解淀粉芽孢桿菌B1619對設施蔬菜根結(jié)線蟲病的防治效果

蔣盼盼+陳志誼+甘穎+劉永鋒+陸凡

摘要：通過設施大棚藥效試驗，探究解淀粉芽孢桿菌B1619對設施蔬菜根結(jié)線蟲病的防治效果；通過室內(nèi)毒力試驗，測定解淀粉芽孢桿菌B1619對蔬菜根結(jié)線蟲的毒殺效果。設施大棚藥效試驗結(jié)果表明，一般情況下，溝施的田間防效高于穴施；當施用菌粉量較少時，穴施田間防效高于溝施；設施番茄、黃瓜溝施解淀粉芽孢桿菌B1619量為 16 g/株時，其防效分別為69.12%、87.77%。室內(nèi)毒力測定試驗結(jié)果表明，40%甲基異柳磷乳油對2齡線蟲的EC50（24 h）為85.252 1 mg/L，EC50（48 h）為77.704 7 mg/L；解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵液對2齡線蟲的EC50（24 h）為12.056 0 CFU/mL，EC50（48 h）為12.906 6 CFU/mL；解淀粉芽孢桿菌B1619粗提物對2齡線蟲的EC50（24h） 為稀釋 9.324 6倍，EC50（48 h）為稀釋9.960 4倍。室內(nèi)外試驗結(jié)果均表明，解淀粉芽孢桿菌B1619對設施蔬菜根結(jié)線蟲病有明顯的防治效果。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌B1619；設施蔬菜；根結(jié)線蟲；毒力測定；防治效果

中圖分類號： S432.4+5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0081-04

近年來，設施蔬菜發(fā)展迅速，特別是番茄、辣椒、黃瓜，已成為高效農(nóng)業(yè)發(fā)展的新產(chǎn)業(yè)。然而，因設施大棚的密閉性和單一作物連作引起的茄果類蔬菜土傳病害（根結(jié)線蟲病）頻繁暴發(fā)，嚴重制約著該產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-2]。2011年宋志強對江蘇省9個地區(qū)進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲平均發(fā)生率為73.6%[3]。據(jù)河南、山東、云南等地區(qū)報道，因該病危害，溫室大棚一般減產(chǎn)20%～30%，重者可達60%～70%，甚至絕收[4]。利用生防菌防治設施蔬菜土傳病害的研究備受關注，這些微生物通過分泌抗菌物質(zhì)、營養(yǎng)競爭、誘導植株產(chǎn)生抗病性等方式，調(diào)節(jié)根圍微生態(tài)結(jié)構、抑制病害發(fā)生、促進植物生長，在防治植物病害中發(fā)揮著重要作用[5-7]。江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所自2006年起，開展生物防治設施蔬菜土傳病害研究，針對番茄枯萎病菌、青枯病菌進行拮抗微生物的篩選，從2萬多個菌株中分離出具有較強拮抗能力的生防菌——解淀粉芽孢桿菌B1619[8]。該菌株可以誘導植物產(chǎn)生抗病性，并對番茄有促生作用，能有效控制設施蕃茄枯萎病、青枯病、根腐病、立枯病等重要土傳病害引起的連作障礙[9-11]。在推廣應用中發(fā)現(xiàn)，生防菌B1619能夠有效地防治設施蔬菜根結(jié)線蟲病。

本研究通過室內(nèi)毒力測定、日光大棚試驗，明確生防菌B1619對根結(jié)線蟲的抑制作用，對設施蔬菜（番茄、黃瓜）根結(jié)線蟲病的防治效果，為今后大面積推廣應用B1619防控設施蔬菜根結(jié)線蟲病提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試蔬菜品種番茄品種為天妃七號，購自沈陽谷雨種業(yè)有限公司；黃瓜品種為德瑞特201，購自天津德瑞特種業(yè)有限公司。

1.1.2供試菌株解淀粉芽孢桿菌B1619，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所生物防治研究室提供。

1.1.3培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基為YPG（胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，酵母膏5.0 g，水1.0 L，pH值為7.0）；固體培養(yǎng)基為YPGA（在YPG培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂）。

