage to cochlear cells may be induced not only by superoxide induced oxidative stress,but also by“anoikis”due to loss of extracellular matrix linking with surrounding supporting cells.

Paraquat;Ototoxicity;Oxidative Stress;Cochlea;Anoikis

R764

A

1672-2922（2017）04-481-8

2017-04-28審核人：翟所強(qiáng)）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.04.019

“973”國家重大科學(xué)研究計劃項目（2014CB943003）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81170912）

張建輝，博士，副教授，研究方向：內(nèi)耳科學(xué)

丁大連Email:dding@buffalo.edu