亞洲百合不定芽的誘導(dǎo)及再生植株的建

立蔣瑤+陳文波+蔣炷宇

摘要：以亞洲百合鱗莖為外植體，采用不同濃度激素組合對其進行不定芽的誘導(dǎo)、增殖以及生根進行研究，以期建立該種亞洲百合組織培養(yǎng)快速繁殖體系。試驗結(jié)果表明：誘導(dǎo)亞洲百合不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，其出芽率為83.33%，最適宜誘導(dǎo)不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，其增殖率為92.75%，誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg/L，其生根率為92.86%。試驗結(jié)果可為亞洲百合生產(chǎn)擴繁、脫毒復(fù)壯、基因轉(zhuǎn)化等工作提供參考。

關(guān)鍵詞：亞洲百合；不定芽誘導(dǎo)；增殖；鱗片；培養(yǎng)基

中圖分類號： S682.2+65.04文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）12-0035-04

E-mail：jiangyao0221@163.com。百合是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生草本植物，大多數(shù)品種性喜涼爽、濕潤的半陰環(huán)境，較耐寒冷，具有重要的經(jīng)濟價值和應(yīng)用價值。據(jù)調(diào)查，百合有47種18個變種，中國特有種為36種15個變種，分布遍及全國各地[1]，百合又是切花系列中主流產(chǎn)品，其切花主要包括3類：亞洲百合系列、東方百合系列、康香百合系列[2]。亞洲百合（Lilium asiatic Hybrids）屬百合科百合屬植物，其栽培品種由卷丹、垂花、朝鮮百合等多個亞洲原種的雜交或?qū)嵣x種選育而來，不耐高溫，性喜冷涼濕潤氣候、半陰環(huán)境，具有食用、藥用、提取香料等多種用途[2]。百合以扦插、分株和分球等無性繁殖方式為主[3]，繁殖系數(shù)低，容易感染病毒，導(dǎo)致品種退化；目前百合鱗莖[4-6]、葉片[7]、莖尖[8]、花器官[8-9]、胚[10]等不同組織或器官的組織培養(yǎng)已獲得成功，建立了部分基本的組培快繁技術(shù)體系[11-13]可在短時間內(nèi)獲得大量的無病毒、優(yōu)質(zhì)種苗[14-16]。

近年來，國內(nèi)外開展亞洲百合的研究主要集中在細胞生物學(xué)、引種栽培、組織培養(yǎng)、遺傳育種等方面，從2001年開始選用亞洲百合為母本，采用4種授粉方法解決百合自交不親和性和種間不親和性[17]，亞洲百合頂級×金色號角雜交后通過胚培養(yǎng)技術(shù)分離發(fā)育不良的胚[18]，亞洲百合和鐵炮百合采用切割花柱授粉和子房授粉結(jié)合胚培養(yǎng)進行正反雜交，可克服雜交障礙，從而提高獲得雜種胚的概率[19]，亞洲百合種間或種內(nèi)也是通過類似的方法進行雜交，提高坐果率，從而使雜交組合親和性也提高[20-21]。對國外各引進11個不同的亞洲百合品種進行相關(guān)農(nóng)藝性狀調(diào)查，并采用層次分析法進行評價，結(jié)果刁義維等發(fā)現(xiàn)Black Out、Cheops、Navona、Mount Duckling等4個新品種適宜北方地區(qū)栽種[22]，而董航等認為Strawberry and cream、Tiger player和Dot.com等3個新品種適宜北方地區(qū)栽種[23]，由此說明，通過引進和篩選不同亞洲百合能夠豐富其品種多樣性。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，GsZFP1基因在亞洲百合耀眼小鱗片中能夠表達，提高其抗寒、抗旱性[24]。趙慶芳等[25]采用不同種類和濃度的保鮮溶液對東方百合和亞洲百合切花后進行保鮮研究，認為蔗糖30 mg/L+8-HQS 200 mg/L為最佳保鮮劑。

目前亞洲百合組織培養(yǎng)相關(guān)報道并不多見，其組培主要以鱗片[26-27]為主，以及花器官的不同部位[28-30]、葉片[31]等為外植體進行器官發(fā)生途徑進行探討，以及后期試管苗生根移栽[32-33]等方面的研究。由于亞洲百合優(yōu)質(zhì)種球大多數(shù)依靠進口，其鱗莖繁殖多代后易感病，從而引起該品種退化或種間雜交不親和性等問題，嚴(yán)重制約其市場需求，故本研究以亞洲百合（Brunello）鱗莖（從沭陽縣引種種于凱里學(xué)院環(huán)境科學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院實驗地）為試驗材料，采用不同濃度激素配比對其進行初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等研究，以期建立亞洲百合組織培養(yǎng)再生體系，進一步為亞洲百合生產(chǎn)擴繁、脫毒復(fù)壯、基因轉(zhuǎn)化等工作奠定基礎(chǔ)，旨在為種苗繁育及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)，以期培育更多新品種。

