利用酵母單雜交研究AtbHLH112上游調(diào)控基因

劉羽佳，孫劍明

哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

利用酵母單雜交研究AtbHLH112上游調(diào)控基因

劉羽佳，孫劍明

哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型轉(zhuǎn)錄因子家族，在真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆過(guò)程中起重要的調(diào)控作用[1]。擬南芥中共有bHLH基因家族成員162個(gè)，分別在花器官發(fā)生、光信號(hào)途徑、激素應(yīng)答和植物次生代謝等過(guò)程中扮演了重要的角色。Jiang等發(fā)現(xiàn)擬南芥bHLH92基因的過(guò)表達(dá)，能夠有效地提高植物的抗逆脅迫能力[2]。Liu等將擬南芥AtbHLH112轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)能夠有效的提高植物對(duì)逆境脅迫的耐受性，從而在非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。我們已從擬南芥bHLH家族中鑒定了一條具有抗旱、耐鹽的AtbHLH112轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)篩選AtbHLH112啟動(dòng)子中抗逆順式作用元件W-box的結(jié)合蛋白，可為深入研究Atb?HLH112上游調(diào)控基因表達(dá)和分子調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。

酵母單雜交技術(shù)是鑒定體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)識(shí)別互作的經(jīng)典方法，能夠有效地分離與特異DNA序列識(shí)別結(jié)合的蛋白質(zhì)，同時(shí)獲得互作基因[4]。本研究利用酵母單雜交系統(tǒng)構(gòu)建了AtWRKYs基因cDNA文庫(kù)，篩選獲得了與AtbHLH112轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子中W-box元件特異性識(shí)別互作的WRKY蛋白，為進(jìn)一步研究Atb?HLH112上游表達(dá)調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母單雜交試劑盒、酵母菌株（Y187）、酵母高純度質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、質(zhì)粒載體（pHIS2、pGADT7-Rec2）均購(gòu)自日本TaKa?Ra公司；大腸桿菌快速質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒和大腸桿菌感受態(tài)（E.coli DH5α）均購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；引物合成、DNA序列合成和測(cè)序均委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 AtbHLH112基因啟動(dòng)子序列順式作用元件的預(yù)測(cè)

通過(guò)PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）數(shù)據(jù)庫(kù)和PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant?care/html/）對(duì)AtbHLH112基因起始密碼子ATG上游623bp啟動(dòng)子序列（去除5’UTR區(qū)域）進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)。

1.3 報(bào)告載體的構(gòu)建

1.3.1 寡聚核苷酸鏈的合成

分別將三次串聯(lián)的W-box（CTCAA）核苷酸片段（cW-box）、突變W-box（ACACC）核苷酸片段（mW-box）、包含W-box的139 bp啟動(dòng)子片段（sW-box）和缺失W-box的90 bp啟動(dòng)子片段（dW-box）的兩端引入pHIS2報(bào)告載體相對(duì)應(yīng)的EcoRI和Sac I酶切位點(diǎn)；將合成的正反兩條寡聚核苷酸鏈復(fù)性為雙鏈DNA片段；pHIS2質(zhì)粒分別用EcoRI和Sac I雙酶切，酶切完全后純化回收。

1.3.2 重組載體的構(gòu)建

分別將復(fù)性的雙鏈寡聚核苷酸片段和pHIS2線性載體用T4 DNA連接酶催化連接；電激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于LB固體培養(yǎng)基（50 mg/L Kan），37℃倒置培養(yǎng)14～18 h。隨機(jī)挑取幾個(gè)單克隆菌斑作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并挑選2-3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)所構(gòu)建的重組報(bào)告載體的正確性。

1.4 AtWRKYs基因cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

圖1 報(bào)告載體菌液PCR檢測(cè)

在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR內(nèi)查找能夠識(shí)別W-box元件的12個(gè)AtWRKYs同源基因（WRKY2、3、4、9、14、20、26、33、40、58、66、71）用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。根據(jù)效應(yīng)載體pGADT7-Rec2和At?WRKYs同源基因的融合特性，在AtWRKYs的兩端分別引入SmaI酶切位點(diǎn)。以擬南芥cDNA為模板，利用PCR分別擴(kuò)增出帶有At?WRKYs目的片段，純化回收后即形成AtWRKYs的cDNA文庫(kù)。