1.1.4供試藥劑40%甲基異柳磷乳油（青島雙飛農(nóng)化生物科技有限公司）。

1.1.5供試生物殺菌劑1.2億活芽孢/mL解淀粉芽孢桿菌B1619水分散粒劑（江蘇省蘇科農(nóng)化有限責任公司）。

1.2試驗方法

1.2.1生防菌B1619發(fā)酵液的制備從保存菌株B1619的試管中挑取2環(huán)菌種在YPGA斜面上，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h活化，即得到新鮮活化的B1619菌株；挑取2環(huán)轉(zhuǎn)接到含有330 mL YPG培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng) 48 h，即為B1619發(fā)酵液原液。

1.2.2B1619發(fā)酵液含菌量的測定采用平板菌落計數(shù)法。取上述B1619發(fā)酵液進行梯度稀釋，吸取1 mL稀釋菌液涂布于已凝固的YPGA平板上，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，檢測B1619發(fā)酵液含菌量為4.8×109 CFU/mL。

1.2.3B1619發(fā)酵液粗提物的制備將B1619發(fā)酵原液于10 000 r/min、4 ℃冷凍離心15 min，得上清液即粗提物原液。

1.3生防菌B1619防治設施蔬菜根結(jié)線蟲病田間試驗

1.3.1B1619防治設施番茄根結(jié)線蟲病田間試驗設計田間試驗于2014年8月在江蘇省徐州市銅山區(qū)棠張鎮(zhèn)前進村日光大棚中進行。田間小區(qū)試驗共有7個處理，處理1：穴施，定植時施用8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株；處理2：穴施，定植時施用4 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次2 g/株；處理3：溝施，定植時施用 8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株；處理4：溝施，定植時施用4 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次2 g/株；處理5為空白對照，不施用生防菌B1619。每個小區(qū)種植128株苗，每個處理重復2次，試驗小區(qū)隨機排列。

1.3.2B1619防治設施黃瓜根結(jié)線蟲病田間試驗設計田間試驗于2015年2月在江蘇省徐州市銅山區(qū)棠張鎮(zhèn)前進村日光大棚中進行。田間小區(qū)試驗共有4個處理，處理1：溝施，定植時施用8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次 4 g/株；處理2：溝施，定植時施用4 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次2 g/株；處理3：穴施，定植時施用 8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株；處理4為空白對照，不施用生防菌B1619。每個小區(qū)種植352株苗，每個處理重復2次，試驗小區(qū)隨機排列。endprint

1.3.3田間管理穴盤法育苗，苗齡30 d時移栽定植，定植時施用菌粉后立即澆足活棵水，定植后進行常規(guī)田間管理，按照各個處理的方法施撒1.2億活芽孢/mL解淀粉芽孢桿菌B1619水分散粒劑，然后立即灌溉。

1.3.4田間試驗調(diào)查番茄、黃瓜均在收獲后拔秧時，調(diào)查每個小區(qū)各處理植株根部的發(fā)病情況，參考Barker等分級方法[12-13]，計算病情指數(shù)及防效。

1.3.5田間試驗結(jié)果統(tǒng)計方法病情指數(shù)=（各級發(fā)病數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高級代表值）×100；

防效=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/（對照病情指數(shù)）×100%。

1.4生防菌B1619防治設施蔬菜根結(jié)線蟲病室內(nèi)毒力測定

1.4.1根結(jié)線蟲的分離試驗所用根結(jié)線蟲采自江蘇省徐州市銅山區(qū)棠張鎮(zhèn)前進村，經(jīng)形態(tài)學鑒定為南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）。取發(fā)病番茄植株根系，用水輕輕沖洗，挑取根部新鮮卵塊，置于貝曼漏斗中孵化，24 h后開始收集2齡幼蟲（J2），每天收集1次，共收集1周，2齡線蟲懸浮液稀釋為100頭/mL，4 ℃保存待用。

1.4.2B1619對根結(jié)線蟲室內(nèi)毒力的測定

1.4.2.1各種濃度菌液和藥劑的制備試驗組為解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵原液、B1619發(fā)酵液粗提物原液與稀釋5、10、15、20、25倍；陽性對照為40%甲基異柳磷乳油，依次配制成10、25、50、100、200 mg/L；以無菌水和YPG培養(yǎng)基處理為空白對照。每個處理重復6次。

1.4.2.2根結(jié)線蟲毒力測定方法吸取1 mL分離所得的2齡根結(jié)線蟲懸浮液于已滅菌的直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，分別加入1 mL不同稀釋倍數(shù)的B1619發(fā)酵液、粗提物、甲基異柳磷等，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48 h后進行觀察計數(shù)，采用針觸法判斷并記錄線蟲死亡情況[14]，統(tǒng)計死亡率。

