轉(zhuǎn)砂蘚RcMYB基因煙草的抗旱生理指標(biāo)測(cè)定

孫靜+沙偉+張梅娟+賈宇婷

摘要：以轉(zhuǎn)RcMYB基因煙草和野生型煙草為試驗(yàn)材料，進(jìn)行干旱和復(fù)水處理，測(cè)定不同處理葉片的丙二醛、游離脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖的含量，比較外源RcMYB基因表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性的影響。結(jié)果表明，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量呈上升趨勢(shì)但一直低于對(duì)照組野生型煙草，脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量均呈上升趨勢(shì)并且一直高于對(duì)照組野生型煙草；復(fù)水之后，轉(zhuǎn)基因煙草較野生型煙草更快恢復(fù)原有狀態(tài)。結(jié)果表明，砂蘚RcMYB基因在煙草的成功表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫過(guò)程中表現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)定性和恢復(fù)能力，較野生型煙草具有更強(qiáng)的抗旱性。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因；煙草；RcMYB基因；干旱脅迫；生理特性

中圖分類(lèi)號(hào)： S572.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）12-0062-02

干旱已成為全球性的生態(tài)問(wèn)題，一旦發(fā)生嚴(yán)重干旱，會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和牧業(yè)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)造成重大影響。目前，植物的抗旱性研究正在逐漸得到關(guān)注和重視，而運(yùn)用基因工程技術(shù)將抗旱相關(guān)基因轉(zhuǎn)入植物體來(lái)提高植物的綜合抗性，成為培育抗逆性新品種的一種重要手段。MYB家族轉(zhuǎn)錄因子是植物中非常重要的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在生物體內(nèi)主要起轉(zhuǎn)錄激活作用[1-2]，在植物防衛(wèi)反應(yīng)和逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程中扮演著非常重要的角色[3]，有著廣泛的生理功能，可引發(fā)一系列生理、生化反應(yīng)，以降低或消除逆境給植株帶來(lái)的危害[4]，在植物對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起著承上啟下的作用。苔蘚植物中的砂蘚具有可以在極干旱環(huán)境下維持生命特征、復(fù)水后立即恢復(fù)正常狀態(tài)的特點(diǎn)，是很好的抗逆基因資源。本試驗(yàn)研究轉(zhuǎn)砂蘚RcMYB基因煙草對(duì)水分脅迫的生理應(yīng)答，旨在為轉(zhuǎn)RcMYB基因煙草的抗旱性研究提供可靠的理論依據(jù)，從而為實(shí)現(xiàn)品種的抗性改良奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為生長(zhǎng)狀態(tài)一致的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草。

1.2處理方法

將正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草進(jìn)行自然干旱處理15 d，從處理16 d起復(fù)水3 d，分別于0、3、6、9、12、15、18 d取植株葉片進(jìn)行相應(yīng)的生理指標(biāo)測(cè)定，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.3生理指標(biāo)測(cè)定測(cè)定

丙二醛含量測(cè)定參考趙世杰等的方法[5]；脯氨酸含量測(cè)定采用磺基水楊酸法；可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法；可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮法。

1.4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Origin軟件繪制圖表。

2結(jié)果與分析

2.1丙二醛含量的變化

丙二醛是膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，其積累能對(duì)膜脂和細(xì)胞造成一定傷害，其含量可反映植物受傷害程度。

從圖1可以看出，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著脅迫的加劇，轉(zhuǎn)基因型煙草和野生型煙草的MDA含量均呈上升趨勢(shì)，最大值分別達(dá)到0.33、0.55 μmol/L，為處理前的3.09、4.54倍，在干旱脅迫過(guò)程中，野生型煙草中的丙二醛含量高于轉(zhuǎn)基因煙草，并且野生型煙草復(fù)水3 d后，其MDA含量也仍然處于較高的水平，而轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量與脅迫前基本保持一致。

2.2脯氨酸含量的變化

脯氨酸作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物的抗逆生理中發(fā)揮著重要的作用。

從圖2可以看出，在干旱脅迫過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草脯氨酸含量均呈上升趨勢(shì)，在處理15 d后達(dá)到最大值，分別為0.64、0.40 mg/g，為脅迫處理前的5.3、3.3倍。復(fù)水3 d后，轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量恢復(fù)到脅迫前的1.2倍以內(nèi)，而野生型煙草仍為處理前的1.42倍。

2.3可溶性蛋白含量

可溶性蛋白作為重要的一類(lèi)蛋白質(zhì)，親水性很強(qiáng)，具有明顯增強(qiáng)細(xì)胞的持水力、增加束縛水含量等功能，可抵御干旱帶來(lái)的傷害[6]。