1.5 利用酵母單雜交篩選AtWRKYs基因cDNA文庫(kù)

將AtWRKYs基因cDNA文庫(kù)、SmaI單酶切的pGADT7-Rec2線性載體和pHIS2-cW-box共轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的酵母重懸菌液分別涂布于TDO/3-AT篩選培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)3-5 d。挑取幾個(gè)不同轉(zhuǎn)化的單克隆酵母菌斑接種于TDO液體培養(yǎng)基（50 mg/L Kan）中，30℃震蕩培養(yǎng)12h后，提取酵母質(zhì)粒。

分別以轉(zhuǎn)化酵母質(zhì)粒作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，能擴(kuò)增出與AtWRKYs同源基因大小一致的特異片段即為互作的上游調(diào)控基因；電激法將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)篩選出的單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)并測(cè)序，對(duì)測(cè)序正確的樣品抽提質(zhì)粒。

1.6 利用酵母單雜交驗(yàn)證W-box元件與AtWRKYs基因的互作

分別將pHIS2-mW-box、pHIS2-sW-box、pHIS2-dW-box與pGADT7-Rec2-WRKYs共轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)挑取幾個(gè)不同轉(zhuǎn)化的單克隆酵母菌斑接種于DDO液體培養(yǎng)基（50 mg/ L Kan）中，30℃震蕩培養(yǎng)12h后；再分別取2 μL稀釋10、100、1000、10000倍的菌液點(diǎn)于TDO/3-AT的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，30℃倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察轉(zhuǎn)化酵母的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtbHLH112基因識(shí)別順式作用元件的預(yù)測(cè)

啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，AtbHLH112啟動(dòng)子中除了含有CAAT-box、TATA-box等基本元件以外，還含有ARR1TA、GT?GANTG10、MYCCONSENSUSAT、MYBCORE、W-boxATNPR1和WRKY71OS等多個(gè)與信號(hào)傳遞途徑相關(guān)以及植物抗逆相關(guān)的元件。選取其中抗逆功能較為突出的W-box元件用于上游調(diào)控因子的研究。

2.2 報(bào)告載體的構(gòu)建

分別挑取單克隆菌斑進(jìn)行PCR檢測(cè)，凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出的DNA片段大小分別與cW-box、mW-box、sW-box和dW-box基因片段大小吻合（圖1）；測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)分析后證明重組報(bào)告載體構(gòu)建成功。

2.3 AtWRKYs基因與W-box元件的互作

pHIS2-cW-box與pGADT7-Rec2-AtWRKYs的酵母轉(zhuǎn)化子內(nèi)的識(shí)別情況與互作能力存在較大差異，導(dǎo)致酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞在3-AT存在的條件下生長(zhǎng)速度不一致。為進(jìn)一步提高篩選率，隨機(jī)挑取10個(gè)長(zhǎng)勢(shì)好且形狀規(guī)則的酵母菌斑，二次篩選后抽提酵母質(zhì)粒，通過(guò)PCR鑒定W-box元件與AtWRKYs基因互作情況（圖2）。

為驗(yàn)證互作基因的可靠性，將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli DH5α）感受態(tài)細(xì)胞，分別挑取陽(yáng)性克隆菌斑再次進(jìn)行PCR檢測(cè)并測(cè)序。測(cè)序列結(jié)果用BioEdit軟件和blastx比對(duì)分析，酵母單雜交分析結(jié)果表明，AtWRKY66能夠特異性識(shí)別W-box元件，且互作能力最強(qiáng)。

圖2 pGADT7-Rec2-AtWRKYs互作基因的PCR檢測(cè)