1.5數(shù)據(jù)分析

利用DPS 7.05軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1生防菌B1619防治設施蔬菜根結(jié)線蟲病的田間試驗結(jié)果

2014年8月開展的B1619水分散粒劑防治番茄根結(jié)線蟲病田間小區(qū)試驗結(jié)果見表1。其中溝施處理下，定植時施用 8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株，田間防效為6912%，防效高于相同條件下穴施，穴施田間防效為2861%；溝施處理下，定植時施用4 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次2 g/株，田間防效為7.84%，防效低于相同條件下穴施，穴施田間防效為24.79%。

表示差異顯著（P<0.05）。表2同。

2015年2月開展的B1619水分散粒劑防治黃瓜根結(jié)線蟲病田間小區(qū)試驗結(jié)果見表2。其中溝施處理下，定植時施用 8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株防效最高，為8777%；穴施處理下，定植時施用8 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次4 g/株防效次之，防效為7193%；溝施處理下，定植時施用 4 g/株，定植后進行田間管理再施用2次，每次2 g/株防效為6402%。本田間試驗結(jié)果表明，相同條件下，一般溝施的田間防效高于穴施；當施用菌粉量較少時，穴施田間防效高于溝施。

2.2生防菌B1619防治設施蔬菜根結(jié)線蟲病室內(nèi)毒力測定結(jié)果

由表3可以看出毒力回歸方程B1619發(fā)酵液濃度與線蟲死亡率的關系，處理24 h時毒力回歸方程為y=-3.253 9x+89.229，r2=0.951 9，EC50=12.056 0倍；處理48 h時，毒力回歸方程為y=-3.382x+93.65，r2=0.950 7，EC50=12.906 6 CFU/mL。隨著B1619發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增大，根結(jié)線蟲的死亡率逐漸降低，根結(jié)線蟲死亡率與B1619發(fā)酵液稀釋倍數(shù)呈負相關關系。另外，隨著B1619發(fā)酵液處理時間的增加，根結(jié)線蟲的死亡率增高。表3B1619發(fā)酵液對2齡線蟲的毒力測定結(jié)果

由表4毒力回歸方程可以看出B1619發(fā)酵液粗提物濃度與線蟲死亡率的關系，處理24 h時毒力回歸方程為y=-3.007 3x+78.042 0，r2=0.978 1，EC50為稀釋9.324 6倍；處理48 h時，y=-3.105 0x+80.927 0，r2=0.971 7，EC50為稀釋9.960 4倍。隨著B1619發(fā)酵液粗提物稀釋倍數(shù)的增大，根結(jié)線蟲的死亡率逐漸降低，根結(jié)線蟲死亡率與B1619發(fā)酵粗提物稀釋倍數(shù)呈負相關關系；另外，隨著B1619發(fā)酵粗提物處理時間的增加，根結(jié)線蟲的死亡率增高。表4B1619粗提物對2齡線蟲的毒力測定結(jié)果

3結(jié)論與討論

目前設施蔬菜根結(jié)線蟲病的防治通常采用農(nóng)業(yè)、化學、物理等方法。農(nóng)業(yè)防治中常采用清除病殘體、嫁接栽培、合理輪作等方法；化學防治中常采用有機磷類如甲基異柳磷等化學殺線蟲劑處理土壤，雖然室內(nèi)毒力測定試驗時線蟲死亡率很高，但許多化學農(nóng)藥因?qū)Ψ前袠松锞哂袧撛诙拘?，在蔬菜中殘留量高，對環(huán)境污染嚴重，已被陸續(xù)禁用；物理防治主要采用太陽能高溫悶棚的方法。這些措施對設施蔬菜根結(jié)線蟲病的防控效果不理想，根結(jié)線蟲病在許多蔬菜種植區(qū)依然十分嚴重。植物保護專家們力圖通過利用生防菌等微生物及生物農(nóng)藥代替化學農(nóng)藥防治線蟲病害[15]，如李頌等研究表明，黑曲霉菌株Snf009發(fā)酵液對南方根結(jié)線蟲具有較強的活性，它對溫室番茄線蟲的防效達到50%[16]。馬金慧等發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌株TRI2對黃瓜根結(jié)線蟲有較好的防治作用[17]。唐佳頻等對1 432株海洋和極地來源的細菌進行抗南方根結(jié)線蟲的離體篩選試驗，明確惡臭假單胞菌1A00316菌體具有誘導番茄對線蟲的抗性作用[18]。張艷杰等報道玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63 菌株發(fā)酵物對設施蔬菜根結(jié)線蟲病具有較好的防治效果[19]。本研究從土壤中分離篩選獲得解淀粉芽孢桿菌生防菌株B1619，研發(fā)成“1.2億活芽孢/mL解淀粉芽孢桿菌B1619水分散粒劑”，對設施番茄、黃瓜的防效分別可達到69.12%、87.77%。實踐證明，設施條件下，在土壤中大量引進有益微生物（生防菌劑）能夠有效地防治蔬菜根結(jié)線蟲病，并且無毒、無致病性、無殘留，對設施蔬菜的生長有一定的促生作用，生態(tài)和經(jīng)濟效益均十分顯著，具有廣闊的應用前景。endprint