1材料與方法

1.1試驗材料

選用亞洲百合（Brunello）為試驗材料，從沭陽縣將亞洲百合引種于凱里學(xué)院環(huán)境科學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院實驗地，進行相關(guān)的日常管理（整地、種植、澆水、除草），選用亞洲百合健壯、無病蟲害鱗莖為試驗材料（圖1）。

1.2試驗方法

1.2.1外植體的消毒從實驗地采集亞洲百合鱗莖（去除最外1層），清除表層泥土，剝開后采用自來水沖洗2 h，選用中外層進行接種。外植體先用70%乙醇處理30 s，無菌水沖洗3次，再用0.1% HgCl2處理10 min，無菌水沖洗5次，濾紙吸干備用。

1.2.2不定芽的誘導(dǎo)不定芽誘導(dǎo)以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度激素配比的6-BA和NAA，隨機組合為9個處理（表1），每個處理接種30個外植體，每個處理重復(fù)3次。隨機選擇鱗片中下部位并切成約0.5 cm×0.5 cm大小方塊（形

1.3培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為25 ℃，培養(yǎng)時間為光照時間16 h/d，暗培養(yǎng)時間8 h/d，且光照度為2 000 lx。

2結(jié)果與分析

2.1不同激素對亞洲百合形成不定芽的影響

取亞洲百合鱗莖的中下部位接種于誘導(dǎo)不定芽的不同培養(yǎng)基中，其形態(tài)初始為乳白色（圖2-A），逐漸變淺黃，6～9 d再由淺黃轉(zhuǎn)綠（圖2-B），15 d左右在綠色的鱗片塊上開始出現(xiàn)淺綠色球狀突起，呈小球狀，之后繼續(xù)增大，這些突起繼續(xù)生長7 d左右突起逐漸分化成綠色小芽，部分還有不定根伸出（圖2-C）。

由表1可知，采用不同激素濃度配比均能從鱗片誘導(dǎo)出不定芽，且污染率均低于27.00%，表明不同處理間存在差異，其中2、5、6號3個處理的誘導(dǎo)率均高于60.00%，而2號處理的誘導(dǎo)率最高，為83.33%，其鱗片均有轉(zhuǎn)綠，大多數(shù)均長出不定芽且生長狀況優(yōu)良，5號和6號處理誘導(dǎo)率分別為64.00%和70.83%，其鱗片大多數(shù)返綠，不定芽長勢較好；4號處理其誘導(dǎo)率為56.00%，誘導(dǎo)的不定芽相對較小，生長較慢，顏色較淺；其他各處理不定芽誘導(dǎo)率均低于50%，誘導(dǎo)的不定芽也較弱小，生長緩慢。由此可知，6-BA濃度為 1.0～1.5 mg/L，促進不定芽的誘導(dǎo)，當(dāng)6-BA濃度升高至 3 mg/L 時，對不定芽誘導(dǎo)效果較差。根據(jù)各個處理出芽的速度以及不定芽的長勢和數(shù)量，能夠判定2號處理即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L適合該種亞洲百合不定芽的誘導(dǎo)，符合分裂素/生長素濃度比值高，利于誘導(dǎo)不定芽的規(guī)律。endprint

2.2不同激素對亞洲百合不定芽增殖的影響

將初代培養(yǎng)得到的健壯不定芽轉(zhuǎn)接到不同增殖培養(yǎng)基中，不定芽初始相對較小，顏色較淺（圖3-A），5 d后開始慢慢變大且顏色變綠（圖3-B），經(jīng)15 d后，發(fā)現(xiàn)不同處理不定芽四周均有淺綠色的突起產(chǎn)生，繼續(xù)生長10 d左右逐漸分化成綠色小芽，而后繼續(xù)生長變大，同時也有部分有不定根生長（圖3-C）。結(jié)果表明，不同激素配比處理后增殖的不定芽（個數(shù)）均有所增加，且生長相對茁壯，其增殖率均高于50%，污染率低于8%，且不同處理間存在差異。由表2可知，不同處理不定芽增殖有所差異，其中1、4、5號等3個處理的增殖率均高于60%，且4號處理的增殖率最高，為9275%，其不定芽的長勢良好；其余處理的增殖率均低于60%，且其不定芽相對較為弱小。由此表明，1、4、5號處理的6-BA濃度范圍為 0.8～1.0 mg/L時，隨著6-BA濃度的增加，分化芽的數(shù)量依次增加，出芽數(shù)也增多，之后濃度升高后，出芽增殖數(shù)相對減少；NAA濃度范圍為0.1～0.2 mg/L時，隨著NAA濃度升高，不定芽增殖數(shù)量逐漸減少，高濃度NAA對不定芽增殖有抑制作用。根據(jù)不同處理不定芽增殖出芽的速度以及不定芽的長勢和數(shù)量，可以確定處理4即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 配方的增殖率最高，達到9275%，其不定芽生長健壯且顏色蔥綠，分裂素/生長素比例相對較高，有利于不定芽的增殖。