2.4 AtWRKY66基因識(shí)別W-box元件的互作驗(yàn)證

分別將pHIS2-mW-box、pHIS2-sW-box和pHIS2-dW-box與pGADT7-Rec2-AtWRKY66共轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)TDO/3-AT（50 mM）的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行二次篩選，結(jié)果表明，At?WRKY66只能夠特異性識(shí)別sW-box，而由于組成W-box元件序列的堿基發(fā)生了突變或缺失，導(dǎo)致AtWRKY66與mW-box和dW-box間的識(shí)別與互作能力消失，因此轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞在3-AT存在的條件下生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制（圖3）。進(jìn)一步說(shuō)明AtWRKY66與W-box元件識(shí)別的特異性，同時(shí)也說(shuō)明組成W-box元件的堿基對(duì)于上游因子AtWRKY66的識(shí)別均起著至關(guān)重要的作用。

圖3 AtWRKY66與W-box的酵母單雜交分析

3 結(jié)果與討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中含W-box基因的表達(dá)，從而發(fā)揮參與植物的逆境脅迫反應(yīng)[5]。迄今為止，研究者們已經(jīng)在擬南芥、水稻、大豆等植物中鑒定了多種WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因。Liu等研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中WRKY18、WRKY40和WRKY60等轉(zhuǎn)錄因子能夠與脫落酸相應(yīng)基因ABI4和ABI5啟動(dòng)子序列中的W-box元件識(shí)別互作，進(jìn)而驗(yàn)證了WRKY蛋白介導(dǎo)ABA信號(hào)途徑機(jī)制[6]。本研究成功構(gòu)建了擬南芥抗逆境脅迫基因AtbHLH112上游啟動(dòng)子區(qū)域的W-box元件報(bào)告載體，并構(gòu)建了AtWRKYs同源基因cDNA文庫(kù)，利用酵母單雜交系統(tǒng)進(jìn)行了DNA-蛋白質(zhì)的篩選，確定了W-box結(jié)合蛋白的互作情況。實(shí)驗(yàn)中利用酵母單雜交技術(shù)合成At?WRKYs同源基因的cDNA兩端融入與效應(yīng)載體匹配的SmaI酶切位點(diǎn)粘性末端序列，借助同源重組，cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和互作篩選在酵母Y187細(xì)胞內(nèi)同時(shí)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單且高效，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本的同時(shí)為進(jìn)一步研究AtbHLH112上游表達(dá)調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

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[3]Liu,Y.,Ji,X.,Nie,X.,et al.（2015）Arabidopsis AtbHLH112 regu?lates the expression of genes involved in abiotic stress tolerance by binding to their E-box and GCG-box motifs.New Phytologist,207（3）：692-709.

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Study on Upstream regulated of AtbHLH112 with Yeast One-hybrid Method

Yujia Liu,Jianming Sun
Key Laboratory of Food Science and Engineering,Harbin University of Commerce

酵母單雜交技術(shù)是研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，能夠有效地分離鑒定與特異DNA序列識(shí)別結(jié)合的蛋白質(zhì)。本研究利用酵母單雜交系統(tǒng)構(gòu)建了AtWRKYs基因cDNA文庫(kù)，篩選獲得了與擬南芥抗逆境脅迫基因AtbHLH112啟動(dòng)子區(qū)域中W-box元件特異性識(shí)別互作的WRKY蛋白。結(jié)果為進(jìn)一步研究AtbHLH112上游表達(dá)調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

擬南芥；AtbHLH112；上游表達(dá)調(diào)控；酵母單雜交

Yeast one-hybridis a kind of classic methods to study on the interaction between DNA and proteins,which effectively iso?lated and identified proteins binding to specific DNA sequences.In this study,we constructed the cDNA library of AtWRKY genes,and obtainedan AtWRKY gene,using yeast one-hybrid analysis,can reg?ulate the expression of AtbHLH112 through characteristically recog?nizing W-boxcis-element in the promoter of AtbHLH112.The re?sults established a foundation for futher research of upstream regulat?ed genes which interacted withAtbHLH112.

Arabidopsis；AtbHLH112；Upstream regulated；Yeast one-hybrid

哈爾濱商業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（14LG16）；哈爾濱商業(yè)大學(xué)校級(jí)教學(xué)改革與教學(xué)研究項(xiàng)目（HSDJY19）。

劉羽佳（1984-），女，講師，博士。