芽孢桿菌是一類廣泛存在于土壤、湖泊、海洋、動植物表體的生防菌，多數(shù)菌株無致病性、生長速度快、營養(yǎng)需求簡單，在植物的表面易于存活、定殖、繁殖，對多種植物病害尤其是土傳病害有較好的防控效果；同時生產(chǎn)芽孢桿菌制劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝簡單，制劑穩(wěn)定，儲存期長，施用方便，對人畜安全，對環(huán)境友好，是一種理想的防控植物病害流行的生防因子[20]。成飛雪等在田間施用對線蟲有毒殺作用的芽孢桿菌 YC-10 菌株，發(fā)現(xiàn)它能降低黃瓜根際根結(jié)線蟲J2的蟲口密度，減少根結(jié)的形成，促進植株生長[21]。余子全等研究表明，堅強芽孢桿菌YBf-10在穩(wěn)定期能大量合成對線蟲具有毒殺活性的小分子化合物，對根結(jié)線蟲表現(xiàn)出極高毒力[22]。Tong等報道蠟樣芽孢桿菌X5有一定的殺線蟲活性[23]。本研究分離篩選獲得的解淀粉芽孢桿菌B1619是1株對設施蔬菜土傳病害多種病原菌（根結(jié)線蟲）具有較強拮抗能力的生防菌，能有效控制設施蕃茄枯萎病、青枯病、根腐病、立枯病等重要土傳病害引起的連作障礙，同時該菌株可以誘導植物產(chǎn)生抗病性，并對番茄有促生作用。本試驗獲得的解淀粉芽孢桿菌生防菌株B1619對設施蔬菜根結(jié)線蟲有較好的田間防控效果，進一步驗證了芽孢桿菌在植病生防領域中具有較大的研究和應用價值。

目前國內(nèi)外已報道多種生防菌中含有殺線蟲活性物質(zhì)，如Huang等發(fā)現(xiàn)1株具有殺根結(jié)線蟲的根際細菌巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）YMF3.25，該菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對根結(jié)線蟲具有很強的抑制作用，經(jīng)固相微萃取（SPME-GCMS）分析和鑒定表明，其主要的活性揮發(fā)物質(zhì)為苯乙醛（benzeneacetaldehyde）、2-壬酮（2-nonanone）、癸醛（decanal）、2-十一酮（2-undecanone）和二甲基二硫（dimethyl disulphide）[24]。曾慶飛等從白淺灰鏈霉菌的發(fā)酵液中分離獲得2個對南方根結(jié)線蟲J2具有活性的化合物，其中1個活性組分經(jīng)結(jié)構鑒定為諾卡胺素（nocardamine）[25]。本試驗使用的解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵液粗提物對2齡根結(jié)線蟲有明顯的毒殺作用，用粗提物原液處理后線蟲的死亡率分別為78.85%、82.49%；解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵液原液處理后線蟲的死亡率分別為8055%、84.99%；B1619發(fā)酵液粗提物和發(fā)酵液對線蟲的室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，B1619的發(fā)酵液粗提物對線蟲起主要毒殺作用。至于B1619菌株發(fā)酵液粗提物中對線蟲有毒殺作用的主要生物活性物質(zhì)以及活性物質(zhì)的分離、結(jié)構鑒定、作用機制還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]郭軍，顧閩峰，祖艷俠，等. 設施栽培蔬菜連作障礙成因分析及其防治措施[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報，2009，21（11）：51-54.

[2]李世東，繆作清，高衛(wèi)東，等. 我國農(nóng)林園藝作物土傳病害發(fā)生和防治現(xiàn)狀及對策分析[J]. 中國生物防治學報，2011，27（4）：433-440.