2.3不同激素對亞洲百合生根的影響

將增殖培養(yǎng)得到的健壯無根組培苗轉(zhuǎn)入9種不同處理生根培養(yǎng)基中，5～7 d后可見小鱗莖的基部能夠長出毛狀的白根，21 d后長出的根系發(fā)達且粗壯，在不定根的四周能觀察到有細小的白毛生長，約30 d后幾乎所有的組培苗都會長出不定根（圖4）。

不同激素濃度配比對亞洲百合鱗莖均都能誘導(dǎo)不定芽生根，由表3可知，1～9號處理生根率都高于58%，且污染率相對較低，低于11.00%，其中2號處理生根率最高，達9286%，其余處理的生根率均在58%～76%之間，培養(yǎng)期間生根較慢，不定根細小且數(shù)目較少，生長一般，由此表明，隨著MS中大量元素的升高，生根效果較差，僅有1/2MS為最佳培養(yǎng)基，添加一定的低濃度NAA促進生根，2號處理即 1/2MS+NAA 0.2 mg/L生根率最高，其不定根粗壯，根系發(fā)達，生長較快，數(shù)目較多且長勢良好。由此表明，1/2MS為生根最適培養(yǎng)基，而生長素NAA較低的濃度有利于生根培養(yǎng)。

3結(jié)論與討論

通過本次試驗研究可知，亞洲百合（Brunello）誘導(dǎo)分化不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，最適宜誘導(dǎo)不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 10 mg/L+NAA 0.1 mg/L，誘導(dǎo)不定芽生根以1/2MS+NAA

0.2 mg/L為最佳培養(yǎng)基，其誘導(dǎo)率、增殖率和生根率分別為83.33%、92.75%和92.86%。

3.1激素濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響

選用鱗片為外植體的不同研究表明，不同亞洲百合品種誘導(dǎo)不定芽存在一定的差異，通過對黃百合[34]、金百合[34]、普瑞頭[35-36]、布耐羅[35]、紅色警報[36]、精粹[37]等多種亞洲百合鱗片為外植體誘導(dǎo)不定芽的試驗比較發(fā)現(xiàn)，不同亞洲百合品種因材料和生長周期不同，從而導(dǎo)致誘導(dǎo)分化所需用激素濃度存在差異，6-BA濃度在0.5～2.0 mg/L范圍內(nèi)，有利于不定芽分化和生長，超過一定范圍后，會抑制不定芽的生長，NAA在0.1～0.5 mg/L濃度范圍內(nèi)，促進不定芽生長。

本試驗結(jié)果表明，該種亞洲百合選用鱗片為外植體進行不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，其誘導(dǎo)不定芽的出芽率為83.33%，與周蘊薇的研究結(jié)果[22]基本一致。

3.2激素濃度對不定芽增殖的影響

亞洲百合增殖大多選用MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選用6-BA和NAA不同激素濃度配比進行研究，本試驗研究結(jié)果表明，最適宜誘導(dǎo)不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，其誘導(dǎo)不定芽的增殖率為92.75%，這與孫紅梅等[30]和王晶[7]的研究結(jié)果一致。

其他研究中以多安娜（♀）和普瑞頭（♂）的雜交后代無菌苗進行不定芽誘導(dǎo)增殖的最適激素配比6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L[2]。大多數(shù)亞洲百合在選用鱗片進行不定芽增殖過程中，不同品種間存在差異，黃百合和金百合[34]、布耐羅[35]、紅色警報[36]以及金色號角[38]最適不定芽增殖 6-BA 濃度范圍為0.5～3.0 mg/L，NAA濃度0.1～1.0 mg/L，同一普瑞頭[39-40]品種誘導(dǎo)不定芽增殖也有所不同，由此表明，亞洲百合增殖過程中通過6-BA和NAA不同激素濃度配比，尤其是較高濃度的6-BA促進不定芽增殖，較低NAA濃度有利于不定芽的生長和膨大。

3.3激素濃度對生根的影響

前人研究不同亞洲百合品種生根培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，金色號角[38]無需添加生長素濃度則生根效果最佳，其他品種[18，34，37]則需加入NAA不同濃度，其范圍為0.05～0.5 mg/L；同一品種普瑞頭[39-40]誘導(dǎo)生根培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基存在差異，選用IBA和NAA等2種不同生長激素，但其濃度均為0.5 mg/L，由此說明，一定濃度的生長素有利于不定芽的生根，但紅色警報最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.3 mg/L[37]。

本試驗主要選擇3種不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時選用IBA和NAA等2種不同生長素進行試驗，研究結(jié)果表明，低濃度生長素生根效果良好，其中IBA能夠促進生根，但生根效果不如NAA明顯，誘導(dǎo)生根最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2MS，最佳激素NAA濃度為0.2 mg/L，其誘導(dǎo)生根率為92.86%。endprint

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