從圖3可以看出，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因煙草葉片中可溶性蛋白含量呈明顯的上升趨勢(shì)，處理12 d后達(dá)到最大值并維持在較高水平。而野生型煙草的可溶性蛋白的含量在脅迫后含量持續(xù)下降，脅迫15 d，其可溶性蛋白的含量?jī)H為處理前的80.6%。復(fù)水3 d后，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草的可溶性蛋白含量均大致恢復(fù)到脅迫前水平。

2.4可溶性糖含量

可溶性糖是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在干旱脅迫過(guò)程中，植物體內(nèi)可溶性糖含量的變化在一定程度上能反映其對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力。

從圖4可以看出，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草的可溶性糖含量在干旱脅迫9 d之內(nèi)的變化較為一致。隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性糖含量持續(xù)上升，于15 d達(dá)到最大值，為10.2 mmol/g，野生型煙草的呈先上升后下降的趨勢(shì)，于處理9 d達(dá)到最大值，為6.9 mmol/g。復(fù)水 3 d 后，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的可溶性糖含量與脅迫前大致相同。

3結(jié)論與討論

丙二醛（MDA）的積累是反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用強(qiáng)弱和質(zhì)膜破壞程度的重要指標(biāo)，其活性大小代表細(xì)胞膜的損傷

程度[7]。覃鵬等發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫使煙草葉片的丙二醛含量顯著升高，復(fù)水一段時(shí)間后恢復(fù)脅迫前水平[8]。本試驗(yàn)中，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草MDA含量均呈上升趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)基因煙草的MDA含量始終低于野生型煙草。復(fù)水后轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量較野生型煙草更快地恢復(fù)到脅迫前水平，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草的細(xì)胞膜損傷程度明顯弱于野生型煙草。

脯氨酸為植物細(xì)胞內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑[9]。有研究表明，隨著干旱脅迫的加劇，葉片脯氨酸積累量與其抗旱性呈正相關(guān)，抗旱性越強(qiáng)，脯氨酸的積累量越高，且變化幅度越大[10-11]。本試驗(yàn)中，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量明顯升高并高于野生型煙草，相同復(fù)水時(shí)間處理下，轉(zhuǎn)基因煙草的脯氨酸含量幾乎恢復(fù)到正常水平，野生型煙草脯氨酸含量仍明顯高于處理前。說(shuō)明在干旱脅迫過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸較野生型煙草更加積極地參與細(xì)胞之間的滲透調(diào)節(jié)作用，維持其穩(wěn)定的滲透壓，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草起到更好的保護(hù)作用。而野生煙草較轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱脅迫更加敏感，且恢復(fù)能力較差。

可溶性蛋白作為檢測(cè)植物抗旱能力的重要指標(biāo)，可通過(guò)植物體內(nèi)蛋白的合成和降解，使其含量發(fā)生變化[12-13]?？扇苄缘鞍缀铣闪康脑龆啵蓭椭S持植物細(xì)胞較低的滲透勢(shì)。本試驗(yàn)中，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性蛋白含量均高于野生型煙草，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫發(fā)生的情況下，可提高可溶性蛋白含量，繼而較野生型煙草表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱能力。

可溶性糖作為一類(lèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可通過(guò)滲透調(diào)節(jié)作用提高植物對(duì)逆境的抵抗能力[14-15]。在干旱脅迫下，植物體內(nèi)常常積累大量的可溶性糖，從而增加細(xì)胞原生質(zhì)濃度，起到抗脫水的作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因煙草的可溶性糖含量呈上升趨勢(shì)，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于野生型煙草，以較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)作用來(lái)抵抗環(huán)境壓力，表現(xiàn)出良好的抗旱性。而隨著干旱脅迫的加劇，野生型煙草可溶性糖含量呈拋物線變化，說(shuō)明其在脅迫前期表現(xiàn)出積極應(yīng)對(duì)，而后期滲透調(diào)節(jié)能力明顯減弱，說(shuō)明在脅迫處理期間轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性強(qiáng)于野生型煙草。

綜上所述，15 d的控水對(duì)野生型煙草已構(gòu)成脅迫，而轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較好的抗旱性，且在復(fù)水3 d后能基本恢復(fù)到處理前的水平，表現(xiàn)出良好的恢復(fù)能力。在脅迫過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因煙草的各項(xiàng)指標(biāo)都明顯優(yōu)于野生型煙草，由此證明，外源endprint