[3]宋志強.江蘇省蔬菜根結(jié)線蟲的分布調(diào)查，種類鑒定及定量檢測技術研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2013：21.

[4]劉鳴韜.北方蔬菜根結(jié)線蟲病加重的原因及控制對策[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學，2001（1）：23-24.

[5]Cook R J. Making greater use of introduced microorganisms for biological control of plant pathogens[J]. Annual Review of Phytopathology，1993，31（1）：53-80.

[6]曹中愷，馬金慧，閆海霞，等. 植物根圍微生態(tài)與土傳病害生物防治相關性研究進展[J]. 農(nóng)學學報，2013，3（6）：34-38.

[7]Lugtenberg B，Kamilova F. Plant-growth-promoting rhizobacteria[J]. Annual Review of Microbiology，2009，63：541-556.

[8]陳志誼，劉永峰，劉郵洲，等. 植物病害生防芽孢桿菌研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2012，28（5）：999-1006.

[9]喬俊卿，劉郵洲，夏彥飛，等. 生防菌 B1619 在番茄根部的定殖及對根際微生態(tài)的影響[J]. 植物保護學報，2013，40（6）：507-511.

[10]陳志誼，劉郵洲，喬俊卿，等. 利用芽孢桿菌生防菌防控土傳病害引起的設施蔬菜連作障礙[J]. 中國蔬菜，2012（8）：29-30.

[11]劉郵洲，陳志誼，梁雪杰，等. 番茄枯萎病和青枯病拮抗細菌的篩選，評價與鑒定[J]. 中國生物防治學報，2012，28（1）：101-108.

[12]Barker K R. Nematode extractions and bioassays[C]//Barker K R，Carter C C，Sasser J N. An advanced treatise on meloidogyne，volume Ⅱ：methodology. Raleigh：North Carolina State University，1985：19-35.

[13]Canto-Saenz M，Brodie B B. Comparison of compatible and incompatible response of potato to Meloidogyne incognita[J]. Journal of Nematology，1987，19（2）：218.

[14]朱震，陳芳，肖同建，等. 拮抗菌生物有機肥對番茄根結(jié)線蟲的防治作用[J]. 應用生態(tài)學報，2011，22（4）：1033-1038.endprint

[15]Wang L，Yang B，Li C. A review of biological control of root-knot nematodes[J]. Journal of Nanjing Forestry University，2001，26（1）：64-68.

[16]李頌，段玉璽，朱曉峰，等. 黑曲霉次生代謝產(chǎn)物對番茄抗根結(jié)線蟲病效果的影響[J]. 中國蔬菜，2011（4）：44-49.

[17]馬金慧，朱萍萍，茆振川，等. 哈茨木霉菌株 TRI2 的鑒定及其對黃瓜根結(jié)線蟲的防治作用[J]. 中國農(nóng)學通報，2014，30（22）：263-269.

[18]唐佳頻，邵宗澤，張智濤，等. 南極土壤來源的惡臭假單胞菌 1A00316 抗南方根結(jié)線蟲的機制[J]. 應用與環(huán)境生物學報，2014，20（6）：1046-1051.

[19]張艷杰，魏學軍，寇宏達，等. 玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63 抗南方根結(jié)線蟲相關酶活性及其防效[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報，2013，22（4）：184-190.

[20]魏利輝. 頗頑細菌對根結(jié)線蟲病的生防作用研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2009：1-4.

[21]成飛雪，王忠勇，劉勇. 光合細菌與芽孢桿菌生防菌劑防治黃瓜根結(jié)線蟲病研究[J]. 長江蔬菜，2012（20）：80-83.

[22]余子全，羅輝，熊靜，等. 對根結(jié)線蟲高毒力芽胞桿菌的鑒定及其活性測定[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報，2012，20（6）：669-675.

[23]Tong J X，F(xiàn)ang C，Chao G A O，et al. Bacillus cereus X5 enhanced bio-organic fertilizers effectively control root-knot nematodes（Meloidogyne sp.）[J]. Pedosphere，2013，23（2）：160-168.

[24]Huang Y，Xu C K，Ma L，et al. Characterisation of volatiles produced from Bacillus megaterium YFM3. 25 and their nematicidal activity against Meloidogyne incognita[J]. European Journal of Plant Pathology，2010，126（3）：417-422.endprint